Руководство по капиллярному электрофорезу. Руководство по капиллярному электрофорезу Москва 1996 год 1
 Скачать 1.48 Mb.
|
|
Рис. 57. Разделение белков при рН 11.5 в немодифицированном капилляре. Буфер: 100 мМ борат, рН 11.5; пробы: 1 - DMF, 2 -РНК крупного рогатого скота, 3 - миоглобин кита, 4 - миог-лобин лошади, 5 - кональбумин, 6 - j3 - лактоглобулин, 7 -бычий сывороточный альбумин (БСА), 8 - ферритин, 9 - а-амилоглюкозидаза. В кислой области рН (рН<2) адсорбция белков также может уменьшаться вследствие протонирования силанольных групп и устранения тем самым отрицательного заряда поверхности. В данном случае проблемы представляют очень малый ЭОП и возможная денатурация белков. Использование крайних значений рН для анализа биополимеров ограничивает селективность системы, поскольку разница в зарядах анализируемых веществ заметно уменьшается. Кроме того, выгодно иметь в качестве свободно изменяемого параметра значение рН. Скорость движения заряженных проб в КЗЭ определяется степенью их ионизации, которую можно легко регулировать величинами рН. Наилучших результатов можно достичь, выбирая высокие 67 концентрации буфера и область рН чуть ниже 3. На рис. 58 представлены некоторые тестовые буферы для разделения основных белков. Повышение рН от 2.4 до 4.7 при концентрации буфера 25 мМ приводит к явному уменьшению интенсивности пика, в то время как при повышении концентрации свыше 50 мМ (рН 4.3) до 100 мМ (рН 4.2) наблюдается заметное увеличение интенсивности пика. И для этих буферов с высокой концентрацией можно улучшить проявления пика уменьшением значения рН до 2.9. Однако в данном случае, вследствие крайне высокой подвижности протонов (кислые значения рН), резко увеличивается ЭОП. Поэтому дальнейшая оптимизация в сторону более кислых значений рН удается только с одновременным разбавлением разделяющего буфера, которое вызывает уменьшение интенсивности пика, Кроме того, работа в очень кислой области ( рН 2.3) приводит к уменьшению селективности. Этот способ оптимизации разделения стандартных белков показан на рис. 58. 9.1.2. Добавление солей к буферу В основе взаимодействия белков со стенкой лежит в основном механизм катионного обмена. Это возможно, поскольку и в случае отрицательного полного заряда молекулы (особенно при основных рН) всегда имеются в наличии катионные группы, например аргинин-радикалы в цепочках полипептидов. Поэтому путем добавления солей щелочных металлов (например сульфата калия) к буферу, как и в случае ионообменной хроматографии, достигается конкуренция кулоновскому притяжению и вызванное этим притяжением взаимодействие белок - стенка явно уменьшается. Следуя этой концепции, можно для стандартных белков в широкой области pI (pI 5-11) достичь эффективности 50000-100000 тарелок на метр. И в этом случае недостатком является сравнительно высокая электропроводность буфера (эффективное охлаждение!) которая вынуждает использовать поля низкого напряжения (5 кВ) и длинные капилляры с маленьким внутренним диаметром (25 мкм). Кроме того, большие ионные силы уменьшают как ЭОП, так и ξ -потенциал пробы, что вместе с вышеназванными факторами приводит к длительным временам анализа. В качестве буферных веществ могут служить также цвиттерионные молекулы (внутренние соли), которые обладают большой буферной емкостью, но не вносят значительного вклада в общую электропроводность системы. Цвиттерионы могут образовывать ассоциаты с белками и поверхностью капилляра и, тем самым, уменьшать адсорбцию белков. За счет применения аминосульфоната, аминосульфата и, в последнее время, фосфонийсульфоната в очень высоких концентрациях в качестве добавок к фосфатному буферу в нейтральных условиях можно разделять как основные, так и кислые белки. 9.1.3. Добавка органического модификатора к буферу Недостаток заключается в возможной денатурации белка. 9.1.4. Применение буферных добавок для разделения белков (динамическое наполнение капилляров) Простейший метод модифицирования поверхности кварцевого капилляра состоит в добавлении к буферному раствору такого компонента, который предпочтительнее адсорбируется на поверхностных силанольных группах. Формирование такого адсорбционного слоя дополнительно влияет на ЭОП и уменьшает адсорбцию вследствие гидрофобного или электростатического отталкивания. Разделяющие сис- темы, применяемые в основном для разделения белков в немодифицированных капиллярах, приведены в таблице 22. Добавка ПАВ ведет, прежде всего, к увеличению эффективности разделения белков. При этом взаимодействия между молекулами различных ПАВ и пробами могут быть очень различными. С одной стороны, можно конечно обсуждать, вопрос адсорбции детергентов на биомолекулах. Следствием этого является улучшение растворимости и увеличение гидрофильного характера пробы. Наряду с этим, большую роль играет также адсорбция ПАВ на стенках капилляров. Это приводит как к увеличению 68 гидрофильности поверхности, так, и к возможной блокировке адсорбционных центров. При использовании катионных детергентов, например, ЦТАБ, формируется двойной электрический слой, в котором положительные заряды направлены внутрь капилляра. Тем самым достигается обращение ЭОП. Вследствие того, что поверхность заряжена положительно, адсорбция катионных белков тормозится электростатическим от- талкиванием от стенки. При этом в случае основных белков достигается большое число ступеней разделения и симметричность пиков. Вообще следует обращать внимание на то, чтобы добавленным детергентом не превысить критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ). Рис. 58. Разделение стандартных белков в различных буферных сис- темах. Условия: прибор самодельный с быстросканирую-щим детектором, капилляр 50 мкм, 37/44 см, поле: 341 В/см; ввод пробы гидродинамический, 15 см, 2с; детектирование 214 нм; буфер фосфатный; проба: цитохром С, лизоцим, ри-бонуклеаза А. Таблица 22. Разделение белков с помощью буферных добавок в немодисрицированных капиллярах. Буфер С (мМ) РН Pi N .(10 3 /м) Трицин/КС! 10/20 8.3 5-7 500 СНЕ8/Кг304/ЭДТА 100/250/1 9.0 5-11 100 Фосфат/бетаин/Кг804 40/2000/100 6.7 9-11 300 Фосфат/Sulton 100/1000 7.0 5-11 300 1,3-диаминопропаи/К2304 40/20 3.5 9- 11 300 Фосфат/BRU 35 10/Юррт 7.0 3-11 100 Фосфат/FC 134 50/100 ррт 7.0 7-11 300 Борат/ДДСН 100/0.5 % 10.0 4-6 - 69 Рис. 59. Катионные ПАВ. Неионные ПАВ, например BRIJ 35, также могут быть использованы для уменьшения взаимодействия белок-стенка. Для еще большего увеличения адсорбции этих детерегенов на поверхности капилляра и полного подавления ионных взаимодействий с силанольными группами, стенка обрабатывается дополнительно условно "толстым" покрытием С 18. Принципиально должна существовать также возможность использования в КЗЭ испытанного в классическом электрофорезе и в жидкостной хроматографии анионного ПАВ ДДСН. Однако в систематических исследованиях кислых белков оказывается, что добавка ДДСН в количествах от ррт до одного процента к пробе и к буферу приводит к очень неопределенным результатам. В общем случае не улучшается ни эффективность, ни селективность, а даже наблюдается некоторое ухудшение этих характеристик. Возможным объяснением этого может быть хорошо известное действие денатурации, оказываемое ДДСН на белок. Наряду с этим, в наблюдаемой потере селективности большую роль играет, конечно, адсорбция ПАВ на биомолекулах и связанное с этим появление заряда пробы. Первоначальная структура заряда белков может полностью исчезнуть или перекрываться этим эффектом, так что разделение в электрическом поле произойдет только лишь по адсорбированным зарядам детергентов. Этот эффект был использован в ДДСН-ПААГ-электрофорезе для определения ММ белков. Этот же способ может быть реализован в капилляре и позже будет описан в главе "Капиллярный гелевый электрофорез". Резюмируя, можно отметить, что в случае добавок детергентов для разделения белков в КЭ многообещающим представляется использование в качестве динамических покрытий в основном неионных ПАВ, т. к. они лишь незначительно изменяют структуру заряда пробы. Конечно, этот метод включает совместное действие химического мо- дифицирования поверхности и динамического покрытия, в результате чего преимущества доступности и простоты применения буферных добавок в конце концов теряются. Неблагоприятную адсорбцию белков на поверхности капилляра можно уменьшить также добавками низших полиаминов, например, 1,3-ДАП. При этом получают высокую эффективность, однако из-за большой собственной электропроводности буфера следует использовать электрические поля низкой напряженности. Действие буферных добавок, вероятно, частично объясняется необратимой адсорбцией на стенках капилляра. Поэтому одновременно со снижением адсорбции пробы происходит резкое уменьшение электроосмоса. В качестве примера на рис. 60 показано разделение стандартных белков. 9.2. Использование капилляров с модифицированной поверхностью ЭОП можно регулировать также с помощью химического модифицирования поверхности капилляра. Одновременно с этим могут уменьшаться возможная адсорбция компонентов пробы на поверхности капилляра и улучшаться воспроизводимость анализов. Для химического покрытия капилляров можно использовать различные способы. Химически модифицированные капилляры коммерчески доступны. Рис. 60. Разделение стандартных белков в буферной системе ДАП. Условия: капилляр 75 мкм, 37/44 см, поле: 272 В/см; детектирование: 214 нм, фосфатный буфер со 100 мМ ДАП, рН 3.0; проба: цитохром С, лизоцим, рибонуклеаза А. 70 9.2.1. Типы покрытий поверхности в КЭ Принципиально различаются два метода нанесения слоев на поверхность. Сначала использовали метод традиционной химии силанов, при котором моно-, ди-, или трисиланы присоединяются к силанольным группам на стенках капилляров с образованием силоксановых связей. Функциональные группы, введенные сначала поверх силанов, можно использовать еще и на второй стадии для окончательного модифицирования поверхности. Перечень описанных к настоящему времени в литературе т. н. общепринятых типов покрытий, приведен в таблице 23. Основным ограничением метода является недостаточная стабильность силоксановых связей по отношению к гидролизу в щелочных условиях. Этот метод достаточно хорошо известен в жидкостной хроматографии. Недостаток этого метода можно обойти, применяя способы покрытия стенок капилляра полимерами, которые представляют собой вторую большую группу используемых покрытий. Здесь опять различают два способа: - поверхность предварительно обрабатывается классическим способом химии силанов и при этом на нее наносятся т.н. якорные группы, на второй стадии они могут сополимеризоваться с соответствующими мономерами или олигомерами; - на соответствующий носитель адсорбируется первичный полимер, который затем сополимеризуется in situ и поперечно связывается в сетку. Таблица 23 . Методы покрытия капилляров в разделении белков. Обычные покрытия Функциональные группы Область рН Применение Триметилсилил- 7 Маленькие молекулы Триметилсилил- 9 МЭКХ Обращенная фаза С8 9 Белки Обращенная фаза С 18 9 Белки Полиэтиленгликоль- от 3 до 5 -"- Диол- от 3 до 5 -"- Глицеро-глицид-оксипропил- 5 .". Мальтоза от З до 7 .". Арилпентафтор- 7 .". Альфа-лактальбумин 8 к Поверхности с нанесенными слоями полимеров проявляют более высокую рН- стабильность в щелочах при рН около 9. Недостаток покрытия полимерами заключается в сильной гидрофобности (адсорбция белков!), так что такого рода фазы часто используются в присутствии неионных или внутреннеионных детергентов. Сопоставление применяемых до настоящего времени полимерных покрытий приведено в таблице 24. Таблица 24. Методы покрытия капилляров в разделении белков Полимерные покрытия Функциональные группы Область рН Применение Линейный полиакриламид от 2 до 8 Белки (до10*) ИЭФ Полиэтиленимин от 3 до 11 Белки 1 -винил-2-пирролидин от 2 до 6 Белки Поли(метилглутамат) 7 Белки Полиметилсилоксан (OV1) 7 МЭКХ 71 Полиэтиленгликоль 7 МЭКХ Полисилоксан/бетациклодекстрин 7 Хиральное разделение *) указанная в литературе область стабильности или наивысшее используемое в опытах значение рН. 9.2.2. Изготовление химически модифицированных капилляров 9.2.2.1. Предварительная обработка кварцевых капилляров На основании многолетнего опыта изготовления кварцевых капилляров с покрытием для ГХ известно, что перед собственно химическим модифицированием очень полезно провести предварительную обработку материала. Капилляры, применяемые в КЭ, обычно изготавливаются либо из "некондиционных" трубок, применяемых в ГХ, либо из отходов производства световодов. Поэтому качество материалов различных трубок относительно их шероховатости и загрязнения адсорбированными ионами металлов очень различается. Большинство описанных в литературе методов заключаются в обработке капилляров щелочами или кислотами для улучшения смачиваемости поверхности. Кроме этого, поверхность также химически истощается, и образуются новые силанольные группы. Это выгодно, поскольку дополнительно образуемые SiOH-группы играют роль центров связи с покрытием и тем самым помогают улучшению химического обмена со стенкой капилляра. Эта стадия заканчивается обычно нейтральной промывкой в дистиллированной воде и сушкой в потоке газа при повышенных температурах (80-200 °С). Не все авторы указывают на необходимость предварительной обработки для успешного покрытия капилляров. 9.2.2.2. Методы покрытия В ГХ известны два основных метода модифицирования поверхности капилляров. Первый метод - это т.н. "метод динамического покрытия". В этом случае порция жидкости, состоящая из раствора стационарной фазы, пропускается через капилляр с помощью газового потока. Важными условиями при этом являются смачиваемость стенок растворителем, малый поверхностный заряд раствора и, прежде всего, отсутствие пыли. В качестве растворителя применяют в основном дихлорметан и пемтан. Гомогенность и толщина полученного покрытия определяются в первую очередь концентрацией раствора. Полуэмпирическая оценка толщины пленки di может быть проведена по следующему уравнению: di = Сr/200 ( η U/ σ ) 1 ' 2 , где С - концентрация в об.%, г - радиус, U - линейная скорость, η -вязкость, σ - поверхностное натяжение. Для 10% раствора в области реализируемых скоростей достигается толщина пленки от 0.2 до 1 мкм. Процесс покрытия заканчивается сушкой в инертной атмосфере и, при необходимости, полимеризацией или поперечным сшиванием. При статическом методе капилляр также заполняется разбавленным раствором стационарной фазы. После запаивания одного конца капилляра пары растворителя пропускаются через другой конец при нагревании и/или под давлением. Этот метод предъявляет существенно более высокие требования к аппаратуре и методике. Предпо- сылкой гомогенного покрытия являются, в частности, постоянная температура и тщательное дегазирование. Несмотря на то, что оба метода очень надежны в ГХ, до настоящего времени в КЭ они применяются довольно редко. Большинство авторов ограничиваются тем, что, как в ЖХ, наносят силаны за счет выдерживания в растворе и нагревания. Тем самым, коммерчески доступные капилляры обладают худшей стабильностью и воспроизводимостью покрытия. Кроме того, при этом теряется важная информация о модифицированной поверхности (толщина пленки и др.). 72 9.2.3. Характеристики заполненных капилляров в КЭ В ГХ и ЖХ стандартная фаза характеризуется с применением многочисленных стандартных тестов и тестовых смесей. Кроме того, в ЖХ существуют многочисленные независимые физико-химические методы, например, элементный СНN-анализ, ИК- фурье-спектроскопия или ЯМР, способные дать информацию о модифицировании поверхности. Использование в КЭ трубок небольшой длины (<1 м) с крайне малым внутренним диаметром (<100 мкм) и, как следствие, малой внутренней поверхностью (<1 см 2 ) делают невозможным применение инструментальных физико-химических методов. Исходя из этого, в качестве характеристики покрытия капилляров используется изменение ЭОП, вызванное покрытием. Вследствие того, что в большинстве случаев покрытия делаются для подавления взаимодействия белок-стенка, естественно, что в качестве меры качества модифицирования поверхности может служить разделение стандартных смесей белков. Характеристики неполярных или гидрофобных покрытий можно получить с помощью газохроматографических измерений. Для определения толщины пленки исследуются времена удерживания н-нонана как стандартного вещества. Для характеристики оставшихся силанольных групп служат времена удерживания различных полярных веществ. 9.3. Обзор важнейших химических покрытий 9.3.1. Общепринятые покрытия 9.3.1.1. Алкил-силановые покрытия Изготовление. Применение и реакционная способность моно-, ди- и трифункциональных алкилсиланов уже давно известны в ГХ и ВЭЖХ, поэтому здесь подробно на этом останавливаться не будем. Получаемая в результате поверхность имеет более или менее гидрофобный характер ("обращенная фаза"), в зависимости от длин цепочек нанесенных алифатаческих остатков. Благодаря слабой реакционной способности алкокси-силанов их можно наносить из водных растворов. Электроосмос. При добавлении поверхностных силанольных групп с нейтральными (незаряженными) алкилсиланами ЭОП уменьшается. На рис. 61 представлены зависимости электроосмоса от значения рН буфера для кварцевого капилляра, покрытого С8 и С18, по сравнению с исходным капилляром. Видно, что поток уменьшается примерно на 40% от исходного значения, и в этом случае трудно определить точку перелома. Меньший поток в 08-капилляре вероятно объясняется лучшим покрытием поверхности, т.к. "щетка" С8 предъявляет меньше стерических требований, чем С18. Рис. 61. ЭОП/рН- характеристшси различных покрытий (типов "щетки"). Стабильность. Из применения в хроматографии известно, что алкилсилановые покрытия стабильны по отношению к гидролизу только при рН 7. На рис. 62 показано изменение времени миграции некоего нейтрального маркера в течение 80 опытов при рН 7 для названных выше капилляров. Модифицированные капилляры показывают 73 явный спад времени движения в течение первых 20 опытов. Возможные объяснения этого заключаются либо в потере несвязанного материала, либо в частичном гидролизе алкильной "щетки" на поверхности. После этого состояние капилляра, покрытого по крайней мере С8, стабилизируется. Применимость. В капиллярах с покрытиями С8 и С18 может быть проведено разделение белков. Однако покрытия алкилсиланами имеют два больших недостатка: с одной стороны - гидрофобный характер алкильной "щетки", с другой стороны - неполное экранирование поверхностных силамольмых групп, которые все еще взаимодействуют с белками. Рис. 62. Стабильность покрытий (типы "щетки"), литература Supelco. 9.3.1.2. Арилпентафторидные покрытия Изготовление. Синтез проводится по описанным стандартным методам с применением двухстадийной реакции: после обработки стенки гамма- аминопропилтриметоксисиланом нанесенные аминогруппы обмениваются с пентафторобензоилхлоридом в сухом толуоле. Электроосмос. Особенность арилпентафторидного (АПФ) покрытия заключается в том, что, в отличие от многих других покрытий, при нейтральном рН и средних ионных силах появляется отчетливый ЭОП (0.5 мм/с). Применимость. Как показывают специальные хроматографические опыты, АПФ- покрытия также относятся к гидрофобным. Поэтому АПФ-капилляры можно с успехом использовать при рН 7 для разделения белков. Для тестовых смесей с белками, которые перекрывали область рН от 6.9 до 11, получали эффективность в многие сотни тысяч теоретических тарелок на метр (рис. 63). Благодаря вкладу электроосмоса в условиях проводимого анализа можно разделять как катионные, так и анионные белки за один проход. Рис. 63. Структура АПФ- покрытия. Пример разделения белков: (А) с помощью покрытия АПФ; (В) - в капилляре из плавленного кварца; буфер - 200 мМ КС], рН 7; пробы: L - лизоцим, D - ДМСО, R - РНК крупного рогатого скота, Т - трипсино- ген, WM - миоглобин кита, НМ - миоглобин лошади, НСА-В - карбоксиангидраза В человека, ВСА-В - карбоксиангид-раза крупного рогатого скота. 74 9.3.1.3. Гидрофильные гидрокоил- и полиэфирные покрытия Изготовление. В ЖХ для разделения белков в основном используются гидрофильные фазы, например, с диол-полиэтиленгликолем (ДПЭГ) или полисахаридами. Кварцевые капилляры также можно модифицировать этими функциональными группами. В данном случае для синтеза используются двухступенчатые реакции, на первой стадии которых применяют, например, глицидсилан. Он может впоследствии либо гидролизоваться диолом, либо соединиться с глицерином или полиэтиленгликолем (рис. 64). Нанесение углеводородов происходит на первой стадии с помощью аминофункци-ональных групп, с которыми впоследствии можно связать мальтозу с использованием, например, циано-боргидридного катализа. |