Руководство по капиллярному электрофорезу. Руководство по капиллярному электрофорезу Москва 1996 год 1
 Скачать 1.48 Mb.
|
|
Рис. 103. Зависимость подвижности биоподимеров от их конформации в разделяющем геле (см. также рис. 100). 13. Изоэлектрическая фокусировка (ИЭФ) в капиллярах В классической форме электрофореза ИЭФ представляет собой разработанный способ разделения с высокой эффективностью. В основном он применяется для 106 цвиттерионов и амфотерных проб, таких как белки и пептиды, которые различаются не по своей подвижности, а по изоэлектрическим точкам (значениям pi). Изоэлектрическая точка представляет собой специфическую величину для амфотерных веществ и показывает, при каком значении рН это вещество перестает двигаться в электрическом поле и внешне выглядит как электрически нейтральное. Таким образом, ИЭФ можно применять также для определения изоэлектрической точки белков и других амфотерных веществ. Сначала необходимо вдоль участка разделения с помощью цвит-терионных соединений, так называемых амфолитов, создать градиент значений рН. В качестве амфолитов применяют смесь различных полиамино-поликарбокси-кислот, различающихся по своим значениям Pi. Под влиянием сильной кислоты в анодном и сильной щелочи в катодном пространствах эти амфолиты при наложении напряжения располагаются согласно своим значениям р! вдоль участка разделения и, тем самым, создают градиент рН (см. рис. 104). Этот градиент в случае классического электрофореза на плоской подложке стабилизируется с помощью геля для удаления конвекционных потоков. Белки движутся под действием градиента рН до тех пор, пока сохраняют заряд. При значении рН, соответствующем их изоэлектрической точке, электрофоретическая миграций заканчивается. Высокая эффективность ИЭФ основывается на фокусирующем свойстве градиента рН, который практически не допускает уширемия полос, вызванного диффузией. Амфолиты можно или добавлять к буферу, или ковалем-то связывать с гелем (иммобилизованный градиент рН (ИГП)). Этот вариант ИЭФ вследствие очень крутого градиента рН ведет к очень высокой разделительной способности. Чем меньше различия в значениях р! пробы, тем более резкие градиенты рН необходимо накладывать для того, чтобы обеспечить разделение этих проб. При переносе ИЭФ на узкие капилляры применение стабилизирующих гелей не является безусловно необходимым. Правда, ЭОП необходимо полностью подавить для того, чтобы сделать возможным образование градиента рН, иначе ЭОП быстро вынесет раствор амфолита из капилляра и сделает невозможным проведение фокусировки. Управлять ЭОП можно, как уже отмечалось в одной из глав, модифицируя поверхность капилляра. Понижать ЭОП для проведения фокусировки можно также, добавляя высоковязкие полимеры, например, метилцеллюлозу, для повышения вязкости буферного раствора. Преимущество последнего способа заключается в том, что зачастую для ИЭФ необходимо применять очень высокие значения рН, а ковалентное покрытие капилляра не может долго выдерживать сильнощелочные значения рН. В отличие от ИЭФ на плоской подложке в капилляре образование градиента рН и фокусировка белков протекают в одну стадию. Капилляр заполняют раствором амфолита, уже содержащим пробы, и катодный конец капилляра погружают в разбавленный раствор едкого натра, а анодный конец - в разбавленный раствор фосфорной кислоты. При наложении напряжения сначала протекает большой поток, по- скольку амфолиты еще движутся до своей изоэлектрической точки и, тем самым, вносят вклад в общий поток. Окончание фокусировки выражается падением потока до постоянной небольшой величины. После того, как пробы сфокусированы и разделены в капилляре, они должны пройти через детектор. Это достигается в общем случае заменой катодного электролита (сильного основания) на сильно кислотный раствор или заменой анодного электролита (сильной кислоты) на сильное основание. При этом проводящееся титрование разрушает градиент рН, отчего белки расфокусировываются, и оказывается возможным транспорт белков к детектору. Другая возможность мобилизации белков состоит в том, что в капилляре они приводятся в движение по направлению к детектору путем наложения разности давлений (давление или разрежение). При этом, однако, напряжение должно оставаться включенным, чтобы противодействовать уширению полос в процессе детектирования. Поскольку фокусировка происходит во всем капилляре, т.е. в том числе и между ячейкой детектора и катодом, белки с крайне высокими значениями р1 могут уклоняться от де- тектирования. Этого можно избежать, заполняя капилляр едким натром вплоть до места детектирования. 107 Рис. 104. Принцип ИЭФ:а) наложение градиента рН; Ь) ввод пробы; с) установление равновесия (устойчивое состояние); d) зависимость силы поля (сплошная линия) и значения рН (штрихи) от расстояния на участке разделения. В качестве примера возможности ИЭФ в капиллярах представлены на рис. 105. Модифицирование стенок капилляра динамическим или ковален-тным способом допустимо также и в случае ИЭФ, поскольку здесь, как и в необработанном капилляре, белки сильно адсорбируются на стенках капилляра. Рис. 105. Разделение 7 белков вследствие различия их изоэлектрическнх точек. 108 14. Изотахофорез (ИТФ) Если описанные до сих пор электрофорвтические способы разделения в капиллярах соответствовали элюентной хроматографии (прерывистый ввод проб, постоянный состав элюента, различные скорости движения компонентов пробы), то метод ИТФ соответствует вы-теснительной хроматографии. В обоих случаях все компоненты пробы движутся с одинаковой скоростью. ИТФ описан много лет назад и проводился тогда в основном в тефлоновых трубках. Однако из-за проблем выбора конкретных электролитов и ограничений в выборе детекторов (применимы только детекторы по электропроводности) этот метод было невозможно использовать в качестве точного аналитического метода. В случае ИТФ проба вводится между двумя электролитами с различными подвижностями ионов, выбранными так, чтобы они ограничивали подвижности компонентов пробы. Обычно ведущий электролит обладает наивысшей, а конечный электролит -наиболее низкой подвижностью из всех движущихся ионов. После достижения стационарного состояния все одинаково заряженные ионы движутся с одинаковыми скоростями. На рис. 106 это показано схематически. В каждой зоне при ИТФ имеется своя напряженность поля. Внутри каждой зоны напряженность поля постоянна, изменения происходят скачком на границах зон. По этой причине методом ИТФ разделяли только анионы или катионы. Концентрационный ход в зонах описывается прямоугольной функцией: зоны следуют, как в вытеснительной хроматографии, непосредственно одна за другой. Применяя детектор по электропроводности, получают ступенчатый сигнал. ИТФ преимущественно применяют для разделения неорганических ионов и органических карбоновых кислот. Из-за проблем детектирования и трудностей, связанных с нахождением подходящих электролитов, для проб неизвестного состава метод ИТФ неприменим. В частности, подходящие носители, т.е. электролиты, необходимы для белков и других сложных смесей, причем для того, чтобы разделять зоны друг от друга, носители должны обладать скоростью, промежуточной между скоростями движения проб. Из-за необходимости поиска подходящих носителей в анализе белков метод ИТФ едва ли найдет широкое применение в биоаналитике. ИТФ, как вытеснительная хро-матография, способен концентрировать разбавленные пробы, поэтому он может быть использован на стадии предварительного концентри-рования перед разделением методом КЭ. Этим разрешаются проблемы, связанные с дозировкой относительно больших объемов разбавленных проб. Рис. 106. Схема ИТФ. 109 Стадия обогащения (концентрирования) может проводиться непосредственно в разделительном капилляре КЭ. В капилляр, заполненный разделяющим электролитом, вводится короткая зона несущего элетролита, вслед за которой вводится проба. При этом могут дозироваться объемы пробы порядка микролитров. Обогащение проходит в направлении несущего электролита, при этом возможно концентрирование в 100 раз. В случав белков схожий эффект дает добавка •ацетата аммония к раствору пробы. Ион ацетата в данном случае дей-;. ствует как несущий электролит. Описано также сочетание двух аппаратов с двумя УФ-детекторами, ИТФ для концентрирования и КЭ для разделения. Когда сконцентрированная ИТФ-зона достигает первого детектора, система разделения КЭ переключается. 15. Эпектрохроматография (ЭХ) Основной вклад в уширение полос в ВЭЖХ дают параболический профиль скоростей и диффузия в порах стационарной фазы. Одной из возможностей уменьшения этого вклада в уширение полос является уменьшение диаметра частиц, однако при этом возрастает перепад давления. В идеальном случае ЭОП в наполненном капилляре не зависит от размера частиц наполнителя. Кроме того, поршнеобразная форма профиля скоростей ЭОП способствует высокой разделительной способности. Поэтому пытаются соединить высокую селективность заполненной разделительной колонки ВЭЖХ с "остротой" разделения, свойственной КЭ. В данном случае основополагающие принципы разделения и стационарные фазы те же, что в ВЭЖХ, однако транспорт элюентов (водно-органических буферных растворов) и компонентов пробы обеспечивается миграцией под действием электрического поля. Для уменьшения вклада сорбционных процессов в уширение полос применяют очень маленькие непористые частицы (1 мкм). Следует отметить, что до настоящего времени в литературе нет реальных примеров применения, а есть только теоретические работы. Многообещающие теоретические предсказания до сих пор не подтверждены экспериментально. Получаемые малые ВЭТТ лишь незначительно отличаются от полученных в ВЭЖХ. Одной из причин этого может быть проблема детектирования. В КЭ детектируют с помощью разделяющего капилляра, в наполненной колонке это уже невозможно. Таким образом, дополнительно возникают известные в микро-ВЭЖХ проблемы, связанные с подключением детектора к раз- деляющему капилляру. Рис. 107. Разделение с помощью ЭХ в капилляре, наполненном обращенной фазой. Последовательность элюирования: тио-мочевина, бензиловый спирт, бензальдегид, бензол, 1,2-дихлорбекзод, 1,2,3- трихлорбензол, 1,2,3,4- тетрахлорбензод, пентахлорбензол, гексахлорбензол. Условия разделения: длина капилляра 28.5 см, 50 мкм, наполнитель - Hypersil ODS (Змкм), ввод пробы: 2.5 кВ в течение 5 с, наложенное поле 45 кВ (2 мкА), детектирование при 220 нм, подвижная фаза - 2 мМ динатрийтетраборат, 80% апетонитрил, рН 8.7. 110 16. Перспективы В таблице 31 представлены описанные разделительные системы, применение которых основано на миграции, обусловленной электрическим полем. Наиболее часто применяемой системой является, конечно, КЭ в кварцевых капиллярах (открытых трубках) с незаполненными или поверхностно-модифицированными стенками капилляpa. Нейтральные молекулы также могут быть разделены в этих системах с помощью добавок мицеллообразователей. По сравнению с классическим электрофорезом КЭ имеет следующие преимущества: - очень высокая эффективность разделения; - простое детектирование в режиме реального времени и возможность количественного анализа; - простота хранения; - короткие времена анализов; - возможность автоматизации; - небольшой расход реактивов. По сравнению с ВЭЖХ преимущества заключаются в следующем: - высокая эффективность разделения; - быстрое установление равновесия при изменении условий анализов. Недостатки КЭ заключаются в следующем: - детектирование УФ-детекторами с низкой чувствительностью к изменению концентрации; - относительно плохая воспроизводимость и сложность управления ЭОП; - адсорбция анализируемых веществ на стенках капилляра, приводящая к потере эффективности. В настоящее время коммерчески доступны приборы, некоторые из них - второго поколения, позволяющие проводить рутинные измерения, Это отражается также на характере публикаций • число работ, ориентированных на практику, перекрывает число чисто методических или теоретических работ. В 1990 году в обзоре по аналитической химии под рубрикой "Капиллярный электрофорез" приведены только 225 работ, из которых более половины относились к 1988/89 годам, а в обзоре за 1990/91 годы приведены уже 523 публикации. Появились также первые монографии и обзорные работы. Рекомендуемые книги: J.Vindevogel, P.Sandra, Introduction to MEKC, in: Chromatographic Methods, Hutig Verlag, Heidelberg 1992 Editor: NAGuzman, Capillary electrophoresis technology, in Chromatographic science series, Volume 64, M.Dekker, Inc., New York-Basel-Hong Kong 1993 S.F.Y. Li, Capillary electrophoresis, in J. Chromatogr. Library, Vol.52, Elsevier, Amsterdam 1992 P.Jandik, G.Bonn, Capillary electrophoresis of small molecules and ions, VCN-Verlag, Weinheim 1993 R.Kuhn, S.Hofstetter-Kuhn, Capillary electrophoresis, principle and practice Springer Verlag, Berlin Heidelberg 1993 D.N.Heiger, High performance, capillary electrophoresis, Hewlett-Packard GmbH, Waldbronn Analytical Division, Germany 1992 Обзорные статьи W.G.Kuhr, Anal. Chem. 1990, 63,403R-414R W.G.Kuhr, Anal. Chem. 1992, 64, 389R-407R H.Engelhardt, W.Beck, J.Kohr, T.Schmitt, Angew. Chem. 1993, 105,659-680. 111 Список сокращений, часто встречающихся в тексте: ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭТТ - высота эквивалентной теоретической тарелки ГХ - газовая хроматография ДДСН - додецилсульфат натрия ИОХ - ионообменная хроматография ИТФ -изотахофорез ИЭФ - изоэлектрическая фокусировка КГЭ - капиллярный гелевый электрофорез КЗЭ -капиллярный зонный электрофорез ККМ - критическая концентрация мицеллообразования КЭ - капиллярный электрофорез ЛПА - линейный полиакриламидный гель ММ - молекулярная масса МЭКХ - мицеллярная электрокинетическая хроматография ОСО - относительное среднеквадратичное отклонение ПААГ-электрофорез - полиакриламидный гель-электрофорез ПАВ - поверхностно-активное вещество ПВП -поливинилпирролидон ПЭГ - полиэтиленгликоль ПЭИ - полиэтиленимин СКФХ - сверхкритическая флюидная хроматография Трис - трис(гидроксиметиламинометан) ФМОК - флуоренилметилоксикарбонил ХГВ - хроматография гидрофобного взаимодействия ЦД - циклодекстрим ЦТАБ - цетилтриметиламмонийбромид ЭОП - электроосмотический поток ЭХ - электрохроматография |