Учебнометодический комплекс по учебной дисциплине иммобилизованные клетки и ферменты для специальностей
 Скачать 1.14 Mb.
|
|
Глава 2. МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ Методы иммобилизации часто рассматриваются с точки зрения при- родных сил, удерживающих препарат в зоне носителя. В этом случае ме- тоды иммобилизации подразделяют на химические и физические. В первом случае препарат химически «пришивается» к носителю, что, в свою очередь, может осуществляться как на поверхности соответст- вующего нерастворимого материала, так и в объеме носителя. Во втором случае удержание препарата носителем осуществляется за счет физических факторов: адсорбционно, полупроницаемой мембраной, электрическим полем и т. д., в этом случае имеют ввиду иммобилизацию, при которой препарат не соединяется с носителем ковалентными связями. Другой принцип классификации методов основывается на следую- щих положениях: производится ли иммобилизация одновременно с обез- движиванием препарата и образованием матрицы носителя или же про- цесс иммобилизации происходит на заранее приготовленной нераствори- мой основе, на которой тем или иным способом закрепляют биологиче- ское действующее начало. В ряде случаев конкретный препарат (клетка) прикрепляется в реаль- ных условиях к нерастворимым материалам (например, древесина, почва, минералы и др.). В этом случае жизнедеятельность клетки в иммобилизо- ванном состоянии является для нее естественной, отличающейся от при- родной только искусственно поддерживаемыми в биотехнологическом процессе внешними параметрами (температура, давление, влажность и др.) и набором подаваемых клетке веществ. Иммобилизация препаратов (т. е. удерживание на носителе) может быть как необратимой, так и временной. Когда иммобилизуют растущую, интенсивно делящуюся культуру, часто наблюдается постепенный пере- ход из фазы носителя в окружающую среду, даже если исходная биомасса была фиксирована носителем необратимо. Но иногда оказывается удоб- ной обратимая фиксация. В этом случае, возможно, удалить отработавшие свой срок клетки и вновь иммобилизовать свежие. Такой подход к регене- рации биокатализаторов удается применять, например, в случае адсорб- ционных вариантов иммобилизации. 2.1. Методы физической иммобилизации Все методы физической иммобилизации (т. е. иммобилизации, при которой фермент не соединен с носителем ковалентными связями) раз- деляют на четыре группы: 26 1. Адсорбция на нерастворимых носителях (т. е. на поверхности но- сителя). 2. Включение в поры геля. 3. Иммобилизация в полимерных пленках (мембранах). 4. Включение в двухфазную реакционную среду, где препарат мо- жет находиться только в одной из фаз. Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из всех существующих способов. Еще в 1916 году Нельсон и Гриффин провели успешную иммобилизацию инвертазы путем адсорбции на активирован- ном угле и геле гидроксида алюминия. Адсорбционная иммобилизация клеток, в частности микроорганиз- мов основывается часто на способности многих из них прикрепляться к разнообразным твердым или гелеобразным носителям и продолжать жизнедеятельность в таком состоянии (микробные популяции почвы, кишечника, рубца, некоторые азотфиксирующие микроорганизмы расте- ний и т. д.). Поверхность клеток неоднородна, характеризуется мозаичной структурой – наличием гидрофильных и гидрофобных участков. Разно- образие свойств поверхности клеток и адсорбентов определяют различ- ные механизмы адсорбционного взаимодействия (ион – ионные взаимо- действия, ван-дер-ваальсовы силы и т. д.) Однако указанные подходы к классификации способов иммобили- зации оставляют в стороне проблему микроокружение препарата. Поэтому предлагается использовать следующую классификацию: 1. Иммобилизация на носителе или на поверхности носителя. В этом случае удерживающая поверхность или часть поверхности носителя «омывается» внешней средой (жидкой или газообразной). 2. Иммобилизация в носителе или в массе (объеме) носителя. Между внешней средой и препаратом в результате иммобилизации появляется слой материала носителя. В данном случае свойства носителя (например, пористость, заряд, гидрофильность) в значительной степени могут ска- зываться на функционировании иммобилизованного препарата и на уровне реализации потенциальных возможностей. 3. Следующий вариант называют иммобилизацией с использовани- ем мембранной технологии. Препарат и небольшая часть внешней среды помещены в замкнутый объем, отделенный от остальной среды избира- тельно проницаемой мембраной, размер пор, в которой таковы, что суб- страты и продукты через них проникают, а иммобилизованный препарат удерживается внутри замкнутого объема. 27 Иммобилизация на поверхности носителя. Для осуществления данного подхода к созданию иммобилизованных систем используются разные носители: непористые, ячеистые и др. При иммобилизации на носителе препарат может быть связан раз- личными силами: – адсорбционно неспецифически – взаимодействие базируется на не ковалентных контактах (ионные, гидрофобные, водородные и др.); – адсорбционно биоспецифически – носитель, содержащий аффин- ные лиганды, способен образовать достаточно прочные комплексы с по- верхностью препарата (в основе также лежат нековалентные взаимодей- ствия). – химически удерживающая матрица должна иметь особые группи- ровки, способные реагировать с компонентами препарата (этот случай можно рассматривать как хемосорбцию); либо для ковалентного связы- вания препарата с носителем необходим специальный сшивающий агент. К достоинствам адсорбционной иммобилизации относятся исклю- чительная простота методов ее проведения. По существу, иммобилиза- ция происходит при контакте водной суспензии биопрепаратов с адсор- бентом (исключение составляет иммобилизация с помощью электроад- сорбции). Способы разделяются на статические, с перемешиванием и путем нанесения на колонке рис. 2.1. носитель Суспензия препарата насос колонка в Суспен- зия носитель а б Рис.1. Способы адсорбционной иммобилизации: а – статический; б – с перемешиванием; в – нанесения в колонке 28 Статический способ наиболее прост и заключается в том, что носи- тель (адсорбент) вносят в суспензию биопрепарата и смесь некоторое время инкубируют. Иммобилизация достигается за счет осаждения кле- ток и последующей их адсорбции на частицах носителя. Недостатком способа является необходимость длительного контакта адсорбента с сус- пензией биопрепарата. Способ с перемешиванием обеспечивает более быстрое завершение процесса адсорбции и более равномерное заполнение носителя. Способ нанесения в колонке заключается в прокачивании суспензии с препаратом через колонку, заполненную носителем. Иногда для проведения адсорбционной иммобилизации применяют метод электроосаждения (электроадсорбция) (рис. 2.2). В этом случае в раствор препарата погружают два электрода, на по- верхность одного из которых помещают слой носителя. При пропуска- нии электрического тока молекулы фермента или клетки благодаря имеющимся на поверхности заряженным группам начинают переме- щаться в растворе в направлении электрода с носителем и осаждаются на поверхности последнего. Иммобилизация в массе носителя. Этот вариант один из самых распространенных, хотя его нельзя отнести к самым простым подходам. В данном варианте иммобилизации в качестве носителей применя- ются либо полимерный гель, либо полимерное волокно. Нерастворимые материалы, которые служат основой матриц подоб- ных носителей, могут быть как органическими веществами, так и неор- ганическими соединениями, как синтетическими производными, так и природными продуктами. Рис.2.2. Иммобилизация методом электроосаждения 29 Если говорить о природе сил, удерживающих препарат в объеме но- сителя, то и здесь может быть как обездвиживание за счет физических факторов (просто массой носителя, т. е. механически), так и фиксация с образованием ковалентных связей между компонентами препарата и ве- ществом матрицы (препарат «вшивается» в носитель) рис. 2.3. Широкое распространение метода обусловлено тем, что в этом ва- рианте достигается более высокая удельная концентрация иммобилизо- ванных препаратов в носителе. Это в свою очередь теоретически дает возможность поднять продуктивность биотехнологического процесса в целом. Еще одно важное преимущество иммобилизации в носителе по сравнению с иммобилизацией на носителе состоит в хороших эксплута- ционных свойствах получаемых препаратов. Препараты также лучше защищены от многих неблагоприятных факторов среды. Иммобилизация с использованием мембранной технологии. Суть метода – водный раствор препарата отделяется от водного рас- твора субстрата избирательно проницаемой мембраной. Существую- щие модификации этого метода различаются лишь способами получе- ния избирательно проницаемой мембраны и ее природой. Важным фактором является толщина мембраны – с ее уменьшением происходит повышение проявляемой иммобилизованными биокатализаторами ак- тивности, что определяется возможностью увеличения диффузии суб- страта к биокатализатору. Наиболее широкое распространение мембранные биокатализато- ры получили не в системах превращения веществ, а при создании чув- ствительных элементов биосенсоров. носитель препарат внешняя среда Рис.2.3. Иммобилизация в массе носителя 30 В мембранной технологии применяются следующие системы: пло- ские мембраны, пористые волокна и микрокапсулы. Плоские мембраны – легко пропускают молекулы субстрата, но представляют собой непреодолимый барьер для крупных молекул фер- мента или клеток (рис. 2.4). Пористые волокна – аналогично случаю плоских мембранных носи- телей, только здесь используются мембранные полые волокна. Фактиче- ски эти волокна представляют собой длинные тонкие трубки, стенки ко- торых выполнены из полимерной мембраны (рис. 2.5). По сравнению с плоскими мембранами отношение занимаемого препаратами объема к общему объему системы выше, поэтому и выше получаются удельные продуктивности. Среди волокнообразующих по- лимеров используются триацетат целлюлозы – дешевый и доступный но- ситель, а также волокна коагулята целлюлозы. Носитель из коагулята целлюлозы гидрофилен, обладает высокой механической прочностью, Рис. 2.4. Иммобилизация с использованием мембранной технологии Рис. 2.5. Иммобилизация в пористые волокна 31 его химическая и биологическая устойчивость определяется стабильно- стью самой целлюлозы. 2.2. Микрокапсулирование Суть метода в том, что водный раствор с биопрепаратом (фермент, клетка) включают внутрь микрокапсул, представляющих собой замкну- тые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (мембраной). В зависимости от условий получения размер микрокапсул изменяется от нескольких десятков до нескольких сотен микрометров. Для формирования микрокапсул с иммобилизованными препарата- ми существуют два основных подхода: диспергирование и (микро) гра- нулирование. В первом случае водная суспензия клеток диспергируется в несме- шивающуюся с ней органическую жидкость, а присутствующие в систе- ме специальные добавки образуют на поверхности капелек водной фазы мембранную пленку. Получаемые микрокапсулы имеют неодинаковые размеры – существует некоторое распределение величин их диаметров, зависящее от гидродинамических свойств применяемых жидкостей, ин- тенсивности перемешивания, соотношения объемов фаз, геометрии ра- бочего сосуда и конструкции мешалки. Во втором случае водная суспензия препарата через особое дози- рующее устройство (гранулятор) инъектируется порциями строго задан- ного объема в несмешивающуюся с водой органическую жидкость, где на границе раздела фаз поверхности водной капли происходит формиро- вание оболочки микрокапсулы. В этом случае получаются частицы прак- тически одинаковой величины. В принципе, микрокапсулирование отличается от включения в во- локна, главным образом, формой получаемых препаратов: при микро- капсулировании образуются сферические микрокапсулы, а при втором способе – нити. Технология микрокапсулирования в настоящее время находит очень широкое применение в самых разнообразных отраслях – от производства лекарств и пищевых добавок до изготовления красящего слоя печатаю- щих устройств или специальных антипиреновых присадок к полимер- ным композициям. Большие надежды связываются с практической реа- лизацией лазерного термоядерного синтеза, где используют шарики дей- терево-тритиевого топлива, включенные как раз в микрокапсулы. Опре- деленное развитие получили методы иммобилизации ферментов в поли- мерные микрокапсулы, а также довольно популярны эти приемы при 32 иммобилизации животных и растительных клеток; что касается микро- организмов, то таких работ еще мало. Наполнение микрокапсул (внутреннее содержимое) может быть га- зовым, жидким, студнеобразным и твердым. Весьма интересен прием совместного капсулирования клеток и эк- зогенных ферментов. Например, бактерии Gluconobacter oxydans, спо- собные окислять глюкозу в глюконовую кислоту, требуют для этого хо- рошего снабжения кислородом. Однако при капсулировании даже при обильной аэрации они проявляли низкую глюкозооксидазную актив- ность. При включении в полимер одновременно с клетками каталазы и добавлении в среду Н 2 О 2 (донор кислорода) количество образующейся глюконовой кислоты резко увеличилась. 2.3. Иммобилизация металлохелатным способом Для целей иммобилизации, как оказалось, можно использовать свойства ряда металлов образовывать хелатные комплексы. В этом слу- чае не требуется дополнительной модификации носителя, и иммобили- зация протекает быстро и в достаточно обычных условиях. Наиболее подходящими свойствами для иммобилизации обладают из переходных металлов титан и цирконий, оксиды которых не проявляют токсического действия. Этот метод иммобилизации разработан для ферментов на основе химии гидроксидов переходных металлов. В качестве носителя исполь- зуют собственно гидроксид металла, который можно получить осажде- нием при гидролизе соответствующего хлорида. Молекула фермента иммобилизуется при образовании хелатов. При некоторых приемах используется совместное осаждение гидро- ксидов металлов с ферментами. Такое осаждение может привести к по- лучению более активного продукта, чем при последующем добавлении фермента, так как поверхность частицы выпадающего в осадок гидро- ксида очень велика. Однако при этом необходимо учитывать возможную инактивацию фермента в результате инкубации при низких значениях рН. Чтобы получить более высокую ферментативную активность, нужно оптимизировать процесс иммобилизации относительно некоторых важ- ных условий: продолжительность иммобилизации, рН, соотношение ко- личества фермента и носителя. Металлохелатный метод иммобилизации ферментов впервые разработал Новеисв университете г. Бирменген (Ве- ликобритания) в опытах иммобилизации на целлюлозе с применением диазотирования. 33 Рассмотрим возможность переходных металлов образовывать хе- латные комплексы с биополимерами на примере титана и целлюлозы. В растворе хлорида титана определенная часть ионов титана образует ок- таэдрические координационные комплексы с другими молекулами и ио- нами, которые в данном случае выступают в роли лигандов комплексно- го иона (пример комплексного иона приведен нарис. 2.6. Гидроксильные группы являются эффективными лигандами для ионов переходных металлов, и, следовательно, можно ожидать, что ио- ны переходных металлов будут образовывать комплексы с полисахари- дами, гидроксильные группы которых будут замещать другие лиганды. Более того, хорошо известно, что гликоли – очень эффективные лиган- ды ионов переходных металлов. Некоторые полисахариды, такие как целлюлоза, содержат гидроксильные группы, не участвующие в образо- вании гликозидных связей между углеводными остатками, и, следова- тельно, способные образовывать хелаты с ионами переходных метал- лов, замещая своими гидроксильными группами два лиганда иона тита- на. Таким образом, поскольку целлюлоза представляет собой полимер молекул D-глюкопиранозы, связанных β-1,4-связью, в образовании хе- латов могут участвовать гидроксильные группы в положении 2 и 3. О возможности участия во взаимодействии целлюлозной цепи с титаном гидроксильной группы в положении 6 D-глюкопиранозного остатка можно лишь строить предположения. Стерически этой группе трудно приблизиться к другим гидроксильным группам целлюлозы и участво- вать в образовании хелата. Таким образом, обработанную хлоридом ти- тана целлюлозу можно рассматривать как полимерный хелат с аква-, хлораква- и хлор-комплексами титана, преобладающими в водном рас- творе хлорида титана (рис. 2.7). L L Ті L L L L 4 + [Ті(Н 2 О) 6 ] 4+ [Ті(Н 2 О) 5 Cl ] 3+ [Ті(Н 2 О)Cl 5 ] – [ТіCl 6 ] 2– Рис. 2.6. Пример комплексного иона 34 Следует отметить, что по стерическим соображениям все лиганды иона титана заместить гидроксильными группами полисахаридной цепи невозможно. Более того, оставшиеся лиганды не будут замещаться гид- роксильными группами соседней целлюлозной цепи из-за нерастворимо- сти и недостаточной подвижности макромолекулы целлюлозы. Любая же другая молекула, содержащая группы, способные замещать лиганды, может образовать хелат с титаном, связанным с целлюлозой. Такая мо- лекула должна находиться в водном растворе и рН раствора может быть близок к нейтральному. Образование связи между полимером (целлюлоза), обработанным металлом, и ферментом (с появлением ферментативно активного произ- водного) будет успешным лишь при выполнении следующих условий: – в молекуле фермента должны присутствовать группы, способные выступать в роли лигандов; – контакт этих групп с атомами металла стерически возможен; – эти группы не должны находиться в области активного центра фермента; – молекулы фермента, уже связанные с носителем, не должны рас- полагаться слишком близко друг к другу. Удельная активность получаемых препаратов на основе различных ферментов (глюкоамилаза, инвертаза, нуклеаза и др.) обычно довольно Рис. 2.7. Обработанная титаном целлюлоза, координационно связавшая вдоль своих цепей различные аква-, хлораква- и хлор-комплексы ионов титана, преобладающие в растворе О НО Ті ОН 2 О ОН 2 О НО Ті О О ОН 2 НО О Ті ОН 2 О ОН 2 Н 2 О НО Ті ОН 2 О НО Ті ОН 2 Н 2 О Н 2 О О НО О НО ОН Ті О Н 2 О Ті О Н 2 О Ті ОН ОН 2 О НО О углевод углевод углевод 35 высокая (50–80 %). В результате иммобилизации металлохелатным ме- тодом константа Михаэлиса фермента, как правило не меняется. Использование хлорида титана приводило к получению препарата иммобилизованного фермента с большей активностью, чем в его отсут- ствии. Метод весьма прост и состоит из следующих стадий: 1. Взвесить в чашке 10 г. микрокристаллической целлюлозы. 2. Добавить 50 мл 15 %-ного (вес/объем) хлорида титана (IV) к 15 %-ной (вес/объем) НСl и хорошо перемешать. 3. Поместить смесь в вакуумный эксикатор с гидроксидом натрия и откачать воздух. 4. Выдержать смесь в сушильном шкафу при 45 0 С до полного вы- сыхания (примерно 24 ч). 5. Промыть сухой остаток три раза буферным раствором (рН буфе- ра обычно выбирают соответствующим оптимальной активности фермента), пока носитель не станет практически белым. 6. К промытому носителю добавить раствор фермента, содержащий 1 г белка, и перемешивать при 4 0 С в течение 18 ч. 7. Отцентрифугировать суспензию и промыть иммобилизованный фермент буфером, затем буфером, содержащим 1 М NaCl, еще раз этими же растворами, затем еще два раза буфером. 8. Ресуспендировать иммобилизованный фермент в буфере и хра- нить при 4 0 С. Потенциальная возможность использования ферментного препарата в промышленных целях связана с его стабильностью в процессе функ- ционирования (операционная стабильность). В этом плане металлохе- латная иммобилизация дает неоднозначные результаты, которые зависят от вида фермента, материала носителя, условий окружающей среды и т. д. Особенно низкая операционная стабильность наблюдается при ис- пользовании высокополимерных субстратов. Логическим развитием рассматриваемого метода явилось его ис- пользование для иммобилизации целых клеток, в частности микроорга- низмов. Процесс иммобилизации на гидроксидах металлов представляет со- бой замещение гидроксильных групп на поверхности гидроксида подхо- дящими лигандами, входящими в состав фермента или клетки. В резуль- тате образуются связи, аналогичные ковалентным. Структурная слож- ность клеточных оболочек обеспечивает достаточное разнообразие под- ходящих лигандов, входящих в состав белковых и углеводных компо- нентов клеточной стенки. В качестве примера применение иммобилизо- 36 ванных металлохелатным методом живых клеток, может служить сооб- щение об использовании таких клеток для производства уксуса. Таким образом, мы рассмотрели довольно общие принципы получе- ния иммобилизованных биокатализаторов. Отметим, что соответствую- щие способы для разных вариантов разработаны с различной степенью детализации. Выбор средств и путей реализации зависит от конкретных биотехнологических задач. |