Глава 6.
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ КЛЕТКИ
ЖИВОТНЫХ
Ограниченность использования иммобилизованных животных клеток в значительной мере была обусловлена трудностью их куль- тивирования. За последние годы достигнуты большие успехи в раз- работке методов контролируемого культивирования in vitro млеко- питающих. Можно выделить несколько факторов, которые способст- вовали быстрому развитию этой области биотехнологии, а именно:
1) получение непрерывных, полностью охарактеризованных клеточ- ных линий; 2) обнаружение специфических факторов роста; 3) раз- работка аппаратуры для культивирования изолированных клеток в оптимальных условиях.
Быстрое развитие методологии культивирования клеток оказало огромное влияние на научные исследования во многих областях биологии. Постоянно упрощаются и совершенствуются в частности, методики выделения и изучения продуктов клеточного метаболизма, таких как гормоны, ферменты и антитела.
Иммобилизованные поверхностно-активные клетки тканей жи- вотных играют все большую роль во многих областях биологии.
Иммобилизованные клетки обычно сохраняют высокую степень функциональной дифференцировки, что облегчает изучение регуля- ции клеточного метаболизма гормонами и ростовыми факторами, а также способствует изучению механизмов модификации клеточных функций под действием различных эффекторов, например лекарст- венных препаратов и токсинов. Так, иммобилизованные гепатоциты нашли широкое применение в исследованиях метаболизма чужерод- ных веществ в печени.
6.1. Методы выделения и иммобилизации клеток
Большинство клеток твердых тканей, таких как ткани почек, пе- чени, кожи, являются поверхностно-активными.
В зависимости от подходов, используемых для прикрепления изолированных клеток к твердой подложке, или матрице, использу- ют различные методики культивирования клеток тканей животных и человека.
Из-за поверхностно-активных свойств in vitro их можно культи- вировать только в виде тонких пластов или монослоев, непосредст- венно связанных с поверхностью подложки. Отдельные клетки, об-
109 разующие этот монослой, контактируют как с соседними, так и с са- мой подложкой, поэтому их можно рассматривать как иммобилизо- ванные. Однако, в отличие от иммобилизованных растительных кле- ток и ферментов, связывание между поверхностно-активными клет- ками млекопитающих и твердой подложкой обычно проводят без специальной физической или химической обработки. Это связыва- ние осуществляется благодаря исходной
активности препарата изо- лированных клеток, совместимости клеток с твердой подложкой, а также наличию в сыворотке или специально добавленных в среду веществ, способствующих связыванию клеток.
Для некоторых видов клеток (например, клеток лимфобластоид- ного происхождения), обладающих особыми свойствами, разработа- на иная система культивирования. Клетки растут и размножаются в суспензии без предварительной иммобилизации, что облегчает раз- работку промышленных способов их культивирования.
При культивировании поверхностно-активных клеток требуется большая площадь поверхности носителя, а также адекватное и стро- го контролируемое поступление питательных веществ и кислорода, что вплоть до последнего времени сдерживало их крупномасштабное применение. Благодаря разработке методов культивирования на микроносителях, при которых клетки выращивают в виде монослоев, иммобилизованных на гранулах полистерола, стекла или декстрана, стало возможным культивирование поверхностно-активных клеток в суспензии.
Жизнеспособные, чувствительные к действию эндогенных ве- ществ (гормона) клетки можно выделить либо из нормальных, либо из патологических тканей человека или же из аналогичных тканей животных. в любом случае изолированные клетки получают, подвер- гая образцы тканей ферментативному диспергированию. При этом чтобы избежать некроза и получить максимальный выход жизнеспо- собных клеток, ткань следует измельчать как можно быстрее. Все операции следует проводить в стерильных условиях. Измельчение тканей начинают с приготовления срезов толщиной 0,5–1,0 мм с по- мощью микротома, успешно можно применять ножницы и пинцет
(рис. 6.1). Ферментативное диспергирование осуществляют с помо- щью трипсина в колбе, получая в конечном итоге суспензию жизне- способных клеток.
Непосредственно перед иммобилизацией определяется плот- ность популяции клеток и оценивается их жизнеспособность.
110
Иммобилизация поверхностно-активных клеток на твердой под- ложке – процесс многоступенчатый, который обычно начинается с адсорбции на отрицательно заряженной поверхности подложки спе- циальных веществ, способствующих прикреплению клеток. К
таким веществам относятся гликопротеины, получаемые из сыворотки, ли- бо из клеток определенных типов (диплоидные фибробласты, часто встречающихся в виде примесей в первичных культурах эпители- альных клеток).
Кроме того, из эпителиальных клеток выделяют особые факто- ры связывания, которые осуществляют прикрепление клеток к под- ложке, связывая гликопротеины клеточной поверхности с предвари- тельно адсорбированными сывороточными или фибробластными гликопротеинами (рис.6.2).
Образец ткани
Инкубирование (37 0С) на магнитной мешалке в растворе с трипсином Промытые кусочки ткани
Удаление надосадочной жидкости
Добавление свежей порции раствора фермента (инкубация 1–2) часа на мешалке
Суспензия изолированных клеток
Промывка Подсчет
Ресуспендирование в питательной среде
Разбавленная суспензия одиночных жизнеспособных клеток
Рис.6.1. Схема приготовления суспензии изолированных жизнеспособных клеток из свежеполученного образца ткани
111
Таким образом, иммобилизация клеток достигается благодаря первона- чальному контакту и последующему распластыванию клеток на поверхно- сти, в результате чего формируется монослой. Образование тесной связи между поверхностью клетки и подложкой и по существу структурная и функциональная стабильность монослоя в большей степени зависят от при- сутствия в среде гликопротеинов, способствующих прикреплению клеток.
6.2. Общие принципы биотестирования Широко используются иммобилизованные монослои клеток в системе биотестирования. Биотестирование – это оценка качественного и количест- венного содержания физиологически активных веществ (эффектора) по от- ветной реакции (тест-реакция) клеток-мишеней (тест-объект). Тест-объект
(клетка, ткань, организм) – это жизнеспособные биологические структуры разных уровней организации.
Тест-реакция характеризуется изменением какого-либо показателя под воздействием эффектора (стимулятора). Этот показатель получил название тест-параметра и определяется количественной характеристикой прояв- ления тест-реакции. клетка клетка клетка клетка
ГС
ФС
ГКП поверхность
А Б В Г ГС – гликопротеины сыворотки ГКП – гликопротеины клеточной поверхности
ФС – факторы связывания
Рис6.2. Прикрепление и организация в монослой свежеприготовленных клеток:
А – молекулы гликопротеина, полученные из культурной среды, обогащенной сывороткой, адсорби- руются на поверхности (электростатическое взаимодействие) лунки;
Б – клетки, полученные из целой ткани оседают на поверхность лунки через 1–2
часа после нанесе- ния;
В – факторы связывания, полученные из клеток, прикрепляют клетки к поверхности, связывая сыво- роточные гликопротеины с гликопротеинами клеточной поверхности;
Г – через 24 часа иммобилизованные клетки распластываются по поверхности, образуя монослой.
ГКП
ГС
112
В клинической и экспериментальной эндокринологии использова- ние биотестов облегчает определение, например гормонов, как в здоро- вом, так и больном организме. В этой связи рассмотрим основные крите- рии и принципы, используемые при разработке и конструировании сис- тем для биотестирования (в частности гормонов), а также дадим описа- ние простейшего способа его реализации.
Клетки, иммобилизованные на твердой подложке, представляют со- бой весьма удобный объект для выполнения различных операций био- тестирования. Так, упрощаются процедуры введения контрольного и тестируемого стимуляторов. При этом клеточный монослой не наруша- ется, а «перенос» культуральной среды между инкубационными стадия- ми сведен до минимума. Экскретируемые клеткой вещества можно легко определять, отбирая через определенные промежутки времени культу- ральную среду и анализируя ее, в то время как внутриклеточные продук- ты метаболизма можно выделять и изучать после полного лизиса клеток и их обработки специальными реагентами. И, наконец, уникальная про- странственная конфигурация клеток, организованных в монослои, спо- собствует быстрому и одновременному действию стимулятора на все клетки культуры, благодаря чему достигается почти одинаковый объект всех клеток. К тому же если повторы культур структурно идентичны, то с помощью иммобилизованных клеток удается достичь высокой чувст- вительности биотестирования.
Выбор клеток-мишений, наиболее подходящих для биотеста на ка- кое-либо определенное физиологически активное вещество, обуславли- вается как его природой исследуемого, так и стабильностью in vitro и ха- рактеристиками ответа используемых клеток.
В результате взаимодействия между стимулятором гормоном или медиатором и специфическими рецепторами соответствующих клеток- мишений в нормальных условиях in vivo происходят изменения в кле- точном метаболизме: накапливаются метаболиты, расходуются вещест- ва-предшественники, экскретируются в межклеточную среду специфиче- ские продукты метаболизма. Однако после извлечения тканей-мишеней из организма и ферментативного диспергирования изолированные клет- ки могут терять ряд
специфических функциональных свойств, характер- ных для интактной ткани, и поэтому на препаратах иммобилизованных клеток не всегда возможно продемонстрировать полную последователь- ность функциональных ответов, обычно возникающих, например, при гормональной стимуляции исходной ткани. Тем не менее, во многих случаях при сохранении степени дифференцировки в условиях in vitro, возможно выбрать несколько специфичных, ярко выраженных ответов
113 клеток, на основе которых можно разработать метод биотестирования данного гормона.
При изучении различных метаболических ответов, а также при вы- боре оптимального метода измерений биологической активности (био- тестирования) данного физиологически активного вещества следует оце- нивать каждый из ответов по следующим четырем критерием:
– специфичность ответа;
– чувствительность ответа;
– точность определения в выбранном интервале доз гормона;
– воспроизводимость ответа при использовании клеточных препара- тов;
Охарактеризуем каждый из четырех критериев, рассматривая гор- мональный эффект.
Итак, специфичность ответа. Не исключено, что действие других гормонов, особенно гормонов, имеющих сходную с исследуемым струк- туру, может вызвать подобный ответ. Однако в большинстве случаев уровень специфичности функционального объекта на действие иссле- дуемого регулятора можно обеспечить, тщательно подбирая клетки- мишени, условия их инкубации и блокирование рецепторов структурно сходными, но биологически неактивными молекулами.
Чувствительность ответа определяют, как наименьшее количест- во стимулятора, которое удается отличить от нулевой дозы при заданных условиях; его находят, построив для исследуемого гормона, кривую доза
– ответ. нулевая доза доза гормона
ΔН
А
О
тв ет к
л ет ок
Рис.6.3. Определение чувствительности биотеста и дозы исследуемого гормона по кривой доза-ответ стандартного стимулятора
114
Можно установить, как влияют на
чувствительность биотеста изме- нения условий инкубации, таких как плотность клеток-мишеней в моно- слое, время действия стимулятора, ионная сила и рН среды, а также вы- брать условия, в которых чувствительность используемого биотеста мак- симальна (рис. 6.3).
Точность измерения (определения) действия гормона, или показа- тель эффективности анализа, определяют по графикам зависимости точ- ности измерения от дозы гормона. Эти графики можно использовать для сравнения эффективности биотеста в различных интервалах доз иссле- дуемого гормона, т. е. на различных участках стандартной кривой, а так- же для изучения влияния различных условий инкубации или каких-либо веществ на эффективность биотеста в любом заданном интервале доз гормона.
При оптимизации условий проведения биотеста следует стараться подобрать условия для наиболее точного определения действия стимуля- тора, по крайней мере, в интересующем, а желательно в максимально широком интервале доз.
Воспроизводимость результатов биотестирования играет решаю- щую роль при интерпретации полученных результатов. Используя от- дельные монослои клеток, полученные из одной и той же исходной тка- ни, в различных, но следующих одна за другой процедурой биотестиро- вания можно достичь хорошей воспроизводимости, при которой откло- нения между биотестами не превышают 10–15 для доз гормона, прихо- дящего на участок максимальной точности кривой доза-ответ.
1. Подводя итог, следует подчеркнуть, что выбранный для опреде- ления какого-либо гормона ответ монослоев клеток-мишеней должен со- ответствовать следующим критерием: Быть высокоспецифичным по от- ношению к исследуемому гормону.
2. Обладать высокой чувствительностью.
3. Обеспечивать достигнутую точность определения гормона в не- обходимом интервале доз.
4. Обеспечивать высокую воспроизводимость как внутри каждой клетки, так и между препаратами клеток, полученными из различных ис- ходных тканей.
6.3. Схема проведения биотестирования После получения суспензии изолированных клеток из исходной ткани, чувствительной к исследуемому агенту, перед иммобилизацией определяют, как уже отмечалось, плотность популяции клеток и оцени-
115 вают их жизнеспособность. Затем готовят повторы монослоев, которые будут использоваться в качестве тканей-мишеней для биотеста. Для это- го в лунки платы вносят
определенное количество исходной клеточной суспензии, добиваются максимальной идентичности повторов слоев. Это достигается с помощью пипетки с фиксированным объемом. В каждую лунку вносится одинаковое количество клеток (рекомендуется прибли- зительно 5·10 5
клеток в 1 мл культуральной среды). При более высокой концентрации клеток ответ на действие стимулятора не достигает мак- симального значения, что объясняется уменьшением для стимулятора доступных рецепторов в результате скученности и избыточного количе- ства клеток.
Платы помещают в термостат (+37 0
С) и атмосферу насыщенную водя- ными парами для избежания испарения культуральной среды.
Для хранения жизнеспособности клеток после иммобилизации каждые
3–4 суток среду удаляют с поверхности монослоев культур с помощью сте- рильной пастеровской пипетки и вакуумного насоса, добавляют предвари- тельно нагретую свежую порцию той же среды. Необходимо также следить, чтобы при смене среды монослои не высыхали.
Изолированные клетки, полученные непосредственно из целых тканей ферментативным диспергированием, можно поддерживать в первичной культуре в иммобилизованном состоянии в течение 10–14 суток. При этом они способны сохранять высокую специфичность и чувствительность по от- ношению к соответствующим стимуляторам, т. е. сохранять свойства, пре- допределенные in vivo функциональными характеристиками исходной тка- ни.
Установлено, что in vivo функциональные характеристики чувстви- тельных к гормонам тканей зависят не только от возраста и пола, но также от физиологического состояния живых организмов.
Повторы монослоев клеток, полученные из одной и той же ткани или одного и того же посева клеток, должны быть идентичны по их способности
S
1
S
1
S
1 t
2 t
2 t
2 t
4 t
4 t
4
S
3
S
3
S
3
S
4
S
4
S
4 t
3 t
3 t
3 t
1 t
1 t
1
S
2
S
2
S
2
Рис.6.4. Распределение тестируемого и контрольного стимуляторов на плате с иммобилизованными клетками: t – тестируемые образцы; s – стандартные (контроль- ные) образцы.
116 реагировать на действие определенной дозы стимулятора. Основное требо- вание, предъявляемое к биотесту, и заключается в том, что каждая отдельная доза эффектора проверяется на достаточном количестве тест-объектов или повторов. Это требование выполняется при использовании иммобилизован- ных клеток одного монослоя. Однако чтобы провести последующую стати- стическую обработку получаемых результатов используется 3–4 повтора.
Распределение тестируемого и контрольного стимуляторов на плате с иммобилизованными клетками представлены на рис. 6.4. В данном случае каждую дозу стимулятора вносят в три лунки, содержащие клеточные моно- слои, т. е. на стандартной 24-луночной плате размещали восемь групп трое- кратных повторов доз эффектора.
В пределах одной и той же платы для биотестирования все инкубаци- онные лунки, а следовательно и все монослои, находятся в одинаковых ус- ловиях (температура, влажность, концентрация СО
2
в воздухе, состав пита- тельной среды). При проведении биотестирования следует соблюдать два условия.
Первое из них состоит в том, что необходимо обратить особое внима- ние на время действия стимулятора на клетки, которое должно быть одина- ковым для всех монослоев на плате. Следует прекращать инкубацию точно в таком же порядке, в каком добавляли стимулятор к клеткам, что особенно важно в
случае стандартных препаратов стимулятора, поскольку значение ответов клеток на их действие используют для построения графика зависи- мости доза-ответ. Так, при нанесении стимулятора на монослои в порядке возрастания доз любое заметное различие во времени инкубации монослоев с минимальной и максимальной дозами стимулятора может привести к ис- кажению кривой доза-ответ. Однако если ответ на каждую дозу гормона до его удаления уже достиг максимального уровня, некоторые отклонения во времени инкубации не оказывают существенного влияния на величину отве- та клеток.
Второе условие состоит в том, что при разработке и практическом при- менении биотеста, основанного на использовании повторов монослоев кле- ток, необходимо подобрать соответствующие методы контроля за проведе- нием биотестирования. Необходимо выявлять любые значительные откло- нения между величинами ответов клеток на действие стандартного препара- та стимулятора в различных платах с повторами культур и устранять их причины.
Использование клеток в качестве ткани-мишени возможно через 7–10 суток после начала культивирования иммобилизованных клеток. Последова- тельность основных операций проведения биотестирования приведена на рисунке 6.5 и состоит в следующем.
117
Монослои клеток, иммобилизованные на полистирольной подложке
Промывка удаление
Удаление культуральной среды
Скачать 1.14 Mb.