Учебнометодический комплекс по учебной дисциплине иммобилизованные клетки и ферменты для специальностей
 Скачать 1.14 Mb.
|
|
Добавление тестируемого и контрольного стимулятора Инкубация при контролируемых условиях Удаление стимулятора Хранение для анализа (при необходимости) Промывка удаление Обработка клеток с целью высвобождения продукта реакции Удаление экстрактов и определение продукта реакции Рис.6.5. Последовательность операций при проведении биотестирования 118 С помощью стерильной пастеровской пипетки удаляют питатель- ную среду, используемую на начальной стадии культивирования клеток (нельзя касаться пипеткой слоя клеток, допускать высыхания монослоев после удаления среды). Затем каждый монослой быстро промывается 37 0 С солевым раствором Хэнкса, который затем удаляется, как описано выше. На каждый монослой наносится тестируемый или контрольный стимулятор и культуры помещают в термостат (инкубатор). По истече- нии необходимого времени инкубации стимулятор удаляется с поверх- ности монослоев. Монослой промывается солевым раствором Хэнкса, который вновь удаляется. В каждую лунку добавляют 0,3 мл 12% (вес/объем) хлорной кислоты. Добавляя кислоту преследуют три цели: прекратить действие стимулятора, вызвать лизис клеток, разделить белковые и небелковые компоненты. В заключение определяют содержание специфического продукта реакции, находящегося в растворимой или нерастворимой в ки- слоте форме с помощью подходящего для данного вещества метода ко- личественного анализа. Таким образом, по окончании инкубации с гормоном проводят экстракцию продуктов реакции из иммобилизованных клеток или инкубационной среды и оценивают ответ клеток на каждую дозу стимулятора, определяя количество продуктов реакции в каждом экстракте. Полученные значения ответов клеток представляются в виде калибровочной кривой, обычно в виде кривой доза-ответ (см. рис. 6.3), где приведены средние значения и стандартные отклонения (SD). После- довательность операций следующая: – рассчитывают среднее значение ± SD ответа клеток на каждую до- зу стандартного препарата; – строят график зависимости доза-эффект; – экстраполируя с помощью калибровочной кривой рассчитывают биологически активную дозу стимулятора для каждого из определяемых образцов Для объективной оценки эффективности приема биотестирования необходимо использовать подходящие тщательно разработанные спосо- бы контроля за качеством их проведения. Такие способы включают, главным образом, количественную оценку колебаний величины ответов клеток от опыта к опыту на действие строго определенных доз ряда стандартных препаратов. Любой способ контроля за проведением серии последовательных процедур биотестирования, основанный либо на проверке способности к ответу отдельных культур клеток разных исходных тканей, либо на реги- 119 страции постепенных изменений характеристик ответов какого-либо штамма клеток для непрерывного культивирования, должен включать в себя многократное определение реакции клеток на действие строго опре- деленной дозы контрольного стимулятора. При этом способе контроля любое заметное отклонение величины наблюдаемой реакции клеток от среднего значения ответа может свидетельствовать об изменении свойств культуры клеток и, следовательно, может указывать на то, что результатами данной серии следует пренебречь. На практике для боль- шинства биотестов эти способы простейшего контроля легко выполнить, включив в схему проведения биотестирования анализ ответов клеток на действие соответствующих доз стандартного препарата (кривая доза- ответ). Рис. 6.6. Простейшая схема контроля за проведением биотестирования Для более тщательного контроля процедуры проведения биотести- рования среди выбранных доз гормона должно быть несколько доз из всего диапазона, наиболее часто встречающиеся в тестируемых образ- цах. В случае определения гормонов в сыворотке крови человека значе- ние этих доз должны входить в диапазон физиологических доз тестируе- мого гормона. Можно также включать дополнительные дозы стандарт- ных препаратов сравнения, соответствующие пределу чувствительности биотеста, т. е. очень низкие дозы. При биотестировании образцов сыво- ротки с повышенным содержанием гормона следует использовать дозы стандартного препарата, превышающие нормальный физиологический уровень тестируемого гормона. Для каждой серии биотестов, основан- 1 2 3 4 5 6 8 7 9 10 Номер биотеста О тв ет к л ет ок 120 ных на применении клеток, полученных из различных исходных тканей или субкультур стабильных клеточных линий,ответы клеток на действие отдельной дозы стандартного препарата следует представлять графиче- ски (рис. 6.6).В этом случае значение ответов клеток на действие данной дозы в контролируемом биотесте можно сравнить со средним значением ответов клеток на действие той же дозы тестируемого гормона, получен- ным в предшествующей серии опытов. Результаты биотестирования, в которых величины ответов клеток отклоняются от величины (среднее значение ± SD) следует считать недостоверными, и ими можно пренеб- речь. 6.4. Анализ содержания тиреотропного гормона (ТТГ) с помощью иммобилизованных клеток щитовидной железы Рассмотрим конкретный пример определения биологической актив- ности ТТГ с использованием в качестве тест-объекта фолликулярных клеток щитовидной железы человека. Процедура биотестирования со- стоит в следующем. Суспензию жизнеспособных фолликулярных клеток щитовидной железы человека готовят ферментативным диспергировани- ем кусочков ткани. Каждый препарат клеточной суспензии готовят толь- ко из одного образца щитовидной железы. Через четыре дня после нача- ла культивирования фолликулярные клетки щитовидной железы упло- щаются и прикрепляются к поверхности лунки полистерольной платы. Образованные монослойные культуры клеток используют в качестве тканей-мишеней для биотестирования ТТГ. Если менять среду каждые 3–4 суток, то монослои сохраняют способность к ответу в течение 4–7 суток. Затем уже начинается дифференцировка клеток и избыточный рост фибробластов, т. е. происходят изменения, влияющие на характер ответной реакции. Биологическую активность ТТГ можно определять несколькими способами. Наиболее эффективный – это метод, базирующий на исполь- зовании способности ТТГ стимулировать накопление внутриклеточного цАМФ. цАМФ можно определить методом конкурентного связывания с белком, обладающим высокой специфичностью по отношению к опреде- ляемому нуклеотиду. Измеряют цАМФ и другими методами, например, основанными на использовании антител, специфичных к цАМФ. Пре- имущество последнего метода – его повышенная чувствительность, бла- годаря чему можно определить очень низкие концентрации. Но при дос- таточном количестве цАМФ чаще пользуются методом связывания с 121 белком, поскольку последний можно хранить при – 20 0 С в течение дли- тельного времени (2–3 года). Для замены менее доступных препаратов ТТГ человека одновре- менно проводится биотестирование активности бычьего ТТГ. По данным о накоплении внутриклеточного цАМФ в монослойных клетках щитовидной железы в ответ на действие бычьего и человеческо- го ТТГ строились кривые доза-ответ (рис. 6.7). Следует подчеркнуть, что соотношение между ответом клеток и дозой стимулятора зависит от вре- мени инкубации, температуры, рН, ионной силы инкубационной среды. Поэтому необходимо следить за тем, чтобы условия инкубации при биотестировании обоих исследуемых препаратов ТТГ были одинаковы- ми. Полученные зависимости доза-ответ для удобства сравнения были представлены в логарифмических координатах. В логарифмических координатах кривые зависимости ответов кле- ток на действие возрастающих доз бычьего и человеческого ТТГ оказа- лись линейными и параллельными. В этом случае легко рассчитать от- lg дозы ТТГ – 3 –2 l g [ц А М Ф ] 1,5 2,0 2,5 1 5 10 20 ц А М Ф , м ол ь /к ул ьт ура 120 200 280 Доза ТТГ, (ед/мл)· 10 –3 Рис.6.7. Зависимость-эффект (по накоплению цАМФ) монослойных культур клеток щитовидной железы на действие гормона: в обычных (а) и логарифмических (б) координатах: 1 – бычий ТТГ; 2 – ТТГ человека 1 2 1 2 а б 122 ношения активности этих двух препаратов. Активность бычьего ТТГ оказалась в 2,5 раза выше, чем человеческого. Таким образом, каждую дозу определяемого препарата бычьего ТТГ можно выразить в единицах активности ТТГ человека, т. е. менее доступные препараты ТТГ человека можно успешно заменить на препараты бычьего ТТГ и использовать их в качестве «вторичных стандартов» при проведении биотестирования. В конечном итоге содержание ТТГ в анализируемой пробе опреде- ляют экстраполируя количество цАМФ до пересечения с прямой 1 ка- либровочного графика (см. рис. 6.7, б) и последующем перенесением на ось абсцисс; затем корректируют на указанный выше коэффициент 2,5 и получают количество ТТГ в пробе, которое в данном случае составляет 2,5·10 –3 ед/мл. При проведении анализа с помощью биотеста при построении ка- либровочной кривой доза-эффект кроме физиологических следует вклю- чать пониженные и повышенные дозы стандартного препарата. Исполь- зование биотестов, обладающих высокой специфичностью, позволяет достаточно эффективно провести идентификацию физиологически ак- тивных веществ, в частности гормонов, в исследуемых пробах. 123 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящее время в самых различных областях нашей жизни, от медицины до военной промышленности, от переработки пищевых про- дуктов до микроэлектронных сенсоров используются уникальные спо- собности биологических систем. Разработка практических методов или приборов, включающих в ка- честве компонента биологический элемент, в значительной степени за- висит от выбора биологического объекта и наличия соответствующих методик. В данных условиях на первое место выдвигаются проблемы, связан- ные с выбором технологически оправданного варианта для решения по- ставленных задач. Поэтому и возникла идея закрепления фермента или клетки на или в нерастворимом носителе с целью определения преиму- щества данного подхода. Надо отметить, что методы иммобилизации приобретают все более важное значение в биотехнологии. Например, при создании систем, тре- бующих повышение специфичности и стабильности препаратов. Применению биотехнологий для производства различных видов то- плива и химических соединений, в том числе лекарств и гормонов, уде- ляется особое внимание, и в этом отношении применение иммобилизо- ванных ферментов и клеток обладает большими потенциальными воз- можностями. Использование иммобилизованных препаратов для различ- ных целей синтеза или трансформации веществ в ряде случаев повышает технологичность создаваемых новых производств или модификации су- ществующих. Однако применение иммобилизованных ферментов в практических целях все же ограничено, особенно из-за высокой стоимости чистых препаратов. Живая клетка, в отличие от фермента представляет собой го- товый биотехнологический реактор, который обладает рядом преиму- ществ. Например, для непрерывных процессов появляется принципиаль- ная возможность более длительной эксплуатации иммобилизованных клеток по сравнению с обычным однократным использованием свобод- ных культур, в результате иммобилизации повышается устойчивость препаратов к действию различных инактивирующих внешних факторов, повышается продуктивность осуществляемых превращений субстратов в конечные производные и т. д. С другой стороны, из приведенного материала можно заметить, что существует неоднозначность в трактовках по использованию иммобили- зованных препаратов. Это определяется многообразием причин, в част- 124 ности видам используемых организмов, их особенностями, типом носи- теля и способом иммобилизации, а также конкретными задачами каждо- го технологического процесса. Так, с помощью включения препаратов в матрицу носителя, как правило, предотвращается попадание в среду от- мирающей части иммобилизованной популяции клеток, а адсорбцион- ные методы закрепления их на нерастворимых носителях аналогичного эффекта обеспечить не могут. Для успешной разработки какого-либо процесса на основе иммоби- лизованных препаратов необходимо представлять себе совокупность всех имеющихся проблем, хорошо ориентироваться в научной и патент- ной литературе и знать основные методы создания биокатализатора. Таким образом, при подготовке молодых специалистов в области биотехнологии необходимо учитывать междисциплинарный характер данной отрасли, базирующийся на глубине и широте знаний в смежных сферах. ЛИТЕРАТУРА Основная 1. Березин И. В. Исследования в области ферментативного катализа и инже- нерной энзимологии // избранные труды. М.: Наука, 1990. 2. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы / под редакцией Дж. Вуд- ворда. М.: Мир, 1988. 3. Синицын А. П., Райнина Е. И., Лозинский В. И., Спасов С. Д. Иммобилизо- ванные клетки микроорганизмов. М.: МГУ, 1994. 4. Применение иммобилизованных ферментов. Итоги науки и техники ВИНИ- ТИ. Сер. Биотехнология. М. 1986. Дополнительная 1. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. М.: Мир, 1983. 2. Иммобилизованные клетки в биотехнологии. Пущино. 1987. 3. Скрябин Г.К., Кощеенко К.А. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. В кн. Биотехнология. М: Наука, 1984. 4. Колесов А. А. Инженерная энзимология на промышленном уровне. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М. 1989. 5. Иммобилизованные клетки микроорганизмов (теория и практика). Пущино. 1987. 125 2. ПРАКТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ Методические указания к лабораторным работам по курсам «Иммобилизованные клетки и ферменты» и «Биосенсорные систе- мы» / В. М. Юрин, А. П. Кудряшов – Минск: БГУ, 1999. – 16 с. РАБОТА № 1 Иммобилизация клеток микроводорослей Вводные пояснения Иммобилизацию можно рассматривать как физическое разделение катализатора (клеток, клеточных фракций или ферментов) и растворите- ля, при котором молекулы субстрата и продукта могут легко обмени- ваться между фазами. Разделение катализатора и растворителя может быть достигнуто либо адсорбционным или ковалентным связыванием с нерастворимым органическим или неорганическим носителем, либо свя- зыванием отдельных молекул катализатора друг с другом с образованием агрегатов или сополимеров. Химическая модификация, которой подвер- гаются ферменты или клетки в процессе такой иммобилизации, может нежелательным образом изменять их каталитические и другие свойства. По этой причине предпочитают включение препаратов в гель. В этом случае клетки или ферменты отделяют от остального раствора включе- нием в толщу носителя или инкапсулированием. Таким образом, катали- затор можно включить в полимерную сетку, например полиакриламид- ного геля или геля альгината кальция, путем полимеризации или попе- речного сшивания компонентов геля в присутствии ферментов или кле- ток. Препараты иммобилизованных клеток находят широкое применение в биотехнологии: они используются для получения физиологически ак- тивных веществ, для создания биосенсорных устройств, для очистки среды и т.д а) Иммобилизация клеток Chlorella включением в гель альгината кальция Альгинат – основной структурный полисахарид бурых морских во- дорослей. В присутствии моновалентных катионов полисахариды даже в низких концентрациях образуют вязкий раствор, тогда как в присутствии двухвалентных катионов, особенно кальция, наблюдается образование геля. Поскольку гель образуется в мягких условиях, в нем можно иммо- билизовать живые клетки. Именно это применение альгината получило наиболее широкое распространение. 126 Материалы и оборудование: 3 % раствор альгината натрия, 0,2 М CaCl 2 , паста клеток Chlorella, шприц емкостью 5 мл с иглой диаметром 1 мм для формирования капель смеси или пипетка на 10 мл с диаметром выходного отверстия 3 мм Ход работы: Осторожно смешать 100 мг пасты клеток водоросли и 10 мл раствора альгината натрия. Полученную смесь поместить в шприц емкостью 5 мл и капать в сосуд, содержащий 150 мл охлажденного 0,2 М раствора CaCl 2 , таким образом, чтобы образовывались гранулы диамет- ром 1-2 мм. Оставить гранулы альгината кальция с включенными в них клетками в растворе CaCl 2 на 20 мин для затвердевания. б) Иммобилизация клеток хлореллы включением в агар-агаровый гель Агар-агар – смесь полисахаридов получаемых из некоторых видов бурых водорослей. При охлаждении горячих водных растворов агар- агара образуется гель. Стабилизация геля осуществляется за счет водо- родных связей между отдельными молекулами полисахарида. Затверде- вание геля происходит при температуре 42-35 о С. Агар-агар не изменяет кислотности среды и не производит химического повреждения клеточ- ных структур, поэтому возможно включение живых клеток в агаровый гель без их существенного повреждения Материалы и оборудование: Сухой агар-агар, паста клеток Chlor- ella, шприц емкостью 5 мл, стеклянный капилляр, мерный цилиндр ем- костью 100 мл, магнитная мешалка, водяная баня, химический стакан объемом 0,5-0,8 л. Ход работы: 2 г агар-агара смешать с 50 мл дистиллированной во- ды нагретой до 80 – 90 о С. Смесь поместить в кипящую водяную баню и перемешивать до полного растворения агар-агара. Приготовить густую суспензию клеток хлореллы, смешав 100 мг пасты клеток водоросли с 0,5 мл дистиллированной воды. В химический стакан налить 0,4 л воды нагретой до 45 о С. В этот стакан поместить на 10 мин сосуды с раствором агар-агара и суспензией клеток водоросли для уравновешивания их температуры. Смешать весь объем суспензии с 2 мл 4% раствора агар-агара. Затем эта смесь помещается в шприц и пропускается через охлаждаемый ка- пилляр, в котором и осуществляется формирование тонкого цилиндра геля с заключенными в нем клетками, в мерный цилиндр с охлажденной до 10 о С водой. Процедура иммобилизации должна осуществляться быст- ро, чтобы избежать затвердевания геля в шприце. Иммобилизованные указанными способами клетки хлореллы тща- тельно отмыть дистиллированной (три раза с выдерживанием в каждом |