Учебнометодический комплекс по учебной дисциплине иммобилизованные клетки и ферменты для специальностей
 Скачать 1.14 Mb.
|
|
Глава 4 . ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ КЛЕТКИ МИКРООРГАНИЗМОВ Микроорганизмы являются уникальными природными «биологиче- скими комбинатами», используемыми человечеством для различных це- лей. В настоящее время техническая микробиология стала одной из крупнотоннажных отраслей производства, поставляющая сельскому хо- зяйству средства защиты растений, для животноводства, – корма и ле- карства, здравоохранению – антибиотики, витамины, аминокислоты, хи- мической промышленности – спирты и органические кислоты и т. д. Огромна роль микроорганизмов в системах биологической очистки сточных вод: входящие в состав активного ила клетки различных систе- матических групп разрушают или трансформируют вредные для окру- жающей среды соединения до простых веществ типа СО 2, N 2 и Н 2 О, ре- шая тем самым экологическую проблему. 4.1. Характеристика микробных биокатализаторов Микробные клетки – природные биокатализаторы, первыми стали применяться в иммобилизованном состоянии в производственных масшта- бах (первая половина XIX в. – получение уксуса из спирта с помощью ук- суснокислых бактерий, адсорбированных на опилках). Несмотря на ряд ограничений, процедуры с использованием иммоби- лизованных клеток представляют собой весомую альтернативу стандарт- ной процедуре ферментации. Действительно, есть ряд сообщений об уве- личении производительности на порядок и более иммобилизованными клетками по сравнению с суспендированными. Более того, иммобилизо- ванные клетки сохраняют жизнеспособность в течение многих месяцев. Термин «Иммобилизованные клетки» возник в научной литературе по аналогии с «иммобилизованными ферментами», но в последнее время по отношению к клеткам стал употребляться в более широком понятии, чем по отношению к ферментам. В настоящее время иммобилизованными считают клетки, для которых созданы искусственные ограничения подвижности во внешней среде, а ма- териальный посредник, обеспечивающий ограничение подвижности, счи- тается носителем. В целом система клетка-носитель называется иммобили- зованным биокатализатором. Преимущества иммобилизованных клеток, по сравнению с иммоби- лизованными ферментами заключается главным образом в том, что при 61 использовании иммобилизованных клеток отпадают стадии выделения, очистки и иммобилизации самих ферментов, которые, как правило, яв- ляются наиболее дорогостоящими при осуществлении полного техно- логического процесса. Далее, ферменты в клетках находятся в наиболее естественном ок- ружении, что положительно сказывается на их термостабильности, а так- же на их операционной стабильности (продолжительности работы). Известно много примеров, когда после выделения из организма ферменты быстро теряли активность, а иногда их вообще не удавалось выделить в активной форме, тогда как в клетках они сохраняют катали- тические свойства достаточно долго. В этих случаях применение целых клеток, а не ферментов вполне оправдано и единственно приемлемо. Иммобилизация целых клеток увеличивает сохранность и срок ра- боты в качестве катализатора по сравнению с обычными клетками. Из миллионов известных человеку видов микроорганизмов в промышлен- ности используют всего тысячи штаммов относительно небольшого числа видов. Это связано с тем, что производственный штамм должен отвечать ряду строгих требований: – расти на дешевых субстратах; – обладать высокой скоростью роста или давать высокий выход продукта за короткое время; – проявлять синтетическую активность, связанную с образованием желаемого продукта при низком содержании побочных продуктов; – образовывать максимально высокую концентрацию целевого продукта, чтобы затраты на его выделение были экономически оправ- даны; – быть устойчивым к фаговой и другими видам инфекций; – быть не токсичными (безвредными) для людей и окружающей среды; – желательно использовать штаммы, для которых легко поддержи- вать стерильность в производстве. В конечном итоге на первом месте оказывается себестоимость про- дукта. Себестоимость целевого продукта любого микробиологического производства в значительной степени определяется затратами на сырье, используемое клетками в процессе роста. Чтобы получить продукт мик- робного синтеза или трансформации в процессе роста культуры микро- организма и при этом еще обеспечить высокую скорость роста клеток, необходимо сбалансировать среду культивирования по всем питатель- ным компонентам. При иммобилизации, прежде всего имеет смысл проверить, способны ли эффективно утилизировать в процессе роста 62 имеющиеся в распоряжении клетки то сырье, которое будет использо- ваться в производстве. Далее, при положительном результате, необходимо выяснить фазу роста, в которой способность культуры клеток в отношении синтеза и трансформации конкретного продукта максимальна. Это необходимо для своевременного отделения клеток от культуральной жидкости (сепара- ция, центрифугирование, фильтрация). Стадия отделения клеток от куль- туральной жидкости необходима, поскольку для иммобилизации удачнее всего иметь либо концентрированную суспензию клеток, либо клеточ- ную пасту. Затем следует проверить способность к функционированию клеток, перенесенных в свежую питательную среду, а также осуществлять кон- троль за накоплением целевого продукта в культуральной жидкости. Целесообразность соблюдения выше перечисленных приемов объ- ясняется следующими соображениями. Во-первых, следует проверить способность конкретного микроорганизма синтезировать и секретиро- вать целевой продукт в отсутствии роста. Если культура синтезирует и секретирует продукт только в процессе активного роста, то необходи- мость иммобилизации вызывает сомнение. Это связано с тем, что непре- рывно растущие клетки будут либо просто выходить из носителя, либо разрушать его структуру, т. е. такой процесс практически не будет отли- чаться от простой ферментации. Однако есть примеры, когда клетки не растут на имеющемся суб- страте. Но при иммобилизации, например клеток Z. mobilis, в криогели поливинилового спирта, с высокой скоростью эффективно сбраживали в этанол глюкозу, содержащуюся в ферментативных гидролизатах. При помощи иммобилизованных микроорганизмов реализуются процессы, в которых, используя природные (или приобретенные) свойст- ва клеток, можно длительно поддерживать на постоянном уровне их син- тетическую активность, направленную в сторону образования нужного продукта. Для снижения себестоимости конечного продукта необходимо, что- бы промышленные штаммы были экстремофильными, т. е. росли при по- вышенных температурах, очень высоких концентрациях солей, кислых или щелочных рН. Стерильность микробиологического производства – проблема, реализация которой требует значительных капвложений. При эксплуатации иммобилизованных клеток требования к стериль- ности производства несколько снижаются и, в этом случае появляется ряд преимуществ. Во-первых, процессы, в которых можно использовать иммобилизованные клетки, как правило, реализуются в длительном про- 63 точном режиме (уменьшается число манипуляций со свободными клет- ками, а также проточность системы реактора не дает возможности по- падающим спорам и единичным микроорганизмам размножаться). Во-вторых, высокая концентрация активно метаболизирующих микроорганизмов создает неблагоприятные условия для размножения единичных клеток посторонней микрофлоры. В-третьих, если иммобилизация проведена методом включения в какой-либо гелевой носитель, то посторонние микроорганизмы в мат- рицу носителя, как правило, не попадают. Разумеется, что не так легко в природе подобрать штаммы, удовле- творяющие всем перечисленным требованиям. Для проведения подоб- ной работы в настоящее время разработаны рациональные скрининго- вые методы, которые позволяют отобрать клетки, которые имеют (либо приобрели в результате мутагенеза) высокую продуктивность и/или другие полезные для производства свойства. Весьма перспективным представляются способы улучшения производственных характеристик штаммов путем использования рекомбинационных методов, позволяю- щих целенаправленно получать микроорганизмы с заданными свойст- вами. Замена свободно культивируемых клеток микроорганизмов на био- катализаторы в виде иммобилизованных препаратов поднимает биотех- нологический процесс на новый качественный уровень. Сама иммоби- лизация изменяет условия проведения биологических процессов в большей степени, чем свойства самих организмов. Использование иммобилизованных микроорганизмов затрагивает и экологический аспект. Периодическое и непрерывное культивирование микроорганизмов для производства различных веществ приводит к то- му, что полезный продукт образуется при регулярном наращивании биомассы, которая не утилизируется и является отходом. Любые, даже непатогенные микроорганизмы, при достаточно высокой концентрации ухудшают экологию воздуха, воды, почвы, могут вызывать аллергиче- ские заболевания у людей и т. д. Замена свободно культивируемых клеток на иммобилизованные избавляет от необходимости регулярного наращивания биомассы. При необходимости использования патогенных или условно- патогенных микроорганизмов в случае их иммобилизации в массе носи- теля, они оказываются изолированными от окружающей среды. Применение иммобилизованных клеток связано с решением неко- торых новых проблем, например, повторной утилизации или, напротив, уничтожения отработанного биокатализатора. 64 Существует и возможность повторной утилизации и носителя: на- пример криогель поливинилового спирта, использованный в качествен носителя в течение трех месяцев, расплавляют при температуре 90–100 0 С и затем вновь используют. Следует отметить и трудности, которые возникают при замене сво- бодно культивируемых клеток на иммобилизованные. Первое, консистенция сырья, используемого в микробиологиче- ском производстве. Так, например, процесс получения этилового спирта из гидролизатов некондиционного картофеля и зерна. Такое сырье представляет собой чрезвычайно густую негомогенную массу, содер- жащую большое количество твердых частиц. Применение в данном процессе иммобилизованных клеток является нецелесообразным, по- скольку с одной стороны, невозможно осуществлять непрерывную по- дачу в реактор густой питательной среды, а с другой, трудно подобрать подходящий метод иммобилизации дрожжей и носитель, которые в этом случае обеспечили бы сохранность иммобилизации. Второе, значительную проблему при использовании иммобилизо- ванных биокатализаторов создает массоперенос, посколько в последнем случае нельзя использовать традиционные для культивирования сво- бодных клеток способы интенсивного перемешивания или барботации газов. 4.2. Основные принципы действия иммобилизованных микробных биокатализаторов В исследованиях по иммобилизации микроорганизмов и их исполь- зования выделяют два основных направления, различающиеся по зада- чам: 1. Создание катализаторов для процессов биотрансформации раз- личных органических соединений (расщепление или синтеза специфиче- ских связей, модификации конкретных групп и т. д.). 2. Создание катализаторов для реализации процессов биосинтеза различных органических соединений, в том числе первичных и вторич- ных метаболитов, из компонентов питательной среды. Очевидные различия этих направлений определяют конкретные требования, предъявляемые к физиологическим характеристикам иммо- билизованных клеток. Прежде чем перейти к описанию принципов действия микробных биокатализаторов следует несколько слов сказать об используемой тер- миналогии. 65 1. «Жизнеспособные» (viable) иммобилизованные клетки – потен- циально способные давать потомство. Жизнеспособными оказываются такие иммобилизованные клетки, которые могут делиться непосредст- венно в носителе (на носителе) либо размножаться после отделения от носителя. Соответственно клетки «утерявшие» способность давать потомст- во, называются «нежизнеспособными» (non viable). 2. Растущие (growing) клетки – размножающиеся в конкретных ус- ловиях их эксплуатации, т. е. только непосредственно в иммобилизо- ванном состоянии. 3. «Не растущие» (non growing) иммобилизованные клетки – не де- лящиеся в иммобилизованном состоянии, но метаболически активные. Для не растущих клеток может быть характерно увеличение размеров, веса, например за счет накопления внутриклеточных веществ, что при- водит к увеличению общего веса иммобилизованной биомассы, несмот- ря на то, что деления клеток не происходит. Использование термина «не растущие» более правильно, чем «покоящиеся» (resting cell), так как по- следнее понятие относится к клеткам, которые временно (в связи со специфическими условиями) не делятся и активно не метаболизируют. 4. Понятие «живые» (living) и «неживые» клетки (dead) лучше не использовать, поскольку, если даже в клетке функционирует хотя бы единичный фермент, то нельзя назвать ее мертвой. 5. Метаболическая активность – активность основного метаболиз- ма клеток. 6. Синтетическая активность – способность иммобилизованных клеток синтезировать целевой продукт. Важно отметить именно секре- торную способность клетки, так как клетки, синтезирующие различные соединения, но накапливающие их внутри, не имеет смысла иммобили- зовать. По принципу своего действия все искусственные твердофазные биокатализаторы на основе микробных клеток по уровням своей слож- ности делят следующим образом: Одноферментные системы без кофакторов – это простейшие ка- талитические системы, которые могут осуществлять одностадийные процессы биотрансформации. Олигоферментные системы с регенерацией кофакторов. Такие ка- тализаторы в принципе являются многоферментными и должны обес- печивать регенерацию кофакторов (обычно НАД и НАДН). Такие сис- темы характеризуются способностью удерживать регенерируемые ко- факторы. 66 Мультиферментные системы с регенерацией нескольких кофакто- ров. К таким системам относятся иммобилизованные клетки с высокой активностью основного метаболизма (катаболизма углеводов). Мультиферментные системы, катализирующие сложные синтети- ческие процессы, непосредственно связанные с основным метаболизмом клеток. Для создания систем первых двух типов можно использовать еди- ничные иммобилизованные ферменты или ферментные системы в специ- альных мембранных реакторах, а применение иммобилизованных клеток рассматривается как альтернативный вариант, упрощающий технологию приготовления биокатализатора и иногда способствующий стабилизации конкретного фермента за счет сохранения его естественного микроокру- жения в клетках. Две другие системы можно создать только на основе иммобилизо- ванных клеток, причем метаболически и синтетически активных. Про- дукты мультиферментных синтетических систем (белки, ферменты, по- лисахариды, нуклеозидтрифосфаты, первичные и вторичные метаболи- ты) являются соединениями, образование которых из исходных веществ в водной среде связано с увеличением свободной энергии (ΔG > 0), и следовательно, эти реакции можно реализовать только в случае функ- ционирования в клетке основного метаболизма, который снабжает вто- ричный синтез исходными продуктами, макроэргическими соединения- ми и регенерированными коферментами. Подобные катализаторы могут быть созданы только на основе интактных или незначительно изменен- ных клеток, проявляющих безусловную способность к первичному мета- болизму. 4.3. Подходы к выбору способа иммобилизации микробных клеток в реальных промышленных условиях Когда вопрос о принципиальной возможности и необходимости ка- кого-либо процесса на основе иммобилизованных микробных клеток решен, возникает проблема выбора иммобилизации и носителя. Для по- лучения биокатализаторов можно использовать разные методы иммоби- лизации. Однако конкретные условия иммобилизации и носители подби- раются таким образом, чтобы иммобилизованные клетки в наименьшей степени оказались повреждены, а структура матрицы не являлась по воз- можности диффузионным барьером. Никаких конкретных рецептов для получения заведомо метаболически и синтетически активных иммобили- зованных клеток не существует. 67 Можно лишь указать на некоторые способы иммобилизации, кото- рые использовать нецелесообразно: – иммобилизация в полиакриламидном геле в обычных условиях вызывает резкое снижение метаболической активности клеток, причем снижается жизнеспособность популяции. Основными негативными фак- торами в этом случае являются токсическое действие акриламида, по- вышение температуры при полимеризации полиакриламидного геля и образование свободных радикалов. При криополимеризации акриламида получают жизнеспособные клетки, обладающие высокой метаболиче- ской активностью. – малоперспективным является включение клеток носители, полу- чаемые полимеризацией мономеров под действием УФ – или рентгенов- ского облучения, так как последние оказывают негативное воздействие на живые организмы. – не рекомендуется обрабатывать клетки некоторыми бифункцио- нальными агентами, такими, например как глутаровый альдегид, кото- рый часто используют для укрепления гелей, образованных природными полисахаридами. В целом же, при выборе способа иммобилизации и носителя для создания эффективного биокатализатора следует, безусловно, руково- дство физиологическими и метаболическими особенностями используе- мого продуцента. Существует несколько различных подходов для выбора способов иммобилизации по целям использования в конкретных производствен- ных условиях: 1. Выбор по принципу действия иммобилизованных клеточных сис- тем. 2. Выбор по масштабности биотехнологического процесса. 3. Выбор по специфике биотехнологического процесса. Выбор по принципу действия иммобилизованных клеточных систем. Наибольший прогресс достигнут в использовании иммобилизованных клеток как катализаторов процессов биотрансформации. В ряде случаев, как например получение L-аспариновой кислоты из фумарата аммония, или L-аланина из L-аспариновой кислоты, реализует- ся строго специфической ферментативной активностью клетки. Сохра- нение жизнеспособности, метаболической и синтетической активностей иммобилизованных клеток для осуществления таких одноферментных реакций не требуется, в некоторых случаях даже вредно, поскольку при- водит к загрязнению реакционной среды побочными продуктами мета- болизма клеток. 68 При получении биокатализатора для одноферментных трансформа- ционных процессов часто клетки до иммобилизации (или в результате иммобилизации) частично или полностью разрушаются и, по сути дела, иммобилизуют не клетку, а фермент вместе с клеточным содержимым. В результате даже удается повысить уровень активности катализатора по сравнению со свободными клетками за счет разрушения клеточных обо- лочек, создающих диффузионные затруднения на пути субстрата к фер- менту, и выделению продукта реакции. При таком подходе отсутствует стадия выделения и очистки фер- мента для иммобилизации. Высокая стабильность катализатора на осно- ве «разрушенных» клеток по сравнению с нативным ферментом может объясняться тем, что в результате выделения и очистки снижается ста- бильность фермента. По мнению некоторых авторов в ряде случаев выделение из целой клетки фермента при приготовлении биокатализаторов нерационален, поскольку не реализует влияние естественного микроокружения на фер- мент. Именно, сохранение естественного микроокружения защищает фермент от различных неблагоприятных воздействий при иммобилиза- ции. В некоторых случаях целесообразно предварительно обработать клетки с целью снижения их общей метаболической активности и лишь затем проводить иммобилизацию. Например, проводят обработку клеток некоторыми органическими соединениями, нарушающими клеточную проницаемость (пермеабилизация). Необходимо, однако, проверить влияние такой обработки на активность интересующего фермента. При использовании иммобилизованных клеток для полиферментной биотрансформации необходимы данные о влиянии на эффективность биотрансформации свойств носителя, условий самой иммобилизации и дальнейшего использования биокатализатора, т. е. необходимо поддер- жание не только структурной целостности, но и метаболической актив- ности иммобилизованных клеток. Выбор по масштабности биотехнологического процесса. Для реа- лизации крупнотоннажного производства продуктов микробного синтеза или трансформации ряда веществ (аминокислоты, органические кислоты, спирты и т. д.) способ иммобилизации должен быть по возможности простым и недорогим. В качестве носителя следует использовать веще- ства и материалы с высокой механической прочностью и стабильностью. Для нужд «малой» биотехнологии, примером которой является спе- циальный тонкий органический синтез или трансформация, экономиче- ская оценка биокатализатора (включая стоимость носителя) и требования 69 к носителям не так существенны, поскольку биокатализатор готовится в небольших количествах, а получаемый продукт, как правило, дорог. Аналогичные соображения можно высказать и по поводу создания иммобилизованных клеточных систем для использования их в различно- го рода аналитических (биосенсорных) устройствах. Выбор по специфике биотехнологического процесса. Единственная область применения иммобилизованных клеток, для которой конкретно указывается наиболее перспективный метод иммобилизации (адсорбци- онный – очистка сточных вод. Для всех остальных типов биотехнологических процессов при вы- боре метода иммобилизации руководствуются комплексом требований и ограничений, которые мы с вами рассмотрели ранее. |