Учебнометодический комплекс по учебной дисциплине иммобилизованные клетки и ферменты для специальностей
 Скачать 1.14 Mb.
|
|
4.4. Оценка физиологической и метаболической активностей клеток в иммобилизованном состоянии В настоящее время накоплен значительный экспериментальный ма- териал, свидетельствующий об увеличении стабильности иммобилизо- ванных клеток по сравнению со свободно культивируемыми микроорга- низмами. Стабильность выражается в более продолжительном активном функционировании клеток, при этом отмечается расширение рН и тем- пературных оптимумов, большая устойчивость к негативным воздейст- виям окружающей среды. Иммобилизованные клетки ингибируются более высокими концен- трациями образованных ими продуктов, нежели свободные. Среди факторов, определяющих стабильность иммобилизованных клеток (микробных, растительных, животных) и оказывающих влияние на морфологию, физиологию и метаболическую активность, выделяют следующие: 1. Метаболизм используемых клеток, плотность и равномерность распределения в носителе; 2. Свойства носителя (матрицы или подложки); 3. Природа микроокружения вокруг клетки; 4. Свойства среды, окружающей биокатализатор. Таким образом, изменение физиологии и метаболизма клеток в им- мобилизованном состоянии являются следствием не самой иммобилиза- ции, т. е. обездвиживания клеток, а изменением физико-химических па- раметров окружающей их среды. В этой связи возникает необходимость оценки физиологического состояния и метаболической активности иммобилизованных клеток. 70 Для анализа различных функциональных показателей клетки, таких как жизнеспособность, метаболическая и синтетическая активности, предлагаются методы, которые условно можно разделить на микробио- логические, морфо-цитохимические и биохимические. Микробиологические методы основаны на определение жизнеспо- собности клеток по их способности к воспроизводству. Клетки высева- ют, проращивают и подсчитывают образовавшиеся колонии. Эти спосо- бы длительны, трудоемки, требуют значительного числа повторностей и т. д. Морфо-цитологические методы, примером которых может служить окрашивание витальными красителями или идентификация фермента по окрашенным или электрон-плотным продуктам ферментативных реак- ций. В этом случае получают лишь качественную информацию. Биохимические методы подразумевают определение какой-либо ферментативной активности на целых клетках. Очевидно, что для определения общей метаболической активности иммобилизованных клеток необходим высокочувствительный метод, ко- торый может быть применен к любым свободным и иммобилизованным клеткам. К таким методам относят методы, позволяющие следить за по- треблением субстрата или образованием целевого продукта непосредст- венно в системе иммобилизованными клетками. Можно также контроли- ровать основной метаболизм иммобилизованных клеток по потреблению кислорода или энергетического субстрата. К недостаткам таких методов можно отнести то, что не во всех слу- чаях скорость потребления кислорода или энергетического субстрата мо- гут служить показателем активности основного метаболизма. Например, ряд бактерий содержат высокоактивную глюкозооксидазу. Потребление глюкозы и кислорода такими клетками не будет характеризовать их ос- новной метаболизм, а лишь свидетельствовать об активности содержа- щейся в них глюкозооксидазы. Наилучшим критерием влияния способа иммобилизации на клетки считается удельная синтетическая трансформационная продуктивность биокатализатора, которая определяется как количество целевого продук- та, образованного единицей объема (или массы) катализатора в единицу времени. Однако если в результате иммобилизации получается катализатор с низкой продуктивностью, невозможно выяснить, какая из стадий исполь- зованной методики оказала на клетки негативное воздействие. По мнению ряда исследователей в качестве критерия при оценке уровня жизнеспособности клетки можно использовать концентрацию 71 внутриклеточного АТФ, поскольку известно, что энергия приобретаемая живыми клетками сохраняется в полезной форме главным образом в ви- де АТФ. Показано, что уровень АТФ мгновенно снижается при умень- шении метаболической активности клетки. Одним из наиболее информативных методов определения АТФ яв- ляется биолюминесцентный, в основе которого лежит реакция, катализи- руемая люцеферазой светляков (люциферин – люцеферазная актив- ность). Уникальным свойством биолюминесцентной системы светляков яв- ляется то, что наряду с люцеферазой и люцифирином необходимым ком- понентом реакции является АТФ. Другой такой системы с потребностью в АТФ не обнаружено. Таким образом, использование перечисленных способов дает воз- можность в соответствии с поставленными целями определять жизне- способность иммобилизованных микробных биокатализаторов. 4.5. Промышленное использование иммобилизованных клеток микроорганизмов Биотехнология по определению Европейской биотехнологической федерации позволяет извлекать выгоду в технологических процессах из свойств организмов и методов биохимии, микробиологии, генетики и химической технологии. Промышленное внедрение иммобилизованных препаратов происхо- дит в тех процессах, где продукт реакции не может быть получен без их участия или где стоимость продукта настолько превышает стоимость ис- ходного сырья, что получаемая разница может окупить расходы на ис- пользуемые препараты и их иммобилизацию. Именно этим объясняется в последнее время повышенный интерес к процессам иммобилизации и использованию иммобилизованных ферментов клеток. Разработка технологических процессов с применением иммобили- зованных ферментов и клеток проводится в разных странах, в первую очередь, в Японии, Италии, США, Дании, Голландии. Современное промышленное производство продуктов микробного синтеза базируется на применение большого числа микроорганизмов различных таксономических групп, способных расти на различных сре- дах, в том числе и на простых синтетических. Весьма широк и круг ве- ществ, которые могут быть получены с помощью микроорганизмов. В 60-е и в особенности в 70-е годы прошлого века проводились ин- тенсивные исследования и прикладные разработки в области получения 72 и применения иммобилизованных биокатализаторов, причем в этом ка- честве использовались в основном ферменты или клетки микроорганиз- мов, имеющие в своем составе тот или иной «полезный» фермент. Представление о возможности использования микроорганизмов в различных областях дает таблица. Таблица 4.1. Возможности применения микроорганизмов 1. Утилизация отходов, контроль за состоянием окружающей среды 2. Получение энергии (биоэнергия) 3. Получение кормов, пищи, напитков, изделий бытовой химии 4. Замена традиционного сырья на нетрадиционные 5. Добыча минерального сырья (в т.ч. из моря) 6. Очистка и концентрация веществ 7. Получение физиологически активных соединений 8. Применение для биосинтеза, биотрансформации и биодеградации 9. Применение для целей технической микробиологии 10. Использование в здравоохранении, ветеринарии 11. Использование в биоэлектронике К 90-ым годам ХХ в. девять процессов с использованием иммобилизованных ферментов или клеток нашли крупномасштабное применение в ряде стран мира: 1. Производство глюкозо-фруктозных сиропов из глюкозы с использованием иммобилизованной глюкозоизомеразы. 2. Разделение рацемических смесей аминокислот с использованием иммобилизованной аминоацилазы. 3. Производство оптически активных D-аминокислот из аминокислот с использованием иммобилизованной гидантоиназы. 4. Синтез L-аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты с использованием иммобилизованных микробных клеток, содержащих аспартазу. 5. Синтез L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты с использова- нием иммобилизованных микробных клеток, содержащих фумаразу. 6. Ферментативная модификация антибиотиков с использованием иммобилизованной пенициллинамидазы. 7. Получение глюкозо-галактозных сиропов из молочной сыворотки с использованием иммобилизованной лактозы. 8. Получение диетического безлактозного молока с использованием иммобилизованной лактозы. 9. Получение глюкозо-фруктозных спиртов из сахарозы с использо- ванием иммобилизованной инвертазы. 73 Ряд процессов находятся в стадии отработки и обсуждения целесо- образности их крупномасштабного применения. К ним в первую очередь относятся: 1. Получение глюкозы из частичных гидролизатов крахмала с ис- пользованием иммобилизованной глюкоамилазы. 2. Получение глюкозы и (или) этанола из целлюлозы с использова- нием связанной целлюлазы. В технологическом плане преимущества иммобилизованных клеток по сравнению с иммобилизованными ферментами и свободными клетка- ми подобны отмеченным ранее: – удешевление биокатализатора вследствие отсутствия необходимо- сти выделения индивидуальных ферментов; – возможность осуществления многоступенчатых процессов, в т. ч. тех, при которых требуется регенерация кофакторов; – сохранение естественного микроокружения и конформационной стабильности ферментов внутри клеток и, следовательно, более высокого выхода по активности ферментов; – возможность реактивировать иммобилизованные клетки (напри- мер, меняя состав питательной среды); – возможность увеличения активности биокатализатора на основе иммобилизованных клеток за счет выбора фазы роста клеток перед им- мобилизацией. Иммобилизованные клетки можно использовать практически во всех известных сегодня биотехнологических процессах для получения ценных продуктов. Мы не будем в деталях рассматривать все имеющиеся к настоящему времени технологические процессы, но на ряде примеров, тем более, что появились разработки их проведения с участием иммобилизованных клеток, остановим свое внимание. Получение спиртов и кетонов. В настоящее время идет переоценка сырьевых ресурсов, вместе с этим происходит и переоценка возможно- стей применения биокатализаторов. Растительная биомасса (лигноцеллюлоза), отходы промышленной или с/х переработки могут быть превращены в этанол, бутанол, ацетон и др. продукты путем прямой конверсии с помощью микроорганизмов. В этом случае применяются микроорганизмы, которые используют целлю- лозу и гемицеллюлозу в качестве источника углерода (например, бакте- рии рода Clostridium). Но медленная скорость этих процессов и малый выход целевых продуктов затрудняют их внедрение в широкую про- мышленную практику. 74 Растительная биомасса, в первую очередь древесная, выращиваемая на специальных плантациях, а также отходы и вторичные продукты сбо- ра и переработки древесины, лесохимической, льноперерабатывающей и др. отраслей промышленности, с/х отходы, муниципальные отходы в ре- зультате кислотного или ферментативного гидролиза превращаются в сахара (глюкозу и ксилозу). Глюкоза может быть получена также путем ферментативного гидролиза крахмального сырья, основой которого слу- жат зерновые культуры и картофель. Еще одним источником сахаров (фруктозы) является инулин, содержащийся в топинамбуре. Фруктоза получается гидролизом инулина при использовании фермента инулина- зы. Сахара содержатся в мелассе – вторичном продукте сахарной про- мышленности (остается после кристаллизации сахарозы). Сахара являются углеродным субстратом для широкого круга мик- роорганизмов, использование которых в биотехнологии позволяет полу- чить множество разнообразных продуктов как тонкого, так и тяжелого микробиологического синтеза. Весьма важной задачей тяжелого микробиологического синтеза в первую очередь является получение топливного этанола. Необходимость существенного расширения производства этанола связано с его приме- нением в качестве моторного топлива. Этанол чаще используется в сме- сях с бензином (газохол), однако после модификации двигателей его можно использовать и в чистом виде. Наиболее развито производство топливного этанола в Бразилии, бо- гатой запасами растительной биомассы, но не имеющей месторождений нефти и удовлетворяющая при этом 90 % транспортных потребностей за счет газохола. Интересная идея применения этанола реализуется в США. Этанол используется в виде 5 % смеси с бензином вместо тнтраэтилсвинца, что улучшает экологическую ситуацию, т. е. предотвращает загрязнение сре- ды соединениями свинца, выбрасываемы с выхлопными газами. Из этанола можно осуществить химический синтез этилена (далее полиэтилена), а также бутадиена (далее каучука). Кроме того, с помощью специальных катализаторов (цеолитных) из этанола можно получить уг- леводороды – аналоги бензина. Перспективы увеличения производства этанола безусловно связаны с широким применением иммобилизованных клеток дрожжей Sacharo- myces cerevisiae и др. дрожжей сахаромицетов, сбраживающих лактозу (этанол из отходов переработки молока) и др. бактерий. Если для промышленных процессов на основе свободных клеток дрожжей производительность по этанолу равна 1–10 г/л·ч и время полного 75 сбраживания около 5–6 ч при концентрации сахаров 5–10 %, то для иммо- билизованных дрожжей эти параметры составляют примерно 50 г/л·ч, 1 ч и 15–30 %, а для иммобилизованных бактерий производительность уве- личивается до 100 г/л·ч, хотя концентрация сахаров не превышает 15 %. Важно отметить, что эксплуатация иммобилизованных биокатализаторов длится в ряде случаев до 12 месяцев. Первое в мире опытно-промышленное получение этанола (сырье – 15 % раствор тростниковой мелассы) с помощью иммобилизованных дрож- жей осуществлено в Японии (производительность по этанолу – 20 г/л·ч. Другая японская фирма с такими же иммобилизованными клетками полу- чает в сутки 2 400 л этанола (субстрат – 20 % раствор глюкозы). Получают и другие продукты относящиеся к упомянутому классу соединений. Так, глицин получают, используя также иммобилизованные клетки Sacharomyces cerevisiae. n-Бутанол, изопропанол и ацетон получают из сахаров с помощью бактерий Clostridium sp.. Указанные вещества находят применение в ка- честве добавок к бензину, при производстве пластификаторов, гидравли- ческих жидкостей, смол, пластмасс и т. д. В настоящее время наиболее развито производство n-бутанола. Тем не менее, ферментативное производство n-бутанола сократилось, по- скольку более дешево получать его из нефтехимического сырья по срав- нению с крахмалом и мелассой. Но с исчерпыванием запасов нефти вни- мание вновь будет обращено к возможностям микробиологического про- изводства. Получение органических кислот. Органические кислоты и их соли широко используются в пищевой, фармацевтической, текстильной, ко- жевенной, химической, металлургической и др. отраслях промышленно- сти. Многие кислоты можно производить как химическим, так и микро- биологическим путем. Первый путь более предпочтителен для техниче- ских нужд, второй – для целей пищевой промышленности и медицины. Источником углерода для микроорганизмов – продуцентов органи- ческих кислот являются углеводы, органические кислоты, спирты, алка- ны. Кислоты часто секретируются клетками, когда рост культуры в силу определенных причин тормозится и переходит в стационарную фазу. Хотя свойство продуцировать различные органические кислоты ши- роко распространено среди микроорганизмов, на практике для их полу- чения используют специальные штаммы, не синтезирующие побочные продукты. В настоящее время семь органических кислот производится в про- мышленных масштабах, причем лимонную, глюконовую, кетоглюконо- 76 вую, итаконовуюи яблочную кислоты получают только микробиологи- ческим путем, а молочную и уксусную – химическими и микробиологи- ческими способами. Хорошие результаты по технологическому применению иммобили- зованных клеток продемонстрированы при получении яблочной кисло- ты из фумарата. В 1974 г. японская фирма приступила к промышленно- му выпуску яблочной кислоты с помощью иммобилизованных клеток Brevibacterium разных видов. В итоге появилась возможность с помо- щью однократно приготовленной партии иммобилизованного биоката- лизатора получить до 100 т яблочной кислоты (в последующее время ежегодно производится до 180 т). Продолжительность функционирова- ния иммобилизованных клеток составляет около 60 суток. С помощью иммобилизованных микроорганизмов налажено полу- чение глюконовой кислоты (продолжительность функционирования иммобилизованных клеток достигает 200 дней, продуктивность 10 г/л·ч). Получение аминокислот. Растения и микроорганизмы способны сами синтезировать все нужные им аминокислоты, у человека синте- зируется лишь 12 из 20 аминокислот, необходимых для жизнедеятель- ности. Восемь должны поступать с пищей и получили название неза- менимых: валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, лизин, фени- лаланин, триптофан. Аминокислоты используют в качестве вкусовых добавок, в пар- фюмерной, фармацевтической промышленностях и т. д. Микробиологическому синтезу наряду с другими способами (хи- мические, ферментативные методы) аминокислот в настоящее время отдается предпочтение, причем широко используются иммобилизо- ванные клетки. С наибольшим успехом последние применяются при получении L-аспаргиновой кислоты или фумарата аммония. Процесс основан на использовании иммобилизованных клеток E. coli. Промышленный процесс получения L-аланина и L-аспаргиновой кислоты на основе иммобилизованных клеток Pceudomonas docunhae основан японской фирмой. Ведутся лабораторные разработки по получению иммобилизован- ных клеток – продуцентов других аминокислот: аргинина, триптофана, фенилаланина и т. д. Получение витаминов. Витамины получают как с помощью хими- ческого синтеза, так и микробиологическим путем. Иммобилизован- ные клетки микроорганизмов для получения витаминов и промежуточ- ных продуктов их синтеза опробованы пока только на лабораторном уровне. 77 Получение антибиотиков. Применение иммобилизованных биока- тализаторов позволило достичь больших успехов в области получения антибиотиков. Важность и масштабы производства антибиотиков обу- словлены их применением в медицине и ветеринарии как противомик- робных и противоопухолевых препаратов. Иммобилизованные клетки применяют как для биосинтеза собст- венно антибиотиков (в качестве вторичных метаболитов), так и для получения полусинтетических антибиотиков. Например, существенная доля 6-аминопеницилановой кислоты в России выпускается с помо- щью иммобилизованных микроорганизмов. Аналогично, в промыш- ленном масштабе указанную кислоту получают в Японии (в обоих случаях иммобилизуют клетки E. coli). Получение углеводов. Производство разнообразных углеводов: мо- но-, ди-, олигосахаридов и их производных, а также полисахаридов яв- ляется важной биотехнологической проблемой, решаемой с помощью иммобилизованных клеток (о получении глюконовой кислоты и неко- торых других углеводах мы уже говорили). Получаемые глюкозо- фруктозные смеси применяются при производстве тонизирующих на- питков, мороженого, кондитерских и хлебобулочных изделий, консер- вированных фруктов и т. д. В качестве биокатализаторов для производства этих сиропов ис- пользуют иммобилизованную глюкозоизомеразу или микробные клет- ки, обладающие глюкозоизомеразной активностью. Использование иммобилизованных клеток, как показала практика, более экономично вследствие высокой стабильности внутриклеточного фермента и от- сутствия необходимости его предварительного выделения. Важную роль играют процессы микробиологической окислитель- ной или восстановительной трансформации углеводов. Например, к окислительным процессам относится превращение глицерина в диок- сиацетон (используется для придания изделиям из целлюлозных воло- кон несминаемости, устойчивости и т. д.; производные применяются как консерванты, фунициды и др.). Известны методы реализации про- цесса с помощью иммобилизованных клеток. Большое практическое значение имеют процессы гидролиза лактозы, сахарозы, рафинозы и целлобиозы. Гидролиз лактозы с получением глюкозы и галактозы и гидролиз сахарозы с получением глюкозы и фруктозы являются хорошими при- мерами использования иммобилизованных биокатализаторов. Кроме того, лактоза содержится в молоке и молочной сыворотке, причем часть людей не может употреблять молоко именно из-за наличия 78 в нем лактозы. Технология гидролиза лактозы основана на применении иммобилизованных грибных или дрожжевых ферментов. Тем не менее уже созданы промышленные установки для гидролиза лактозы с помо- щью иммобилизованных клеток, обладающих β-галактозидазной актив- ностью (Bacillus sp.). Инвертный сахар (почти эквивалентная смесь глюкозы и фруктозы) получают из сахарозы с помощью иммобилизованного фермента инвер- тазы на промышленных установках в России и США. Рафиноза, или галактозилсахароза, является наиболее распростра- ненным после сахарозы олигосахаридом, встречающимся в свободном виде в сахарной свекле и других растениях (при ферментативном гидро- лизе рафинозы образуется галактоза и сахароза). Американская компа- ния использовала для превращения рафинозы иммобилизованный биока- тализатор. Гидролиз целлобиозы осуществлен иммобилизованными микроор- ганизмами с целлобиозной активностью. К микробным продуктам, синтезируемым в больших количествах, относятся полисахариды – декстраны, маннаны, ксантаны. Для их полу- чения используются, как правило, свободные клетки. Однако имеется опыт применения иммобилизованных клеток. Декстраны служат заменителями плазмы крови, модифицированные декстраны используются в медицине, поперечно сшитые декстраны (се- фадексы) применяются в качестве молекулярных сит для гельфильтра- ции. Молекулы декстранов построенные из остатков глюкозы, имеют не- большое количество ветвлений. Ксантаны – это смолы, состоящие из остатков глюкозы, манозы и глюкуроновой кислоты, некоторые из которых имеют ацетильную (СН 3 СО) или пируватную (СН 3 СОСО) группы. Ксантаны добавляют ко многим пищевым продуктам в качестве загустителей и стабилизаторов, используют как красители в текстильной промышленности и полигра- фии, в производстве косметических и фармацевтических препаратов, а также при бурении нефтяных скважин в качестве добавки к буровому шламу, поскольку они обладают свойствами ПАВ. Получение микробных ПАВ. МПАВ используются в различных об- ластях. Но перспективы их использования связаны с проблемами утили- зации и окисления микроорганизмами углеводородов нефти. МПАВ – эмульгаторы могут быть использованы в качестве детергентов (моющих средств) для очистки нефтеналивных емкостей, т. к. они более биодегра- дабельны по сравнению с синтетическими, для очистки морских нефтя- ных загрязнений, в реках и почвах и т. д. Кроме того, введение микроор- 79 ганизмов-продуцентов ПАВ повышает отдачу нефтеносных пластов. В последнем случае речь идет о жизнедеятельности закрепленных микро- организмов на поверхности твердых частиц или жидкой пленке. Поло- жительный опыт такого применения уже имеется. Получение ферментов. В зависимости от области применения к ферментам предъявляют различные требования: чистота, состав, источ- ник получения. Наиболее доступным и практически неограниченным ис- точником ферментов в промышленном масштабе являются микроорга- низмы, из которых возможно выделить любые из известных ферментов, создать условия для регуляции их биосинтеза, причем некоторые фер- менты (целлюлазы, гемицеллюлазы) могут быть получены только с по- мощью микроорганизмов. С точки зрения применения иммобилизованных клеток речь может идти в первую очередь о получении внеклеточных ферментов, среди ко- торых промышленно важными являются амилазы, целлюлазы, гемицел- люлазы, пектаза, лактаза, липаза, протеаза. Внутриклеточные ферменты – глюкооксидаза, каталаза, инвертаза и др., выделение которых требует разрушения клеточной стенки микроорганизма-продуцента, получать с помощью иммобилизованных микроорганизмов нецелесообразно. Примеры ферментов, полученных с помощью иммобилизованных клеток микроорганизмов даны в таблице (4.2.) Таблица 4.2 Примеры ферментов, полученных с помощью иммобилизованных клеток микроорганизмов Фермент Субстрат Микроорганизмы Носитель α-Амилаза Мясной экстракт, рас- творимый крахмал Bacillus sabtilis ПААГ α-Амилаза Дрожжевой экстракт, растворимый крахмал B. amyloli- quefaciеus Амберлит, карраги- нан α-Амилаза Дрожжевой экстракт, триптон E.coli Пенополиуретан, пеносиликон Целлюлазы Целлобиаза, целлюла- за Clostridium ther- mocellum Криогель, поливи- ниловый спирт, Целлюлазы Жидкая питательная среда Sporotrichum sp. Полиэфирные во- локна Лигнин- пероксидаза Глюказа Phanerochaete chrysosporium Нейлоновая ткань, полиуретан Протеаза Жидкая питательная среда B. lichenifоrmis Анионообменная смола, ПААГ и др. Период непрерывного функционирования установок по биосинтезу приведенных ферментов составляет обычно 5–15 суток. В некоторых 80 случаях, например для лигнинпероксидазы и полигалактуразы, выход ферментов в реакторе увеличивается в 5–10 раз по сравнению с их био- синтезом с помощью свободных клеток. Этот эффект связан с увеличе- нием удельного содержания клеток в реакторе при применении в иммо- билизованном виде. Получение алкеноксидов. На примере алкеноксидов (этилена и про- пилена) можно проиллюстрировать возможности иммобилизованных клеток для получения веществ, служащих сырьем в производстве поли- меров, лакокрасочных покрытий и клеев. Химический синтез этих ве- ществ является дорогостоящим и энергоемким. Относительно недавно получение оксидов алкенов было предложе- но осуществить с помощью системы, состоящей из оксиредуктаз микро- организмов – хлорпероксидазы, хлоргидринэноксидазы и глюкозо-2 ок- сидазы. В данном случае вместо трех биокатализаторов (ферментов) не- обходим один –клетка. Дополнительное упрощение состоит в реализации процесса на основе иммобилизованных клеток. Используются метано- форные бактерии и др. Продуктивность процессов получения алкеноксидов составляет обычно 0,2–0,6 г на 1 г иммобилизованных клеток, период непрерывного функционирования реактора – до 10 суток. Утилизация отходов. Применение иммобилизованных клеток для утилизации отходов – является весьма злободневной и острой пробле- мой. Большую роль в очистке воды играют микроорганизмы – деструк- туры пестицидов, ПАВ, нефтяных загрязнений, других ксенобиотиков. В основе биотехнологии очистки сточных вод лежат два подхода: в одном используют аэробные, в другом – анаэробные микроорганизмы. В аэробной очистке применяют активный ил (биопленку), представляющий собой скопление разнообразных микроорганизмов, видовой состав кото- рых регулируется конкретными условиями. В большинстве развитых стран мира используется аэробная очистка. Аэробный способ очистки сточных вод основан на использовании двух систем: аэротенка и вторичного отстойника. Аэротенк – это откры- тое сооружение, через которое пропускается аэрируемая сточная вода и суспензия активного ила. В отстойнике – осуществляется доочистка во- ды. Применение активного ила относится в данной технологии к мето- дам, связанным с использованием иммобилизованных клеток. Однако существуют промышленные методы использования актив- ного ила, где иммобилизацию осуществляют в «чистом виде». В этом случае создаются биофильтры, представляющие собой проточные емко- 81 сти с циркуляцией. Клетки прикреплены к поверхности пористого носи- теля (керамика, щебень, стекловолокно, синтетическое волокно и т. д.). Глубина и скорость очистки сточных вод в биофильтрах выше, чем в аэротенках в 10–15 раз. Сточные воды перед биофильтром должны быть очищены от взвешенных частиц для предотвращения их быстрого забивания и заиливания.Процессы биологической очистки иммобилизо- ванными клетками ускоряются по сравнению со случаем использования свободных клеток от 2 до 20 раз. В лучших случаях время очистки со- ставляет несколько часов. Содержание органических примесей в стоках уменьшается от 10 до 1000 раз. Анаэробные способы очистки применяются, как правило, для отра- ботки высококонцентрированных стоков и осадков, содержащих боль- шое количество органических веществ. Процесс брожения осуществля- ется в метантенках. Анаэробное превращение органических веществ осуществляется в четыре этапа: фаза гидролиза (расщепление) биополимерных молекул (белков, липидов, полисахаридов и др.) на более простые; фаза фермен- тации мономеров до низших кислот и спиртов, аммиака, сероводорода; ацетогенная фаза (образование Н 2 , СО 2 , ацетата); последняя метаноген- ная фаза ведущая к образованию конечного продукта – метана. Кроме метана, продуктом является СО 2 (их смесь образует биогаз). Получение и использование метана при сбраживании органических отходов, наряду непосредственно с очисткой, является одним из наиболее перспективных путей решения экологических и энергетических проблем. Эффективность действия метантенков с иммобилизованными клет- ками в 2,5–3 раза выше, чем со свободными. Недостатком процесса с иммобилизованными клетками является то, что, они приспособлены для переработки растворимой органики. Поэтому они удобны для обработки сточных вод предприятий пищевой промышленности (молокоперераба- тывающих, спиртовых заводов и др.). Отдельной задачей, весьма важной, является биодеградация слож- ных смесей углеводородов и их производных в средах, загрязненных нефтью. Сточные воды нефтяной промышленности обычно очищают биологическим способом. Очистку морской поверхности также проводят путем ее биодеградации. Микроорганизмы в этих условиях находятся в иммобилизованном состоянии на поверхности капель. Созданы опытные установки колонного типа с иммобилизованными клетками – деструктурами, через которые пропускают загрязненную нефтепродуктами воду. 82 Еще одна острая экологическая проблема – удаление из воды метал- лов (кадмия, свинца, цинка, урана, плутония). Биотехнологический принцип решения этой проблемы состоит в применении иммобилизо- ванных клеток, аккумулирующих эти металлы. Промышленные установки по извлечению металлов из источников вод функционируют в США, Венгрии. Очистка воды является чрезвычайно крупномасштабным процессом, где необходимость и возможность применения иммобилизованных кле- ток полностью доказана. Насущной задачей является использование био- технологических подходов в процессах отделения и концентрирования металлов из руд, которая относится к области биотехнологии. Кроме это- го, к этой области относится обогащение и переработка руд и угля, экс- тракция остаточных количеств нефти из иссякающих месторождений. Биогеотехнология. В основе биотехнологии извлечение металлов из руд, концентратов, горных пород лежат химические процессы, осущест- вляемые микроорганизмами или их метаболитами. В большинстве слу- чаев клетки микроорганизмов используют в иммобилизованном состоя- нии. Для выщелачивания металлов из сульфидных и смешанных руд и концентратов, из отходов пирометаллургического производства и удале- ния серы из угля используют Thiobaсillus ferroxidans и др. Микроорганизмы (бактерии, дрожжи) и их метаболиты используют также для извлечения химических элементов из силикатных и карбонат- ных руд, для выщелачивания золота. К процессам, непосредственно катализируемых бактериями отно- сится окисление железа: 4FeSO 4 + O 2 + 2H 2 SO 4 → 2Fe 2 (SO 4 ) 3 + 2H 2 O и окисление серы: S 8 + 12O 2 + 8H 2 O → 8H 2 SO 4 Ряд минералов окисляется некоторыми выщелачивающими микро- организмами, например пирит: 4FeS 4 + 15О 2 + 2Н 2 О → 2Fe 2 (SO 4 ) 3 + 3Н 2 SO 4 и фалерит: ZnS + 2O 2 → ZnSO 4 83 Ион трехвалентного железа служит окисляющим агентом, перево- дящим в раствор многие минералы, например халькоцит: CuS + 2Fe 2 (SO 4 ) 3 → 2 CuSO 4 + 4FeSO 4 + S o и уранит: 4UO 2 + Fe 2 (SO 4 ) 3 → 4UO 2 SO 4 + 2FeSO 4 Выщелачивание, происходящее при участии иона трехвалентного железа, который образуется в результате жизнедеятельности бактерий, называют «непрямой» экстракцией. В настоящее время бактериальное выщелачивание, известное как биогидрометаллургия или биоэкстрактивная металлургия, применяют в промышленных масштабах для перевода в растворимую форму меди и урана (выщелачивание отвалов и бедных руд); используют ацидофиль- ные биобактерии. Промышленное применение нашел также процесс удаления серы из угля, интенсификация добычи нефти. Процесс удаления серы из угля предусматривает предваритель- ную обработку бактериями Thiobacillus ferrooxidans, приводящую к окислению значительной доли серы (в виде пирита) до серной кислоты (60–98 % за 7–10 суток). Обработку угля проводят открытым спосо- бом, но ведется поиск методов введения микроорганизмов в пласты угля. Интересен способ использования иммобилизованных микроорга- низмов для увеличения добычи нефти. Около 50 % добываемой традици- онными методами нефти остается в капиллярах пород месторождений. Интенсифицировать добычу нефти можно микроорганизмами и продук- тами их жизнедеятельности. С этой целью в скважину вводят несколько сот метров посевного материала, содержащего раствор мелассы, что приводит к увеличению выхода нефти. Этот эффект обусловлен влияни- ем продуктов жизнедеятельности микроорганизмов: газы (СО 2 , СН 4 , N 2 , Н 2 ) уменьшают вязкость и увеличивают давление, полисахариды (альги- нат, декстран, ксантан и др.) и ПАВ (глицериды, липиды и др.) умень- шают поверхностное натяжения на фазе раздела нефть – вода, низкомо- лекулярные растворители (спирты, китоны) снижают вязкость, а органи- ческие кислоты (муравьиная, масляная, молочная и др.) увеличивают проницаемость пород. Выход увеличивается на 16–20 %. Биологические методы добычи ископаемых экономически выгодны. Эти методы позволяют разрабатывать бедные и сложные по составу ме- сторождения, осваивать глубинные места залегания, обеспечить ком- 84 плексную утилизацию сырья, исключить загрязнение окружающей среды элементами сырья. Проведение анализов. На основе иммобилизованных клеток, как уже отмечали, создан ряд биоселективных электродов. В одном случае осно- вой (датчик) служат селективные для продукта реакции электродов (см. раздел 3.5). В качестве сенсора на определенные соединения служат им- мобилизованные клетки. Другой принцип анализа с помощью иммоби- лизованных клеток основан на использовании термисторов. Прибор с высокой чувствительностью регистрирует изменение температуры, со- провождающие метаболические процессы микроорганизмов при наличии соединения в анализируемой пробе. Число использования иммобилизованных клеток микроорганизмов в анализе растет. Некоторые примеры приведены в табл. 4.3. Таблица 4.3 Примеры применения иммобилизованных клеток в анализе Микроорганизм Носитель Датчик Анализируемое вещество Azotobacter vinelandii Диализная мембрана NH 3 – эл. Нитрит Bacterium cadaveris — // — — // — L-аспартат Brevibacterium lactofer- mentum Целофановая мембрана О 2 – эл. Сахара Clostridium acidiurici Диализная мембрана NH 3 – эл. L-серин C. butiricum Ацетилцеллюлозный фильтр Рt – эл. Муравьиная кислота Escherichia coli Целофановая мембрана СО 2 – эл. Глутаминовая кислота Leusonostoc mes- enteraides Ацетилцеллюлозный фильтр О 2 – эл. Фенилаланин Methilomonas flaqellata — // — О 2 – эл. Метан Saccharomyces cervisiae ПААГ термистор Арсенат — // — ПААГ — // — Глюкоза Следует отметить, что чувствительность анализа составляет, обыч- но, десятки и сотни микромолей анализируемого вещества в одном мил- лилитре, время анализа – несколько минут, объем анализируемой пробы – десятки микролитров. 4.6.Характеристика реакторов с иммобилизованными клетками Системы с иммобилизованными клетками должны обеспечить тех- нологические и экономические преимущества по сравнению с традици- 85 онными процессами на основе свободных клеток. Важную роль в реа- лизации таких преимуществ играет аппаратурное обеспечение про- цессов с иммобилизованными клетками, т. е. конструкции реакторов, где осуществляются биокаталитические процессы. Система с ограничивающей ее поверхностью и протекающими в ней биохимическими процессами называется реактором (биореакто- ром). Реакторы могут работать в периодическом режиме, периодиче- ском режиме с доливом субстрата, полупериодическом и непрерыв- ном проточном режимах. Высокая концентрация иммобилизованных клеток в рабочем объеме требует высоких скоростей массопередачи, особенно для аэробных процессов. В этих условиях необходимо обеспечение кле- ток кислородом, который является лимитирующим в данном случае фактором скорости образования целевого продукта. Это приводит к необходимости интенсивного перемешивания среды в рабочем объе- ме. Механическая прочность иммобилизованных клеток часто недос- таточна, поэтому ее следует компенсировать разработкой реактора соответствующей конструкции. Исходя из этого, реакторы с иммоби- лизованными клетками имеют свои особенности, их классифицируют по относительному движению частиц твердой фазы (биокатализато- ра). Выделяют два типа: с отсутствием или наличием движения твер- дой фазы. Это довольно условная классификация. Рассмотрим некоторые типы реакторов (рис. 4.1). Реактор периодического действия: представляет собой емкость с мешалкой, в которую помещен биокатализатор и раствор субстрата (питательная среда). После окончания процесса, иммобилизованные клетки отделяют от продуктов центрифугированием или фильтрацией, и цикл начина- ется вновь. Недостатки:низкая производительность, большая потеря биока- тализатора (хотя для свободных клеток наиболее распространен). Проточный реактор с перемешиванием отличается тем, что по- сле каждого каталитического цикла не происходит отделение биока- тализатора, субстрат периодически доливается, периодически отде- ляются продукты. Эффективность выше, чем у периодического. Проточные реакторы могут иметь неподвижный или перемеши- ваемый слой катализатора. В первом реакторе иммобилизованные клетки упакованы в колонны, образуя неподвижный слой. Субстрат проходит через слой биокатализатора сверху или снизу. 86 Рис.4.1.Типы реакторов: а – периодического действия; б – проточный с перемешиванием; в – с неподвижным слоем (проточный); г – серия реакторов с неподвижным слоем; д – с рециклом; е – секционный с неподвижным слоем; ж – наклонный; з – горизонтальный с неподвижным слоем; и – проточный с взвешенным слоем; к – секционный проточный с взвешенным слоем Слой иммобилизо- ванных клеток S Р S Р Рециркуляция Слой иммобилизо- ванных клеток Иммобилизованные клетки Р Р S S Слой иммобилизо- ванных клеток S S Слой иммоби- лизованных клеток Жидкая фаза Газ Газ S Р Р S Взвешенный слой иммобилизованных клеток S Р а б в г д е ж з и к 87 Концентрация субстрата максимальна на входе, а продуктов – на выходе из реактора. Реакторы такого типа нашли промышленное применение, в частности для очистки сточных вод, получения ук- сусной, яблочной аспарагиновой кислот и др. Из реакторов первого типа следует отметить еще реактор с неподвижным слоем с рецир- куляцией. Проточные реакторы с перемешиваемым слоем биокатализатора могут быть с взвешенным слоем, а также с движущимся фиксиро- ванным слоем. Реакторы с взвешенным слоем характеризуются бы- стрым поступлением субстрата снизу для поддержания взвешенного состояния биокатализатора. Но при этой скорости поступления не должны уноситься частицы с входящим потоком жидкости. В дан- ном случае реализуется режим, промежуточный между полным пе- ремешиванием (как в проточном растворе с перемешиванием) и от- сутствием перемешивания в неподвижном реакторе. Относительная скорость движения жидкости и гранул в реакто- ре со взвешенным слоем невелика, что невыгодно с точки зрения обеспечения биокатализатора субстратом. Более удобными считают- ся реакторы с движущимся фиксированным слоем. Реакторы с упо- рядочным расположением биокатализатора бывают пластинчатые, кассетные, с вращающимися дисками. При использовании иммобилизованных живых клеток критиче- ским фактором является диффузия газов по сравнению с другими компонентами реакции. Газ, выделяемый живыми клетками, может захватывать частицы (иммобилизованные клетки) и вызывать их всплывание, что приводит к снижению каталитической активности биокатализатора. Для избежания этого явления реактор модифици- руется. Например, в колончатом реакторе на расстоянии 2–4 см ниже выпускного патрубка раствора устанавливается металлическая сетка с соответствующим размером ячеек. Сетка жестко прикрепляется к стенкам реактора для предотвращения ее поднятия. Мембранные реакторы – представляют собой аппарат, в кото- ром одновременно осуществляется два процесса – управляемое культивирование свободных организмов в объеме реактора и удале- ние продуктов (и замена их субстратом) с помощью мембранного модуля. По типу мембраны разделяются на фильтрационные и диализ- ные: в первом случае массоперенос через мембрану осуществляется за счет разницы давления по обеим сторонам мембраны; во втором, за счет градиента концентраций. 88 Материал фильтрационных мембран может быть различным – кера- мические и металлокерамические фильтры, полимерные матрицы, ионо- обменные мембраны. Разработаны мембранные реакторы, которые характеризуется при- крепленными клетками к мембране или находящимися внутри самой мембраны. Чаще всего для этого используют в качестве мембраны полые волокна, на поверхности которых закреплены клетки и через них посту- пает субстрат, и отводятся продукты. Мембранные реакторы применяют для получения ферментов, анти- биотиков, витаминов, аминокислот, органических кислот, этанола, аце- тона и т. д. Мембранные реакторы относятся к оборудованию нового поколе- ния. |