Учебнометодический комплекс по учебной дисциплине иммобилизованные клетки и ферменты для специальностей
 Скачать 1.14 Mb.
|
|
Задание.Определитевремя, необходимое для проведения иммоби- лизация клеток водоросли указанными способами. Определите выделя- ются ли клетки в среду при легком перемешивании препаратов иммоби- лизованных гелей. РАБОТА № 2 Определение жизнеспособности иммобилизованных клеток Chlorella Вводные пояснения Процедура иммобилизации зачастую приводит к гибели основной массы клеток, обусловленной токсическим воздействием исходных реа- гентов (мономер, концентрированных растворов хлоридов кальция и ба- рия, органических растворителей и т.п.) или воздействие высоких темпе- ратур. По этой причине зачастую процедура иммобилизации произво- дится в условиях снижения метаболической активности клеток (пониже- ние температуры до 0 0 С и ниже). Однако даже в этих условиях возможна гибель определенного количества исходного материала в приготовлен- ных препаратах. Контроль жизнеспособности организмов, включенных в гель, – важная технологическая задача. В простейшем случае для опре- деления жизнеспособности производится разрушение геля (химическое или механическое) с последующим определением способности освобож- денных клеток к росту. Зачастую такая процедура неприемлема, поскольку предполагается разрушение препарата, которое, в свою очередь, приводит к поврежде- нию клеток. Кроме того, определение таким методом жизнеспособности клеток требует значительных затрат времени. Гораздо точнее и оперативнее можно оценить жизнеспособность иммобилизованных клеток по их метаболической активности без разру- шения препарата. Определение метаболической активности производит- ся различными способами: окрашиванием, определением активности ды- хания и фотосинтеза, способности к биосинтезу различных соединений. Окрашивание флуоресцеиндиацетатом (ФДА) часто используют для определения жизнеспособности клеток. После абсорбции ФДА при на- личии эстеразной активности он деацетилируется и становится флуорес- цирующим. Окрашенные клетки рассматривают с помощью микроскопа, снабженного УФ- источником света. 128 Увеличение веса клеток является хорошим показателем их жизне- способности. Сухой вес иммобилизованных клеток рассчитывают, исхо- дя из предположения, что масса полимерной матрицы не изменяется. О жизнеспособности клеток судят также по измерению интенсивно- сти их дыхания, которое можно определять в течение инкубации через различные промежутки времени. Измерения проводят с помощью кисло- родного электрода Кларка по стандартной методике. В данной работе определение жизнеспособности клеток основано на регистрации фотосинтетического поглощения СО 2 из среды, скорость ко- торого оценивается по изменению (подщелачиванию) среды. Предлагае- мый способ характеризуется простотой и высокой чувствительностью и позволяет проводить экспрессную оценку жизнеспособности иммобили- зованных клеток водорослей без разрушения геля. Материалы и оборудование: рН-метр, электроды для определения рН, магнитная мешалка, секундомер, осветитель, суспензии свежесоб- ранных и после 7 дневного хранения клеток Chlorella в холодильнике, препараты иммобилизованных клеток Chlorella, хранящиеся 7 дней по- сле иммобилизации. Ход работы Суспензию клеток Chlorella, содержащую 300 мг сыро- го веса свежесобранных водорослей в 100 мл дистиллированной воды, поместить в измерительную ячейку для рН-метрии, Сосуд с суспензией экранируется от света черной бумагой. Измерение рН среды производит- ся при интенсивном перемешивании суспензии с помощью магнитной мешалки. После установления показаний прибора на постоянном уровне и регистрации величины рН 0 необходимо снять светонепроницаемый эк- ран и включить подсветку и секундомер. Через каждые 3 минуты регист- рируются величины среды (рН i ) и определяют скорость подщелачивания среды (V) по формулам: V = ∆pH/(t i – t i-1 ), ∆рН = (pH i – pH i-1 ) где pH i и pH i-1 – значения рН среды в моменты времени t i и t i-1 , соответст- венно; (t i - t i-1 ) = 3 мин. Произвести аналогичные измерения, поместив в измерительную ячейку рН-метра суспензию клеток водоросли, хранящуюся в холодиль- нике 7 дней, а затем – препараты иммобилизованных клеток Chlorella, содержащие эквивалентное количество водорослей. Результаты измере- ний занести в таблицу: 129 Суспензия клеток Chlorella Иммобилизованные клетки Свежесобранные после 7 дней хранения в альгинате кальция в агар-агаре Время с начала освеще- ния, мин ∆рН V, ед.рН/мин ∆рН V, ед.рН/мин ∆рН V, ед.рН/мин ∆рН V, ед.рН/мин 0 3 6 9 Задание. Сравните скорости фотоиндуцированного подщелачивания среды суспендированными и иммобилизованными клетками водоросли. Постройте графики зависимостей скорости подщелачивания среды от времени с начала освещения водорослей для суспензий и иммобилизо- ванных препаратов. Определите, как влияет хранение водорослей на ско- рость подщелачивание среды. Основываясь на величинах скорости фо- тоиндуцированного изменения рН среды, сделайте выводы о сохранении жизнеспособности клеток иммобилизованнных в альгинатном и агаро- вом гелях. 130 3. КОНТРОЛЬ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ СТУДЕНТОВ Задания для самоконтроля 1. Дайте определение. Иммобилизация – это ….. 2. Дайте определение. Биотрансформация – это ….. 3. Дайте определение. Пермеабилизация – это ….. 4. Дайте определение. Биотестирование – это ….. 5. Перечислите преимущества иммобилизованных ферментов. 6. Перечислите преимущества иммобилизованных клеток по сравнению с иммобилизованными ферментами. 7. Перечислите требования, предъявляемые к материалам, которые ис- пользуются в качестве носителя для иммобилизации. 8. Приведите примеры полисахаридных природных носителей 9. Приведите примеры белковых и липидных носителей. 10. Приведите примеры синтетических органических носителей. 11. Приведите примеры неорганических носителей. 12. Что из перечисленного относится к преимуществам (А) и недостаткам (Б) синтетических органических носителей. Ответ запишите в виде А13…Б24…. 1) неустойчивость к воздействию микроорганизмов; 2) наличие функциональных групп в исходном и модифицирован- ном состояниях, легко вступающих в различные химические ре- акции; 3) механическая прочность; 4) низкая способность к биодеградабельности; 5) легкость регенерации; 6) возможность придания любой конфигурации и различной степе- ни пористости; 7) возможность применения в виде тонкой пленки (толщина 80 мкм). 13. Что из перечисленного относится к преимуществам (А) и недостаткам (Б) неорганических носителей. Ответ запишите в виде А13…Б24…. 1) устойчивость к воздействию микроорганизмов; 2) наличие большого количества различных функциональных групп в исходном и модифицированном состояниях, легко вступающих в различные химические реакции; 3) способность к биодеградации; 4) низкая способность к биодеградабельности; 5) возможность получения липосом; 6) легкость регенерации; 7) возможность придания любой конфигурации и различной степе- ни пористости. 131 14. Что из перечисленного относится к преимуществам (А) и недостаткам (Б) природных органических носителей. Ответ запишите в виде А13…Б24…. 1) способность к биодеградации; 2) механическая прочность; 3) низкая способность к биодеградабельности; 4) отсутствие возможности к регенерации; 5) неустойчивость к воздействию микроорганизмов; 6) наличие функциональных групп в исходном и модифицирован- ном состояниях, легко вступающих в различные химические ре- акции; 7) самая низкая стоимость по сравнению с другими носителями. 15. Установите соответствия. Ответ запишите в виде А2Б1В4Г3 Способ иммобилизации Тип носителя А) иммобилизация на поверхности носителя Б) иммобилизация в массе носителя В) иммобилизация металлохелатным способом Г) иммобилизация с использованием мембранной технологии 1) гидроксид титана в комплексе с по- лисахаридами; 2) альгинат кальция; 3) пористые волокна; 4) активированный уголь 16. Перечислите типы взаимодействий (сил), за счет которых осуществля- ется адсорбционная иммобилизация. 17. Выберите ПРАВИЛЬНЫЕ утверждения: 1) адсорбционная иммобилизация биокатализатора может осущест- вляться за счет электрических сил; 2) при необратимой иммобилизации происходит образования кова- лентных связей; 3) иммобилизация в массе носителя обеспечивается только за счет механического обездвиживания; 4) при создании биосенсоров используется иммобилизация на осно- ве мембранной технологии; 5) микрокапсулирование является одних из способов иммобилиза- ции в массе носителя; 6) микрокапсулы, полученные методом диспергирования, имеют строго одинаковые размеры; 7) при иммобилизации ферментов металлохелатным способом груп- пы, способные выступать в роли лигандов, должны находиться в области активного центра фермента; 8) иммобилизация на поверхности носителя является необратимой. 18. Выберите НЕПРАВИЛЬНЫЕ утверждения: 1) адсорбционная иммобилизация биокатализатора может осущест- вляться за счет электрических сил; 132 2) при необратимой иммобилизации происходит образования кова- лентных связей; 3) иммобилизация в массе носителя обеспечивается только за счет механического обездвиживания; 4) при создании биосенсоров используется иммобилизация на осно- ве мембранной технологии; 5) микрокапсулирование является одних из способов иммобилиза- ции в массе носителя; 6) микрокапсулы, полученные методом диспергирования, имеют строго одинаковые размеры; 7) при иммобилизации ферментов металлохелатным способом груп- пы, способные выступать в роли лигандов, не должны находиться в области активного центра фермента; 8) иммобилизация на поверхности носителя может быть только не- обратимой. 19. Как называются указанные на рисунке способы иммобилизации: 20. Как называются указанные на рисунке способы адсорбционной иммо- билизации: 133 18. Как называются указанные на рисунке способы стабилизации фермен- тов с помощью иммобилизации: 19. Как называются указанные на рисунке типы реакторов для иммобилизо- ванных клеток: 20. Перечислите крупномасштабные биотехнологические процессы с ис- пользованием иммобилизованных ферментов или клеток микроорганиз- мов. 21. Перечислите требования, предъявляемые к производственному штамму микроорганизмов. 22. Перечислите преимущества иммобилизованных растительных клеток. 23. Приведите примеры практического использования иммобилизованных растительных клеток. 24. Перечислите преимущества иммобилизованных животных клеток. 25. Назовите критерии, которые учитываются в процедурах биотестирова- ния физиологически активных веществ с помощью иммобилизованных клеток животных. Вопросы для подготовки к зачету 1. Общие принципы иммобилизации. 2. Иммобилизация ферментов как составная часть инженерной энзимоло- гии. 3. Преимущества и недостатки иммобилизованных ферментов. 4. Преимущества иммобилизованных клеток. 5. Крупномасштабные промышленные процессы на основе иммобилизо- ванных клеток и ферментов. 134 6. Требования к материалам, используемым в качестве носителей. Класси- фикация носителей. 7. Природные органические носители: типы, преимущества, недостатки. 8. Основные характеристики полисахаридных природных носителей. 9. Белковые и липидные природные носители. 10. Синтетические органические носители: основные типы, преимущества, недостатки. 11. Носители неорганической природы. 12. Классификация методов иммобилизации. Способы физической и хими- ческой, обратимой и необратимой иммобилизации. 13. Адсорбционная иммобилизация: типы носителей, природа взаимодейст- вий, способы, преимущества и недостатки. 14. Иммобилизация путем включения в гели: примеры носителей, техника, преимущества, недостатки. 15. Иммобилизация на основе мембранной технологии: варианты, преиму- щества и недостатки. 16. Иммобилизация путем включения в двухфазную реакционную среду. 17. Ковалентное связывание биокатализатора с поверхностью носителя. 18. Ковалентная поперечная сшивка. 19. Иммобилизация металлохелатным способом. 20. Сравнительная характеристика разных способов иммобилизации (ад- сорбция, ковалентное связывание, включение в гели, на основе мем- бранной технологии). 21. Влияние иммобилизации на каталитическую активность и конформа- цию фермента. 22. Влияние иммобилизации на стабильность ферментов. 23. Эффекты диффузии реагентов в катализе иммобилизованными фермен- тами. 24. Промышленные процессы на основе иммобилизованных ферментов. 25. Ферментные электроды. 26. Применение иммобилизованных ферментов в медицине. 27. Требования к производственному штамму микроорганизмов. 28. Подходы к созданию иммобилизованных микробных биокатализаторов. 29. Типы иммобилизованных микробных биокатализаторов по принципу действия, масштабности и специфике биотехнологического процесса. 30. Параметры для оценки физиологического состояния клеток микроорга- низмов в иммобилизованном состоянии. 31. Получение аминокислот, органических кислот, спиртов и кетонов, ан- тибиотиков с помощью иммобилизованных клеток микроорганизмов. 32. Использование иммобилизованных микробных клеток для трансформа- ция стероидов, утилизации отходов, очистки сточных вод, получения ферментов, создания аналитических устройств. 135 33. Характеристика биореакторов для иммобилизованных клеток микроор- ганизмов. 34. Применение культур растительных клеток для получения БАВ, их пре- имущества и недостатки. 35. Преимущества иммобилизованных растительных клеток в качестве про- дуцентов БАВ. 36. Процессы биотрансформации с участием иммобилизованных расти- тельных клеток. 37. Биосинтетические процессы с участием иммобилизованных раститель- ных клеток. 38. Экскреция целевых продуктов иммобилизованными растительными клетками. 39. Методы определения жизнеспособности и метаболической активности иммобилизованных растительных клеток. 40. Системы культивирования иммобилизованных растительных клеток. 41. Типы культур животных клеток, техника их получения. 42. Преимущества культур животных клеток. Способы культивирования in vitro животных клеток. 43. Способы иммобилизации животных клеток. Микроносители. Преиму- щества иммобилизованных животных клеток. 44. Использование иммобилизованных животных клеток в процедурах био- тестирования. Темы рефератов 1. История развития методов иммобилизации ферментов. 2. История развития методов иммобилизации микробных, растительных и животных клеток. 3. Научные разработки по иммобилизации ферментов и клеток в Респуб- лике Беларусь. 4. Использование полисахаридных природных носителей для иммобилиза- ции клеток и ферментов. 5. Иммобилизация клеток и ферментов с помощью синтетических органи- ческих носителей. 6. Иммобилизации клеток и ферментов с помощью неорганических носи- телей. 7. Способы иммобилизации микробных клеток. 8. Способы иммобилизации растительных клеток. 9. Способы иммобилизации животных клеток. 10. Иммобилизация клеточных органелл. 11. Способы иммобилизации ферментов. 12. Крупномасштабные промышленные процессы на основе иммобилизо- ванных ферментов. 136 13. Использование иммобилизованных биокатализаторов в тонком органи- ческом синтезе. 14. Использование иммобилизованных биокатализаторов для утилизации отходов и очистки сточных вод. 15. Применение иммобилизованных ферментов и клеток в процедурах био- тестирования. 16. Использование иммобилизованных биокатализаторов в медицине. 17. Направления использования иммобилизованных растительных клеток. 18. Характеристика биореакторов для иммобилизованных микробных био- катализаторов. 19. Системы культивирования иммобилизованных растительных клеток. 20. Системы культивирования иммобилизованных животных клеток. 137 4. ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ Учебно-программные материалы Типовая учебная программа по учебной дисциплине «Иммобилизованные клетки и ферменты» для учреждений высшего образования по специальностям 1-31 01 01 Биология (по направлениям) направлениям специальности 1-31 01 01-01 Биология (научно-производственная деятельность) и 1-31 01 01-03 Био- логия (биотехнология) http://elib.bsu.by/handle/123456789/3315 Учебная программа учреждения высшего образования (рабочий вариант) по учебной дисциплине «Иммобилизованные клетки и ферменты» для специ- альностей 1-31 01 01 Биология (по направлениям) направлениям специально- сти 1-31 01 01-01 Биология (научно-производственная деятельность), 1-31 01 01-03 Биология (биотехнология) доступна по адресу http://elib.bsu.by/handle/123456789/98213 Учебная программа учреждения высшего образования по учебной дисци- плине «Иммобилизованные клетки и ферменты» для специальности 1-31 01 02 Биохимия доступна по адресу http://elib.bsu.by/handle/123456789/103088 Учебная программа учреждения высшего образования (рабочий вариант) по учебной дисциплине «Иммобилизованные клетки и ферменты» для специ- альности 1-31 01 02 Биохимия доступна по адресу http://elib.bsu.by/handle/123456789/105922 Список рекомендуемой литературы и Интернет-ресурсов ЛИТЕРАТУРА О с н о в н а я: 1. Березин, И. П. Иммобилизованные ферменты / И.П. Березин Н.Л. Клячко, А.В. Левашов и др. М.: Высш. школа, 1987. 2. Бодей, С. П. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы /С.П. Бо- дей, П. Броделиус, И.М.А. Кабрал и др. М.: Мир, 1988. 3. Бутенко, Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехно- логии на их основе: учеб. пособие / Р.Г. Бутенко. М.: ФБК-ПРЕСС. 1999. 4. Применение иммобилизованных ферментов // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М.: ВИНИТИ, 1986. 5. Синицын, А. П. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.II. Си- ницын, Е.И Райнина, В.И. Лозинский, С.Д. Спасов М.: Изд-во Моск. ун-та, 1994. 138 6. Юрин, В. М. Иммобилизованные клетки и ферменты: курс лекций / В.М. Юрин. Минск: БГУ, 2006. Д о п о л н и т е л ь н а я: 1. Валиханова, Г. Ж. Биотехнология растений / Г.Ж. Валиханова. Алматы: Конжык. 1996. 2. Зубов, В. П. Молекулярное конструирование полимерных материалов для биотехнологии и медицины / В.П. Зубов, А.Е. Иванов, Л.С. Жигис и др.// Биоорганическая химия. 1999. Т.25. №11. С.868-880. 3. Иммобилизованные клетки в биотехнологии. Пущино, 1987. 4. Колесов, А. А. Инженерная Энзимология на промышленном уровне / А.А. Колесов. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология М.: ВИНИТИ, 1989 Т. 18. 5. Корочинский, А. В. Исследование возможности создания иммобилизо- ванных структур на базе пробиотиков // А.В. Корочинский, В.В. Верников- ский, Э.Ф. Степанова // Успехи современного естествознания. 2010. №5. С. 34- 38. 6. Скрябин, Г. К. Иммобилизованные клетки микроорганизмов Биотехно- логия /Г.К. Скрябин, К.А. Кощеенко. М.: Наука, 1984. 7. Тривен, М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен. М.: Мир, 1983. 8. Application of Cell Immobilisation Biotechnology / ed. V. Nedic, R. Wil- laert. Springer, 2005. И н т е р н е т-р е с у р с ы: 1. Темников Д.А., Мезина З.Р. Обучающий интернет-курс «Основы культиви- рования клеток животных». – Казань: Казанский университет, 2003. www.ksu.ru/nilkto/cell 2. Кузьмина Н.А. Интерактивный учебник по биотехнологии. 2011-2013. http://www.biotechnolog.ru |