Учебнометодический комплекс по учебной дисциплине иммобилизованные клетки и ферменты для специальностей
 Скачать 1.14 Mb.
|
|
Глава 5. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ РАСТИТЕЛЬНЫЕ КЛЕТКИ Изолированные растительные клетки, как и клетки микроорга- низмов, можно культивировать в искусственных условиях. Культуры растительных клеток и тканей давно уже используются для получе- ния биопрепаратов. Из известных природных соединений более 90 % можно обнаружить в высших растениях. Культивируемые растительные клетки тотипотентные, т. е. в них может экспрессироваться вся генетическая информация, и, следова- тельно, любое вещество, находящееся в интактном растении, можно получить, культивируя клетки данного растения. В настоящее время многие из промышленно важных соединений, используемых в фармацевтической, пищевой, парфюмерной и т. д. отраслях, выделяют из тканей растений. Эти вещества имеют сложное химическое строение, и поэтому их трудно получить другими спосо- бами. Для получения таких соединений используют культуру расти- тельных клеток; за последнее десятилетие в этой области достигнуты значительные успехи. Так около 20 лет назад в Японии (1983) был впервые внедрен промышленный способ получения природного со- единения (шиконина), основанный на культивировании растительных клеток. Однако для промышленного использования растительных клеток с целью получения широкого спектра органических соединений не- обходимо решить ряд проблем, а именно учитывать характерный для растительных клеток медленный рост, способность к агрегации, низ- кий выход, генетическую нестабильность и т. д. – все эти факторы за- трудняют их использование в крупных масштабах. Для устранения указанных недостатков в последние годы прово- дятся исследования по использованию иммобилизованных раститель- ных клеток. Первое сообщение об иммобилизации растительных клеток в гранулированных полимерах появилось в 1979 г. В последние годы высказывается мнение, что с помощью иммобилизации можно час- тично или даже полностью преодолеть ряд указанных затруднений, препятствующих крупномасштабному использованию растительных клеток. За счет чего устраняются недостатки при иммобилизации расти- тельных клеток? 90 Во-первых, за счет более длительной стационарной фазы, наблю- даемой у иммобилизованных растительных клеток, можно решить про- блемы, связанные с замедлением роста клеток (наработкой биомассы). Во-вторых, с помощью иммобилизации можно частично преодо- леть нежелательные последствия процесса агрегации клеток за счет по- лучения относительно гомогенного препарата гранул геля, содержащих клетки. В-третьих, у иммобилизованных растительных клеток, как уже от- мечалось, наблюдается удлинение стационарной фазы, а наработка про- дукта происходит тогда, когда клетки находятся в неделящемся состоя- нии, т. е. в период наименее вероятного возникновения генетических изменений. В-четвертых, проблема низкой механической устойчивости расти- тельных клеток решается путем включения клеток в защитную поли- мерную матрицу. Одно из преимуществ иммобилизованных растительных клеток – это возможность индуцированной экскреции веществ, накопленных внутри клетки с помощью периодической пермеабилизации. При этом биомассу можно использовать многократно в течение достаточно дли- тельного времени. 5.1. Методы определения жизнеспособности иммобилизованных растительных клеток Для сохранения биосинтетической активности большое значение имеет жизнеспособность клеточных препаратов. Для ее определения используют ряд методических приемов. Окрашивание. Окрашивание, в частности флуоресцеиндиацетатом (ФДА), часто используют для определения жизнеспособности клеток. После адсорбции ФДА клетками при наличии эстеразной активности он деацетилируется и становится флуоресцирующим. Окрашенные клетки рассматривают с помощью микроскопа, снабженного УФ-источником света. Отношение клеток, находящихся в данный момент времени на ка- кой-либо стадии митоза, к их общему числу в популяции, выраженное в процентах, называют митотическим индексом (МИ). По его изменению в течение инкубации можно судить о жизнеспособности клеток. Удоб- ным красителем для окраски хромосом после фиксации является кар- бол-фиксин. Зависимость митотического индекса от времени инкубации 91 для суспендированных в среде и иммобилизованных растительных кле- ток представлена на рисунке 5.1. Рис. 5.1. Митотический индекс для суспендированных (1) и включенных в агорозный гель (2) клеток Catharanthus roseus Дыхание – критерий жизнеспособности клеток. Измерения проводят в течение инкубации через различные промежутки времени, например, с помощью кислородного электрода Кларка. 7 6 5 4 3 2 1 0 2 4 6 8 10 М И Время инкубации, сутки 2 1 1 2 100 60 20 0 2 4 6 8 О тн ос и те л ь н ая и н те н си в н ос ть д ы ха н и я, % Время инкубации, сутки Рис.5.2. Дыхание клеток С. roseus,включенных в альгинатный гель (1), и тех же клеток после растворения полимера (2) 92 Клетки, суспендированные в среде (сырой вес 100–200 мг), или со- ответствующее количество иммобилизованных клеток (общий объем 5 мл) инкубируют при 25 0 С. Регистрируют потребление кислорода, опре- деляют сухой вес клеток и рассчитывают удельную скорость дыхания (рис. 5.2). Очень часто дыхание иммобилизованных клеток менее интенсивно, чем дыхание такого же количества суспендированных клеток, что объяс- няется диффузионными затруднениями внутри полимерной сетки. Рост и деление клеток. Увеличение числа и веса клеток является хорошим показателем их жизнеспособности. Однако в культуре число растительных клеток определить очень трудно, поскольку клетки растут в виде агрегатов различных размеров. Гораздо проще определить вес клеток (сырой или сухой) (рис.5.3). Рис 5.3. Зависимость увеличения сухого веса суспендированных (1), иммобилизованных в агарозном (2) и альгинатном (3) гелях клеток сои от времени инкубации 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Время инкубации, сутки О тн ос и те л ь н ое ув ел и ч ен и е сухог о в ес а, % 2 1 3 93 Сухой вес иммобилизованных клеток рассчитывается, исходя из предположения, что вес полимерной матрицы во время инкубации не изменяется. Метод измерения скорости деления, несмотря на его длительность, выгодно отличается от предыдущего, поскольку позволяет оценить спо- собность иммобилизованных клеток воспроизводству. Критерием жизне- способности служит коэффициент деления – отношение числа пророс- ших клеток к числу посеянных. Иммобилизация клеток Chlorella оказывает существенное влияние на способность к делению после длительного хранения в темноте при низких температурах (рис. 5.4). В то время как коэффициент деления иммобилизованных в агаре и суспендированных клеток через десять дней хранения начинал снижаться к двадцатому дню, то при иммобили- зации в Са 2+ -альгинатном геле сохранялся на стационарном уровне в те- чение всего времени хранения. Определение рН. О жизнеспособности растительных клеток можно судить по скорости защелачивания среды в ответ на освещение. В этом случае об интактности клеток судят по величине сдвига рН незабуфе- ренной среды при переходе от темноты к освещению. Степень подщела- чивания среды в результате активизации процесса фотосинтеза и погло- щения углекислоты при включении света указывает на уровень жизне- 6 4 2 0 10 20 30 К оэ ф ф и ц и ен т д ел ен и я Время, сутки Рис.5.4. Изменение коэффициента деления клеток Chlorella в процессе хранения в темноте при 4 0 С: 1 – контроль, 2 и 3 – клетки, иммобилизованные в Са-альгинатном геле и агаре соответственно 1 3 2 94 способности клеток. Изменения рН среды легко регистрируется рН- электродом. Несмотря на то, что концентрация клеток в иммобилизованном пре- парате практически не изменилась на протяжении всего периода хране- ния, в первые четыре дня скорость подщелачивания среды резко возрас- тала, в то время как в суспензии в этот период – не изменялась (рис. 5.5). В последующие дни в обоих вариантах скорость подщелачивания неуклонно снижалась, оставаясь более высокой у иммобилизованных клеток. Таким образом, иммобилизованные клетки (в альгинате кальция) поддерживают более высокий уровень метаболизма по сравнению с сус- пендированными. 5.2. Способность иммобилизованных растительных клеток к биосинтезу В клетках высших растений протекает множество химических реак- ций, которые можно использовать для синтеза сложных органических соединений. Наряду с реакциями биотрансформации (биоконверсии) та- кими как гидроксилирование, метилирование и др., в растительных клет- ках осуществляется синтез органических соединений de novo из более простых соединений углерода. 1,5 1,0 0,5 0 2 6 8 Δ π Н , 10 – 3 /м и н /10 7 к л ет ок Время, сутки 4 10 0,0 Рис. 5.5. Скорость фотоиндуцированного подщелачивания среды для клеток, хранящихся на свету при комнатной температуре: 1 – контроль; 2 – иммобилизованные клетки 2 1 95 Иммобилизованные растительные клетки, сохранившие жизнеспо- собность, как показано, характеризуются высокой биосинтетической ак- тивностью. Приведем некоторые примеры биосинтеза физиологически активных веществ иммобилизованными растительными клетками. Биотрансформация (биоконверсия). К наиболее распространен- ным реакциям биотрансформации у растений, в первую очередь, отно- сится реакция 12-β-γидроксилирования. Примером может служить гидро- ксилирование производного дигитоксина с образованием производного дигоксина, представляющего промышленный интерес. Эту реакцию осуществляют как суспендированные клетки Digitalis lanata в периоди- ческом или непрерывном режимах. В периодическом режиме клетки Digitalis, иммобилизованные в аль- гинатном геле, могут быть использованы для гидроксилирования метил- дигитоксина в метилдигоксин в течение 180 суток (если каждые трое су- ток гранулы геля с иммобилизованными клетками переносить в свежую среду). В данном случае время использования иммобилизованных клеток значительно превышает соответствующее время для клеток, суспендиро- ванных в среде. Следовательно, с помощью иммобилизованных клеток удается получить более высокий выход продукта на единицу биомассы. Реакцию восстановления двойной связи можно продемонстрировать на примере синтеза различных индолсодержащих алкалоидов (аймали- цин, серпентин, катартин), культивируемыми клетками Catharanthus roseus. Конечным ферментом биосинтеза ацмалицина является катена- минредуктаза (рис. 5.6). Рис. 5.6.Синтез аймалицина из катенамина Для превращения катенамина в изомеры аймалицина используют клетки С. roseus, включенные в агарозный гель. Для лучшей экскреции клетки обрабатывают соединениями, повышающими проницаемость N N H CH 3 O 2 C O CH 3 H HAДФН + H + HAДФ + 20 19 N N H O H 20 H Катенамин Катенаминредуктаза H 19 H CH 3 H Аймалицин СН 3 О 2 С 21 96 клеточных мембран. Выход продукта зависит от вида используемых ин- кубационных сред (табл. 5.1). Таблица 5.1 Биоконверсия катенамина в изомеры аймалицина с помощью клеток С. roseus, включенных в агарозный гель Инкубационная среда Относительный выход аймалицина, % Полная 1) 100 – NADPH + NADP + + изоцитрат 85 – NADPH + изоцитрат 35 – NADPH 25 – Катенамин 9 1) 1 г гранул геля с иммобилизованными клетками в 10 мл, 50 мМ К-фосфатного буфера с рН 7,5, содержащего 11 мкМ катенамина, 1 мМ NADPH и 28 мМ меркапто- этанола. Синтез из предшественников. Если для соединения известен путь биосинтеза и доступны вещества – предшественники, то его выход мож- но существенно увеличить, добавляя эти предшественники в питатель- ную среду. Для указанного ранее синтеза аймалицина в клетках С. roseus отдаленными предшественниками этих изомеров являются триптамин и секологанин. Методика синтеза аймалицина из этих соединений сводит- ся к следующему. Пропускают многократно через колону среду, содер- жащую триптамин (25 мкмоль) и секологанин (25 мкмоль), экстрагируют липофильные продукты реакции из водной фазы с помощью хлороформа и вновь подают на колону. Или просто инкубируют клетки в среде, со- держащей триптамин (1,25 мкмоль) и секологанин (1,25 мкмоль), встря- хивают на качалке (100 об/мин) и через 2 и 5 суток отбирают пробы и определяют содержание аймалицина (табл. 5.2). Таблица 5.2 Синтез аймалицина из триптамина и секологанина суспендированными в среде и иммобилизованными клетками С. roseus Относительный выход продукта, % Препарат клеток 2 суток 5 суток Суспендированные в среде 91 100 Включенные в альгинатный гель 125 176 Включенные в агарозный гель 99 114 Включенные в гель агара 81 95 Включенные в гель каррагинана 70 82 Синтез de novo. При синтезе de novoсложных органических ве- ществ из простых органических соединений с помощью культивируемых 97 растительных клеток используется большая часть путей клеточного ме- таболизма. В настоящее время известно лишь несколько примеров синтеза de novo сложных органических соединений с помощью иммобилизованных растительных клеток. Можно привести два примера синтеза de novo: индолслдержащих алкалоидов и антрахинонов. Индолсодержащие алкалоиды, такие как аймалицин и серпентин, удалось получить с помощью клеток С. roseus, включенных в альгинат- ный и полиакриламидный и другие гели (табл. 5.3). Таблица 5.3 Синтез de novoаймалицина из сахарозы клетками Catharanthus roseus (относительный выход продукта после 2 недельной инкубации) Препарат % Суспендированные клетки 100 Включенные в альгинатный гель 140 Включенные в агарозный гель 100 Включенные в агаровый гель 88 Атрахиноны синтезируются различными культурами растительных клеток. Иммобилизованные в альгинатном геле клетки Morinda citrifolia синтезируют в 10 раз больше продукта, чем суспендированные в среде. Так после 22 суток инкубации количество атрахинона, синтезируемое суспендированными и иммобилизованными клетками M. citrifolia, со- ставляла 1 и 9,5 нмоль на клетку соответственно. Экскреция продукта из клеток. Очень часто вторичные продукты метаболизма накапливаются внутри культивируемых клеток (в вакуо- лях), что, до некоторой степени, ограничивает применение иммобилизо- ванных растительных клеток. Одним из основных преимуществ иммоби- лизованных биокатализаторов является возможность их длительного ис- пользования, но это требует перехода, накопленного внутри продукта в окружающий раствор. Внеклеточные продукты. Ряд продуктов метаболизма клеток выде- ляется в межклеточную среду. Эти вещества можно получать с помощью иммобилизованных клеток без особых затруднений в реакторе непре- рывного действия. Так, клетки D. lanata (см. выше) использовали для превращения дигитоксина в дигоксин в колоночном реакторе непрерыв- ного действия в течение 70 суток. Внутриклеточные продукты. В ряде случаев, как уже отмечалось, вещества, накапливаемые внутри культивируемых клеток, после иммо- билизации переходят в межклеточную среду (спонтанная экскреция). 98 Именно таким образом происходит экскреция индолсодержащих алка- лоидов из иммобилизованных клеток C. roseus. Спонтанная экскреция все же встречается довольно редко. Поэтому в настоящее время разрабатываются методы, с помощью которых можно индуцировать экскрецию желаемого продукта из иммобилизованных клеток. Индукция высвобождаемого продукта повышается при обработке клеток веществами, повышающими проницаемость клеточных мембран (пермеабилизация), причем такая обработка не влияет ни на жизнеспо- собность, ни на биосинтетическую активность иммобилизованных кле- ток. В этой связи один и тот же препарат иммобилизованных клеток можно использовать для многократной наработки продукта в цикличе- ском режиме (рис. 5.7). Таким образом, применение иммобилизованных растительных кле- ток весьма обнадеживает. По-видимому, иммобилизация представляет собой перспективный метод, с помощью которого удается частично или полностью решить проблемы, связанные с использованием культур рас- тительных тканей для получения физиологически активных органиче- ских соединений. наработка биомассы иммобилизация наработка продукта пермеабилизация наработка продукта пермеабилизация наработка продукта пермеабилизация экскреция продукта экскреция продукта экскреция продукта рост клеток рост клеток рост клеток Рис. 5.7. Схема получения соединений, синтезируемых растительными клетками, с индуцируемой экскрецией продукта (стадия роста не обязательна) 99 5.3. Особенности физиологии иммобилизованных растительных клеток Иммобилизованные растительные клетки заметно отличаются по своим физиологическим свойствам от интактных. Выполнение к настоя- щему времени работы показали, что наибольшее влияние на скорость де- ления, фотосинтез и дыхание оказывает включение клеток в полисаха- ридные гели. Как отмечается, скорость роста иммобилизованных клеток в целом ниже, чем в суспензии, хотя возможная утечка клеток из матрик- са затрудняет интерпретацию результатов. Тем не менее, содержание хлорофилла в иммобилизованных клетках более высокое по сравнению со свободными, что, правда, может быть связано с частичным уменьшением освещенности в иммобилизованных препаратах. Это, как известно, может приводить к увеличению синтеза фотосинтетических пигментов. Однако, с другой стороны, отмечалось, что уровень хлорофилла в иммобилизованных клетках Euglena после трех месяцев хранения составлял 90 % от исходного. Правда, свободные клетки подвергались феофитинизации через 7 дней. Для клеток Chlorella, иммобилизованных в Са-альгинатном геле, активность ряда ферментов, участвующих в процессах фотосинтеза, и метаболизм гликолата остава- лись неизменными в течение 6 месяцев хранения. Накопленные к настоящему времени экспериментальные данные свидетельствуют о стабилизирующем воздействии иммобилизации в Са- альгинатном геле на хлорофилл-белковый комплекс, в частности клеток Botryococcus. Изучение скорости фотосинтетического выделения кислорода вы- явило его увеличение втрое у иммобилизованных в Са-альгинате клеток Botryococcus по сравнению со свободными. В то же время у иммобили- зованных в альбуминглутаральдегидальгинатном геле клетках Scenedesmus скорость фотовыделения кислорода была только на 5 % выше, чем в суспензии, что, возможно, объясняется токсичным влиянием глутаральдегида. Еще один параметр физиологической активности клеток – интен- сивность дыхания. Средняя скорость дыхания иммобилизованных в Са- альгинате клеток Chlorella была ниже, чем в суспензии, причем среднее значение зависело как от размера частиц матрикса, так и от концентра- ции клеток внутри матрикса. Эти исследования позволили предполо- жить, что только часть клеток в гранулах сохраняла метаболическую ак- тивность. Интенсивность дыхания иммобилизованных в Са-альгинате клеток Catharanthus roseus почти в 2 раза ниже, чем в тех же клетках по- 100 сле растворения полимерного матрикса. Объясняют это явление диффузи- онными затруднениями внутри матрикса. Электронно-микроскопические исследования роста и морфологии им- мобилизованных клеток водорослей показали, что иммобилизация в поли- уретане мало изменяет их морфологию. Включение клеток в Са- альгинатный гель вызывает появление складчатости у Chlamydomonas, зна- чительное ограничение роста клеток Chlorella на периферии гранул. Пред- положительно, это происходит вследствие ограничения доступа СО 2 внутрь матрикса. Иммобилизованные в альгинате колонии Botryococcus имели бо- лее регулярную форму и в 2,5 раза больший размер по сравнению со сво- бодными клетками. Клетки Solanum aviculare, включенные в Са- альгинатный гель, не только приобретали округлую форму по сравнению со свободными клетками, но и образовывали более многочисленные коло- нии. Цитологические исследования Euglena c использованием трансмисси- онной электронной микроскории продемонстрировали, что иммобилизация в Са-альгинате и хранение гранул в темноте при 4 0 С в 0,1 М СаСl 2 стаби- лизировали клетки в одном и том же состоянии на протяжении нескольких лет. Таким образом, иммобилизованные клетки могут успешно использо- ваться для долговременного хранения штаммов в коллекциях культур. Включение клеток в полисахаридные гели особенно эффективно в случае культур протопластов, поскольку иммобилизация при сохранении функциональных свойств обеспечивает дополнительную защиту от меха- нических стрессов и микробного заражения. Например, иммобилизация протопластов культуры клеток в агарозе и Са-альгинатном гелях представ- ляет собой уникальный инструмент исследований, позволяющих устано- вить корреляцию между составом внеклеточного матрикса и морфогенети- чеким ответом клеток. Таким образом, можно сделать вывод, что включение клеток в по- лисахаридные гели существенно изменяет физиологические и биохими- ческие процессы в клетках. Причины такого изменения метаболизма до конца не ясны. Вероятно, в каждом конкретном случае они различны. Иногда причина кроется в особенностях конструкции биореактора на основе иммобилизованных клеток, которые позволяют удалять продук- ты реакции, исключая тем самым возможность ингибирования метабо- лических процессов, и предотвращают вредное воздействие перемеши- вания. Но большинство авторов, анализируя эффект иммобилизации, делает вывод, что изменения метаболизма в иммобилизованных клетках вызваны перераспределением энергии вследствие изменения клеточно- го цикла и роста. 101 Описанные во многих работах явления спонтанной экскреции вторичных метаболитов в клетках, иммобилизованных в полисаха- ридных гелях, косвенно подтверждают факт модификации плазма- леммы в результате взаимодействия с полисахаридным матриксом. В этом случае должны наблюдаться изменения транспортно-барьерных свойств, что можно проследить при измерении ионных потоков через мембрану. В этой связи нами проведены опыты с измерением потоков ионов NO 3 – и K + суспендированных и иммобилизованных клеток. Нитраты являются исключительно важным элементом минерального питания и используются в первичных и вторичных процессах обмена веществ, поэтому представлялось целесообразным исследование про- цесса поступления NO 3 – в суспендированные и иммобилизованные клетки. Исследования проводились с помощью ионселективного электрода. В иммобилизованных клетках было выявлено увеличение макси- мальной скорости (V mах ) поглощения NO 3 – по сравнению с контролем в 3–5 раз в зависимости от материала носителя. Как видно из рис. 5.8, V maх в клетках, иммобилизованных в Са-альгинатном геле, превыша- ла тот же параметр в суспензии в 3 раза, в Са/Ва-альгинатном геле – в 4,6 раза, в агаровом геле – в 3,8 раза. 10 20 30 40 0 2,0 1,5 1,0 0,5 4 2 3 1 V , н м ол ь /м и н /м г сы рог о в ес а Рис 5.8. Влияние иммобилизации на скорость поступления NO 3 – в клетки Chlorella: 1 – контроль; 2 – Са-альгинатный гель; 3 – агаровый гель; 4 – Са/Ва- альгинатный гель [KNO 3 ], мкМ 102 Так как перенос NO 3 – через плазмалемму осуществляется пассивной и активной транспортными системами и регулируется многочисленными внутренними и внешними факторами, мы исследовали влияние освещенно- стирН среды и ингибиторов метаболизма на транспорт нитратов в иммоби- лизованных клетках. Отсутствие качественных различий рН-зависимостей, а также в актива- ции светом (рис. 5.9) транспорта NO 3 – позволяет предположить, что иммо- билизация не затрагивает внутриклеточные механизмы регуляции поступле- ния и ассимиляции нитратов. Для всех использованных ингибиторов не было выявлено достоверных различий в значениях полумаксимальной концентрации ингибирования транспорта нитратов в свободных и иммобилизованных клетках (табл. 5.4). Таблица 5.4 Влияние ингибиторов протонной помпы и клеточного метаболизма на скорость поглощения нитратов в клетках Chlorella vulgaris Концентрация полумаксимального ингибирования, IC 50 , мкМ Ингибитор суспензия иммобилизованные клетки Na 2 VO 4 51,5 ± 4,6 48,7 ± 5,3 ДЭС 5,1 ± 0,5 5,3 ± 3,2 Диурон 2,3 ± 1,1 3,3 ± 2,7 1 2 Свет Темнота Свет 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 4 8 12 16 20 24 V m ax , н м ол ь /м и н /м г сы рог о в ес а Время, ч Рис.5.9. Световая зависимость скорости поглощения нитратов клетками Chlorella: 1 – контроль, 2 – клетки, иммобилизованные в Са-альгинатном геле 103 Таким образом, иммобилизация не оказывает заметного действия на энергозависимые транспортные системы плазмалеммы. Было замечено, что активация нитратного транспорта зависела от времени с момента иммобилизации. Максимальный эффект наблюдался на вторые – четвертые сутки после включения клеток в Са-альгинатный гель. В то же время, добавление в суспензию 0,4 %-ного раствора альги- ната натрия в 2,5 раза увеличивал максимальную скорость переноса нит- ратов через плазмалемму, что по величине близко с действием иммоби- лизации в Са-альгинатном геле. При подробном изучении воздействия составных компонентов геля – свободного альгината и ионов Са 2+ на транспорт NО 3 – было показано, что увеличение концентрации Са 2+ в среде в диапазоне 0,1–1 мМ мало влияло на скорость поглощения нитратов (рис.5.10, б). Альгинат натрия при этом значительно стимулировал поглощение NО 3 – , но лишь до опре- деленного предела. Начиная с концентрации полисахарида около 1 % V maх снижалась, а при концентрации 1,4 % ингибировалась на 95 % (см. рис.5.10, а). Полученные результаты позволяют предположить, что эффект акти- вации нитратного транспорта связан с влиянием молекул альгината на транспортные характеристики плазмалеммы. Активируя перенос нитра- тов при низких концентрациях, альгинат натрия при повышении его со- держания выше 1 % оказывает угнетающее воздействие на клетку. Рис.5.10. Влияние свободного альгината (а) и Са 2+ (б) на скорость поглощения нитратов V m ах, н м ол ь /м и н /10 7 к л ет ок 0,0 0,5 1,0 1,5 [Альгинат], % 0 20 40 60 80 100 а Контр. 0,1 мМ 0,5 мМ 1 мМ V m ах, н м ол ь /м и н /10 7 к л ет ок 0 10 20 30 40 б 104 Другим важным ионом, определяющим осмотические и коллоиднохи- мические свойства цитоплазмы, является калий, основной потенциалобра- зующий ион в растительной клетке. В этой связи представлялось также не- обходимым выявить различия в поступлении K + в иммобилизованные клетки; измерения проводились с использованием радиоактивного химиче- ского аналога 86 Rb + Иммобилизация в Са-альгинатном геле уменьшала скорость накоп- ления K + в клетках Chlorella на 20–25 %, т. е. вызывала эффект, противо- положный действию на транспорт нитратов (рис. 5.11). Как и в случае нитратного транспорта, изучали влияние состав- ных компонентов полисахаридного матрикса на скорость входящих потоков K + . Добавление в инкубационную среду Са 2+ в пределах кон- центраций 0,1–1,0 мМ активировала накопление K + в суспензии кле- ток. Альгинат натрия (0,01–1 %) вызывал падение скорости накопле- ния калия клетками хлореллы. Степень подавления транспорта калия внутрь клеток нелинейно зависела от концентрации альгината в сре- де. Для контроля степени адсорбции полисахаридом ионов калия из среды мы исследовали влияние альгината натрия на содержание K + в растворе (рис. 5.12). Время, ч Н ак оп л ен и е K + , н м ол ь /ч /10 8 к л ет ок 0 20 40 60 80 1 2 1 2 0 Рис.5.11. Зависимость накопления калия клетками Chlorella от времени: 1 – контроль; 2 – клетки, иммобилизованные в Са-альгинатном геле 105 Сопоставление полученных данныхпоказало, что степень адсорб- ции альгинатом K + намного меньше, чем ингибирование накопления K + в клетках. Таким образом, влияние иммобилизации на транспорт K + , как и на транспорт нитратов, вероятно опосредовано взаимодействие плазма- леммы с молекулами альгината. Для выявления возможных механизмов взаимодействия молекул но- сителя с плазмалеммой изучалось влияние полисахаридов различной природы на накопление K + в клетках хлореллы. В отличие от нейтраль- ного фиколла отрицательно заряженные декстрансульфат и карбоксиме- тилцеллюлоза (КМЦ) вызывали сходное с альгинатом ингибирование потоков K + в клетки. И хотя эффекты снижения скорости накопления K + а 50 100 % % 1 2 С і , % 0 0 10 –3 10 –2 10 –1 10 0 б 0 50 1 Рис.5.12. Зависимость степени ингибирования поступления K + в клетки Chlorella (а) и сорбции ионов K + на носители (б) от кон- центрации альгината (1) и карбоксиметилцеллюлозы (2) 2 25 % 106 под действием альгината или декстран-сульфата могут быть частично обусловлены сорбцией ионов калия полисахаридами, КМЦ действует на мембрану, не сорбируя ионов K + . Следовательно, именно заряд полиса- харидов играет ключевую роль при взаимодействии с клеточной мем- браной. В целях детализации мембранотропного влияния альгината был проведен ряд электрофизиологических экспериментов на клетках Nitella flexilis. Добавление в раствор ИПВ 0,2–0,8 % альгината натрия вызывало обратимое снижение разности потенциала покоя клеток Nitella flexilis на 20–50 мВ, при концентрации альгината выше 1 % клетки через 20 минут инкубации погибали. Анализ мгновенных вольт-амперных характеристик (рис. 5.13)пока- зал, что 0,8 %-ный альгинат существенно увеличивал проводимость плазмалеммы как в режиме деполяризации, так и при гиперполяризации. Эффект сохранялся и после отмыва в контрольном растворе. Получен- ные результаты означают, что начиная с определенной концентрации альгината, имеет место прямой эффект полисахарида на мембрану, со- стоящий, по-видимому, в деструктуризации липидной фазы мембраны, появлении в ней динамических дефектов, что вызывает увеличение несе- лективной утечки. Рис.5.13. а – потенциал фиксации –20 мВ, б – потенциал фиксации –160 мВ; 1 – контроль, 2 – 0,8 % альгината Na, 3 – после отмыва в ИПВ I, м к А /с м 2 -200 -100 100 200 V, мВ -300 -20 -10 0 10 20 а 30 0 I, м к А /с м 2 -300 -200 100 100 V, мВ -400 -30 -20 -10 10 0 б -40 0 1 2 3 1 2 3 107 Это приводит к деполяризации мембраны, что в свою очередь вызы- вает изменения в величине ионных потоков через мембрану, в частности, через калиевые каналы и систему транспорта нитратов. Таким образом, на основании полученных результатов и литератур- ных данных, можно сделать вывод о том, что иммобилизация раститель- ных клеток в полисахаридных гелях, особенно в альгинате Са, изменяет клеточный метаболизм, стабилизирует мембрану и способствует дли- тельному сохранению жизнеспособности клеток. Этот метод иммобили- зации может быть рекомендован как для использования в промышлен- ных установках, так и для длительного хранения штаммов водорослей и культур растительных клеток в течение длительного времени. |