Глава 3
. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ
Под иммобилизацией фермента понимается его включение в какую- либо изолированную фазу, которая отделена от фазы свободного раство- ра, но способна обмениваться с находящимися в последней молекулами субстрата или эффектора. Иными словами, иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. Иммобилизация фер- ментов – это перевод их в нерастворимое состояние с сохранением (час- тичным или полным) каталитической активности.
Вообще, в идеальном случае иммобилизация фермента не должна приводить к потере каталитической активности. Адсорбция – мягкий ме- тод иммобилизации, который, как правило, слабо изменяет каталитиче- скую активность фермента.
Наоборот, ковалентное связывание приводит часто к снижению ферментативной активности. Однако инактивацию фермента можно пре- дотвратить, если проводить иммобилизацию в присутствии субстрата, который защищает активный центр. Приведем примеры типичных водо- нерастворимых носителей, используемых для адсорбции и ковалентной иммобилизации ферментов (табл. 3.1).
Таблица 3.1
Материалы, используемые для иммобилизации
Адсорбционная иммоби-
лизация
Ковалентная иммобилизация
Окись алюминия
Агароза (сефароза)
Бентонит
Целлюлоза
Карбонат кальция
Декстран (сефадекс)
Гель фосфата кальция
Стекло
Уголь
Сополимеры полиакриламида
Целлюлоза
Глина
Полиаминостерол
Каллоген
Конковалин А-сефарозы
Широкое технологическое применение ферментов долгое время сдерживалось рядом причин, из которых важнейшим являются:
– трудоемкость отделения ферментов от исходных реагентов и продуктов реакции после завершения процесса, в результате чего ферменты используются, как правило, однократно;
38
– неустойчивость (лабильность) ферментов при хранении, а так- же при различных воздействиях (главным образом тепловых);
– трудоемкость очистки ферментов и получения их в достаточно активном виде и, как следствие, высокая стоимость активных фер- ментов.
В последнее десятилетие определились пути преодоления этих трудностей. Они связаны как раз с получением иммобилизованных ферментов, а также иммобилизованных клеток (микроорганизмов).
Открылись принципиально новые перспективы перед прикладной наукой в результате создания иммобилизованных ферментов. Дж.
Нельсон и Е. Гриффин в 1916 г. показали, что инвертаза, адсорбиро- ванная на угле (т. е. иммобилизованная), сохраняет каталитическую активность. В 20–30-х годах прошлого века работы по получению адсорбции белков и ферментов были продолжены главным образом в практических целях.
Каким образом, с помощью иммобилизации удается преодолеть перечисленные выше трудности промышленного использования ферментов?
1. В результате иммобилизации ферменты приобретают пре- имущества гетерогенных катализаторов – их можно удалять из реак- ционной смеси (и отделять от субстратов и продуктов ферментатив- ной реакции) простой фильтрацией. Этим устраняется первый из пе- речисленных недостатков растворимых ферментов как технологиче- ских катализаторов. Более того, появляется возможность перевода многих периодических ферментативных процессов на непрерывный режим, используя колонны или проточные аппараты с иммобилизо- ванными ферментами.
2. Иммобилизованные ферменты более устойчивы к внешним воздействиям, чем растворимые ферменты. Таким образом, возникли перспективы преодоления и второго недостатка – их лабильности.
3. Наконец, принцип иммобилизации был применен не только к ферментам, но и к их субстратам, ингибиторам и кофакторам, т. е. веществам, имеющим избирательное сродство к ферментам. Это по- зволило создать метод выделения и очистки ферментов, основанный на хроматографии по сродству, или аффинной хроматографии. Тем самым существенно облегчается выделение чистых ферментов, и в настоящее время можно рассчитывать на то, что и третья из отме- ченных причин, ограничивающих промышленное применение фер- ментов, успешно преодолевается.
39
Иммобилизованные ферменты обладают рядом преимуществ при использовании их в прикладных целях:
1. Гетерогенный катализатор легко отделить о реакционной сре- ды, что дает возможность:
– остановить в нужный момент реакцию;
– использовать катализатор повторно;
– получать продукт, не загрязненный ферментом (важное об- стоятельство для пищевых и фармацевтических производств).
2. Использование гетерогенных катализаторов позволяет прово- дить ферментативный процесс непрерывно, например, в проточных колоннах, и регулировать скорость катализируемой реакции, а также выход продукта путем изменения скорости потока.
3. Иммобилизация или модификация фермента способствует це- ленаправленному изменению свойств катализатора, в том числе спе- цифичности, зависимости каталитической активности от рН, ионно- го состава и других параметров среды и, что важно, его стабильно- сти по отношению к различного рода денатурирующим воздействи- ям.
4. Иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность путем изменения свойств носителя под действием некоторых физических факторов (свет, звук); созда- ются механо- и звукочувствительные датчики, усилители слабых сигналов и бессеребряные фотографические процессы.
С практической точки зрения иммобилизация ферментов на во- донерастворимых носителях очень выгодна, поскольку после завер- шения ферментативной реакции иммобилизованный фермент может быть выделен и использован повторно. Однако необходимо знать, остается ли иммобилизованный фермент связанным с носителем при различных условиях (рН, температура, присутствие субстрата и про- дуктов). Убедившись в прочности связывания фермента с носителем, можно сравнивать свойства свободного и иммобилизованного фер- мента. Одним из свойств носителя является максимальная «нагруз- ка». Под максимальной «нагрузкой» (емкостью) носителя фермен- том подразумевается максимальное количество фермента, которое может быть иммобилизовано на определенном количестве носителя.
Это очень важный параметр, так как высокая степень нагрузки носи- теля позволяет уменьшить размеры реактора. Перенасыщение носи- теля может привести к тесному сближению молекул и к уменьшению активности фермента за счет стерических затруднений при взаимо- действии субстрата с активным центром. Однако, ограниченная «на-
40 грузка» носителя может приводить к блокированию свободными мо- лекулами пространства между связанными молекулами фермента.
3.1. Кинетические параметры катализа
иммобилизованных ферментов
Свойства иммобилизованных ферментов изучают, измеряя влияние рН, температуры, ионной силы, концентрации субстрата и продукта на кинетические параметры ферментативной реакции и сравнивания с ана- логичными результатами, полученными для нативного фермента. Изме- рения должны проводиться одинаковым образом для свободного и им- мобилизованного ферментов.
Изменение отдельных свойств фермента при иммобилизации в ряде случаев можно предсказать, например, при адсорбции фермента на заря- женном носителе. Если носитель заряжен отрицательно или положи- тельно, то зависимости активности и стабильности адсорбированного фермента от рН могут смещаться в более щелочную или кислую область соответственно. Это смещение объясняется изменением свойств микро- окружения фермента в непосредственной близости от загрязненного но- сителя.
В простейшем случае скорость (V) катализируемой ферментативной реакции подчиняется уравнению Михаэлиса – Ментен, предложенному еще в начале XX века:
[Е], [S] – концентрация фермента и субстрата в системе соответст- венно; k кат
– каталитическая константа ферментативной реакции; К
м
– оп- ределяемое эффективное (кажущееся) значение константы Михаэлиса.
Результаты измерений начальных скоростей при различных концентра- циях субстрата, соответствующие выражению 3.1, можно представить графически (рис. 3.1).
Параметр К
м служит характеристикой сродства фермента к суб- страту и, следовательно, является той мерой концентрации субстрата, которая необходима для насыщения фермента. При катализе иммоби- лизованными ферментами концентрация субстрата вблизи фермента может отличаться от концентрации субстрата во всем объеме системы.
В этом случае наблюдаемая К
м должна зависеть от распределения суб- страта между свободным раствором и носителем, где сосредоточен фермент. k
кат
[Е] [S]
К
м
+ [S]
V =
3.1
41
Параметр k кат характеризует реакционную способность образо- вавшегося фермент-субстратного комплекса, поэтому не зависит от распределения субстрата в системе, а определяется состоянием, в пер- вую очередь, конформацией самого фермента.
Каталитические параметры ферментативной реакции (k кат и К
м
) мо- гут зависеть от наличия в реакционной системе различных эффектов (ин- гибиторы, активаторы), рН и т. д. В таких случаях необходимо учиты- вать распределение также этих эффекторов между раствором и фермент содержащей матрицей.
Иммобилизация фермента может приводить к увеличению или уменьшению К
м
. Уменьшение К
м фермента при иммобилизации может
V
V = 0,5
К
м
0 начальный наклон = Е/К
м
[S]
а
1/V
1/[Е]
–1/К
м
0 наклон = К
м
/[Е]
1/[S]
б
Рис. 3.1. Зависимость начальной скорости (0) от концентрации субстрата (S):
а, б – в обычных и обратных координатах соответственно
42 давать дополнительные практические преимущества, поскольку при низ- ких концентрациях субстрата скорость реакции будет выше, чем в случае свободного фермента. Увеличение К
м
, иммобилизованного фермента, напротив, означает, что для достижения данной скорости реакции тре- буется большая концентрация субстрата, чем для свободного фермен- та. Изменения К
м могут объясняться также изменением свойств мик- роокружения частиц иммобилизованного фермента. Так, например, из- вестно, что частицы окружает не перемешиваемый слой растворителя
(слой Нернста), в котором концентрация субстрата ниже, чем в основ- ной массе раствора. Для насыщения иммобилизованного фермента требуется более высокая концентрация субстрата. Этот эффект прояв- ляется в уменьшении величины К
м при уменьшении размера частиц, на которых иммобилизован фермент, или при увеличении скорости пере- мешивания.
Ионная природа носителя также может оказывать влияние на К
м
, в частности если субстрат несет заряд. Если заряды носителя и субстра- та противоположны, то величина К
м будет уменьшаться, а если они одноименны, то эта величина будет увеличиваться. Могут быть и дру- гие случаи изменения величины К
м
, объяснить которые более сложно.
Предполагают, что после иммобилизации фермента на носителе его термостабильность увеличивается и, следовательно, его действие будет пролонгировано. Однако, заранее трудно представить дает ли такой эффект соответствующий метод иммобилизации. Для более ста- бильного прогноза необходимо изучить влияние различных темпера- тур на активность фермента, измеряя начальную скорость фермента- тивной реакции в каждой точке, т. е. при конкретной температуре.
Увеличение оптимума, иммобилизованного фермента в сторону поло- жительных температур не обязательно означает увеличение термоста- бильности. Хотя после иммобилизации температурный оптимум фер- мента может увеличиться на 10–20 0
С, при высокой температуре он может быть очень лабилен и может быстро терять свою активность даже при возрастании начальной скорости реакции.
Термостабильность измеряют двумя способами:
1) предварительная инкубация фермента при повышенной темпе- ратуре в течение различных промежутков времени с последующим ох- лаждением и измерением активности.
2) инкубация фермента с субстратом при определенной темпера- туре и регистрацией превращения субстрата в продукт.
Оба способа проиллюстрированы на рис. 3.2, а, б.
43
Как видно из представленных данных, инвертаза, адсорбирован- ная на Кон А-сефарозе, имеет повышенную стабильность по сравне- нию с нативным ферментом (а). В режиме функционирования иммо- билизованный фермент еще более стабилен, чем нативный. С практиче- ской точки зрения данные, приведенные на рис. 3.2,б, более информа- тивны по сравнению с таковыми на рис. 3.2, а.
100 80 60 40 20 0
1 2
3 4
5
В
ос ст ан ов л
ен и
е ак ти в
н ос ти
,
%
а
1
2
14 12 10 8
6 4
2 0
10 20 30 40 50
Ги
д
рол
и
зов
ан
н
ая
с
ахароз
а,
м
к
Время прогрева, мин
2
1
60
б
44
Рис.
3.2. Термостабильность при 65 0
С растворимой инвертазы (
1) и иммобилизованной (
2) на Кон А-сефарозе в отсутствие (
а) и в присутствии (
б) 0,12 моль сахарозы
Таким образом, все кинетические эффекты, наблюдаемые при ката- лизе иммобилизованными ферментами можно разделить на две группы.
К первой из них относятся эффекты, связанные с влиянием иммобилиза- ции на состояние (конформацию) фермента, а ко второй – эффекты, обу- словленные распределением реагентов в системе.
3.2. Влияние иммобилизации на состояние фермента При иммобилизации существует опасность, что белок присоеди- нится к носителю в конформации, отличной от нативной. В этом слу- чае каталитическая активность фермента может существенно изме- ниться или вообще исчезнуть.
В реальных условиях в результате иммобилизации пространст-
венная структура фермента может, во-первых, либо существенно из- меняться, либо изменяться незначительно; во-вторых, остаться неиз- менной (что наблюдается чаще всего).
Изменение конформации нативного и иммобилизованного фер- ментов обусловлено одной из трех причин:
1. Модификацией каких-либо важных для структуры функцио- нальных групп белка, например, связанных с самим процессом иммо- билизации фермента (т. е. присоединением к носителю). Чтобы устра- нить действие этого фактора, необходимо, например, выбрать соответ- ствующий метод иммобилизации, не затрагивающий этих функцио- нальных групп в белке.
2. Взаимодействием (электростатические, гидрофобные, водород- ные связи) между ферментом и носителем, приводящие к денатурации.
В этом случае чаще всего достаточно просто заменить носитель.
3. Наличие большого числа связей между ферментом и носителем.
Вторая ситуация, когда в результате иммобилизации конформа- ция фермента не меняется, но нарушается динамика конформационных изменений в белке, а именно замедляются необходимые для катализа конформационные переходы, уменьшается число конформационных стадий и глубина их протекания. В этом случае, как показано, следует проводить иммобилизацию на инертных носителях.
Иногда исследователи целенаправленно стремятся «закрепить» или как говорят «заморозить» с помощью иммобилизации конформа- цию фермента, отличающуюся от нативной. Это, в частности, оказыва-
45 ется важным для детекции конформационных изменений в ферментах, индуцированных субстратами, кофакторами и специфическими лиган- дами.
Как показали многочисленные исследования «замороженные» кон- формации фермента могут отличаться от обычных, ненапряженных со- стояний, по целому ряду свойств: стабильности, доступности к действию модифицирующих агентов, сродству к субстрату и специфическим ли- гандам, а также каталитическим свойствам. Этот фактор необходимо учитывать, поскольку иммобилизацию фермента иногда рекомендуют проводить в присутствии ферментативной активности.
3.3. Эффекты распределения реагентов в катализе
иммобилизованными ферментами
Большое значение дляэффективной работы иммобилизованных ферментов приобретает распределение субстрата между раствором и ферментсодержащей матрицей, т. е. концентрация субстрата.
При высоких концентрациях субстрата эффекты распределения не существенны, поскольку в этом случае скорость ферментативной ре- акции не зависит от концентрации субстрата.
Если же концентрация субстрата невелика, то последующее кон- центрирование субстрата в матрице приводит к уменьшению значения
К
м
, т. е. к возрастанию ферментативной реакции.
Неравномерность распределения субстрата в системе обусловлена его взаимодействием с матрицей за счет, например, электростатиче- ских сил, водородных связей и т. п.
В случае тех ферментов, которые характеризуются низким срод- ством к субстрату или действуют на плохо растворимые субстраты выбор носителя для иммобилизации приобретает первостепенное зна- чение.
При рассмотрении распределения субстрата также большое зна- чение приобретают диффузионные ограничения. Если молекула фер- мента находится на поверхности (или внутри) частицы носителя, то для протекания ферментативной реакции необходимо, во-первых, что- бы молекула субстрата подошла к поверхности частицы, и, во-вторых, продифундировала внутри нее. В зависимости от того, как соотносятся скорости диффузионных стадий и непосредственно ферментативной реакции, может наблюдаться одна из трех ситуаций:
1. Если ферментативная реакция в поверхностных слоях частицы протекает быстрее, чем субстрат из раствора подходит к поверхности,
46 то через непродолжительное время вокруг частицы образуется зона, обедненная субстратом. В результате наблюдаемая скорость фермен- тативной реакции будет определяться скоростью массопереноса суб- страта к частице. В этом случае говорят, что процесс контролируется внешней диффузией.
К поверхности частицы носителя примыкает неперемешиваемый слой жидкости, в пределах которого перенос молекул происходит ис- ключительно за счет молекулярной диффузии. Поскольку молекулярная диффузия в жидкости проходит очень медленно (коэффициент диффузии
10
-5
–10
-6
см
2
/с), массоперенос может стать лимитирующей стадией процесса, катализируемого иммобилизованным ферментом (внешне диффузионное торможение).
2. Если
массоперенос субстрата проходит быстрее, чем идет фер- ментативная реакция на поверхности частицы, то может возникнуть дру- гой тип диффузионных затруднений. Если размер частицы носителя ве- лик, а фермент очень активен (или велика его плотность внутри части- цы), то практически весь субстрат израсходуется уже в приповерхностных слоях носителя, а глубинные области будут обеднены субстратом. В таком случае говорят, что процесс контролируется внутренней диффузией.
Иными словами скорость ферментативной реакции может лимити- роваться скоростью проникновения субстрата внутрь частицы. Внутри- диффузионное торможение ферментативных реакций зависит от формы частицы с иммобилизованным ферментом.
Теоретический анализ показывает, что роль внутридиффузионных ограничений в кинетикереакций, катализируемых иммобилизованными ферментами, сводится к увеличению константы Михаэлиса.
Существует два основных экспериментальных критерия, по кото- рым можно определить, протекает ли реакция, катализируемая иммоби- лизованным ферментом, во внутридиффузионном или внешнедиффузи- онном режиме. Они основаны на различной чувствительности кинетиче- ских параметров ферментативных процессов к действию специфических лигандов и температуры.
Например, для реакций контролируемых внутридиффузионно, когда ферментативная реакция существенно замедлена диффузией, имеем
К
м
>> [S]. Далее, ферментативные реакции, контролируемые внутренней диффузией, «чувствуют» эффекты ингибирования, рН-зависимы и т. д.
Энергия активации коэффициента диффузии D, получаемая из тем- пературных зависимостей, при внешнедиффузионных ограничениях рав- на 15–20 кДж/моль, а при внутридиффузионных – возрастает и становит- ся выше 40 кДж/моль.
47 3. Когда диффузия субстрата как к поверхностному слою, так и во внутренние области проходит достаточно быстро, общая скорость пре- вращений субстрата определяется непосредственной ферментативной реакцией. В этом случае говорят о кинетически контролируемом про- цессе.
Учет перечисленных выше диффузионных факторов является одним из наиболее сложных вопросов в катализе иммобилизованными фермен- тами.
В условиях насыщения фермента субстратом (К
м
<< [S]) фермента- тивный процесс не может лимитироваться диффузией, т. е. протекает в кинетическом режиме. Если же ферментативная реакция идет намного быстрее массопереноса, то ферментативный процесс протекает в диффу- зионном режиме.
Для оценки режима протекания ферментативного процесса чаще всего используют экспериментальные критерии. Рассмотрим основные из них.
1. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентра-
ции субстрата. Как уже отмечалось, в условиях насыщения иммобили- зованного фермента субстратом, т. е. при достаточно высоких концен- трациях последнего, ферментативный процесс, в принципе, не может контролироваться диффузией субстрата, и, таким образом, реакция про- текает по кинетическому типу. Однако по мере уменьшения концентра- ции субстрата повышается вероятность перехода реакционной системы в диффузионную область. В этом случае (рис. 3.3) в координатах Лайнуи- вера – Берка в зависимости V от S наблюдается выраженный излом: при концентрациях субстрата выше значения в точке излома (т. е. при низких значениях 1/[S]) реакция проходит в кинетическом режиме (прямая 1), а при низких концентрациях субстрата (высоких значениях 1/[S]) в диффу- зионном режиме (прямая 2).
1/V
0 кинетический режим
1/[S]
2 1 диффузионный режим
Рис 3.3. Зависимость скорости реакции, катализируемой иммо- билизованным ферментом в координатах Лайнуивера – Берка, осложненная внешнедиффузионными ограничениями
48
Следовательно, если для иммобилизованного фермента в координа- тах Лайнуивера – Берка получена аналогичная зависимость, то это ука- зывает на то, что диффузия играет важную роль в процессе.
Температурные зависимости. Ферментативные реакции характери- зуются обычно энергией активации порядка 40–120 кДж/моль. В то же время скорость процессов, протекающих в диффузионной области, должна слабо зависеть от температуры. Это связано с тем, что единст- венный к температуре параметр D характеризуется энергией активации порядка 15–20 кДж/моль. Поэтому слабая зависимость скорости реакции, катализируемой иммобилизованным ферментом, от температуры может служить указанием на диффузионный режим процесса.
Зависимость скорости реакции от удельной концентрации иммоби-лизванного фермента (количество активного фермента на 1 г носителя).
Скорость реакции в диффузионной области не должна изменяться при возрастании удельной концентрации иммобилизованного фермента.
Скорость реакций в этом режиме не должна также зависеть от сдвигов рН среды, ионной силы и т. д.
Зависимость скорости реакции от степени измельчения частиц с иммобилизованными ферментами. В кинетической области скорость ре- акции не должна зависеть от степени измельчения частиц содержащих катализатор (если нет внутридиффузионных ограничений для субстрата).
С другой стороны, скорость диффузионноконтролируемых реакций бу- дет возрастать, поскольку уменьшение размера частиц с иммобилизован- ным ферментом способствует диффузии субстрата к ферменту.
Зависимость от скорости перемешивания. Влияние диффузионных факторов ослабляется по мере ускорения массопереноса при более ин- тенсивном перемешивании. Известно, что на любой поверхности суще- ствует неперемешиваемый слой жидкости. Толщина неперемешиваемого слоя уменьшается при увеличении скорости потока жидкости вокруг частицы. Зависимость наблюдаемой скорости ферментативной реакции от скорости перемешивания или скорости протока субстрата указывает на существенную роль диффузии в процессе.
Существенное ускорение перемешивания может, в принципе, пере- вести реакцию из диффузионной области в кинетическую.
Стерические ограничения. Пространственная сетка матрицы, в ко- торой иммобилизован фермент, может
препятствовать передвижению молекул субстрата, например, в силу чисто механических причин. В ре-
49 зультате активные центры части ферментативных молекул становятся недоступными для субстрата. Фактически это означает снижение кон- центрации активного фермента и приводит куменьшению наблюдаемой скорости ферментативной реакции. Следовательно, хотя истинные ка- талитические параметры не изменились, фермент не может полностью проявить свою потенциальную активность.
Уменьшение каталитической активности фермента за счет стери- ческих факторов проявляется особенно часто в случае высокомолеку- лярных субстратов. Стерические ограничения иногда удается умень- шить или даже полностью устранить путем изменения свойств носите- лей под действием химических реагентов (мягкой обработкой окисли- телями, кислотами и т. д.) или специальными ферментами (декстрана- зой, целлюлазой и др.) При этом важно не затронуть первичную струк- туру и не нарушить пространственную организацию ферментов, при- шитых к носителю.
Среди других факторов, влияющих на распределение реагентов в катализе иммобилизованными ферментами, можно отметить рН- эффекты, эффекты ингибирования и активации, гистерезисные и коле- бательные свойства иммобилизованных олигомерных ферментов и др.
3.4. Стабильность иммобилизованных ферментов
Одним из требований технологичности ферментов является их вы- сокая стабильность. Даже небольшие отклонения внешних условий, ко- торые характерны для микроокружения ферментов в клетке, может ока- заться достаточным, чтобы нарушить структуру и функцию ферментов, т. е. инактивировать их.
Для практических целей, однако, часто требуется, чтобы ферменты работали при повышенных температурах, экстремальных значениях рН, в присутствии высоких концентраций органических растворителей или поверхностно-активных веществ и т. п.
В связи с этим возникает проблема существенного увеличения ста- бильности ферментов.
Какие факторы вызывают инактивацию свободных ферментов?
Иногда эти факторы условно разделяют на физические и химические. К первым относят нагревание или охлаждение, облучение (γ-рентгеновские лучи), ультразвук, сорбцию и т. д. К химическим относят действие щело- чи, кислоты, ПАВ, окислителей и т. д.
Однако это разделение практически ничего не дает для понимания сути и механизма инактивационных процессов.
50
Более информативной, с точки зрения решения стабилизационной задачи, является классификация инактивационных процессов по молеку- лярным механизмам.
В наиболее общем случае инактивационный процесс представляют в виде двухстадийной схемы:
N, D и I – соответственно нативная, обратимо денатурированная и необратимо инактивированная форма белка. Первая стадия ча- ще всего представляет собой обратимое конформационное изменение, в случае олигомерных ферментов эта стадия состоит в обратимой диссо- ции на субъединицы. Вслед за обратимыми процессами протекают необ- ратимые стадии Механизмы инактивации ферментов, как пра- вило, классифицируют, исходя из процессов, происходящих именно во второй, необратимой стадии.
Коротко рассмотрим основные инактивационные механизмы.
Агрегация. При длительной инкубации в растворе с повышенной температурой, экстремальных значениях рН, в присутствии денатури- рующих агентов белки агрегируют.
Изменение первичной структуры. Все химические процессы, при- водящие к инактивации белков, можно подразделить на две группы. К первой относятся реакции разрыва полипептидной цепочки, ко второй
– химическая модификация отдельных функциональных групп белка, среди которых наиболее существенны следующие: гидролиз пептид- ных связей, протеолиз, автолиз, окисление функциональных групп фермента, химическая модификация участвующих в катализе SH- групп, фосфорилирование белков in vivo, радиационное воздействие и др.
Десорбция кофактора из активного центра фермента. У многих ферментов в состав активных центров входят атомы металлов, метал- лосерные группы (кофакторы). При нагревании может cдвигаться рав- новесие между кофактором и белком и кофакторы диссоциируют из активных центров ферментов в раствор. Последнее приводит в ряде случаев к необратимой инактивации фермента.
Диссоциация олигомерных белков на субъединицы может проис- ходить при действии многих денатурантов (мочевины, детергентов, кислот, нагревании и т. п.).
Процесс этот, в принципе, обратимый. Однако, как правило, вслед за стадией диссоциации происходят другие процессы: конформацион-
N
D
I
(N
D)
(D
I).
51 ные изменения в отдельных субъединицах, диссоциация кофакторов из активных центров, агрегация субъединиц и др., т. е. происходят необ- ратимые процессы.
Сорбция белка на стенках реакционного сосуда. На поверхности ре- акционного сосуда (например, стекла) могут присутствовать нескомпен- сированные заряженные группы и потенциальные доноры и акцепторы водородных связей, т. е. на поверхности происходит сорбция ферментов за счет образования слабых нековалентных взаимодействий. Это приво- дит к уменьшению концентрации фермента в растворе, т. е. кажущейся инактивации.
«Сорбционная инактивация» становится весьма заметной в разбав- ленных растворах белка (концентрация 10
–8
–10
–10 моль/л).
Инактивация в потоке. Этот тип инактивации особенно важен при проведении ферментативных процессов в проточных реакторах. По- видимому, это связано с тем, что в потоке происходит механическая де- формация белковых молекул.
Необратимые конформационные изменения (необратимая денату-рация). Механизм необратимой денатурации состоит в следующем. При денатурационном воздействии (температура) в белке разрушаются «пра- вильные» нековалентные взаимодействия, которые поддерживают на- тивную структуру, и образуются «ненативные» нековалентные взаимо- действия, термодинамически выгодные при повышенной температуре.
При охлаждении эти «неправильные» нековалентные взаимодействия
сохраняются по чисто кинетическим причинам, поскольку молекулярная подвижность существенно уменьшается при понижении температуры.
Иными словами, в результате охлаждения белок оказывается «заморо- женным» в метастабильном «необратимо денатурированном» состоянии и не может самопроизвольно перейти в нативную форму.
Для иммобилизованных ферментов число возможных инактиваци- онных механизмов существенно меньше, чем в случае растворимых ферментов.
Каким образом иммобилизация помогает устранить инактивационные ферментативные процессы? Иммобилизация подавляет такие процессы, как агрегация и автолиз.
Дело в том, что в иммобилизованном состоянии подвижность белков, как правило, резко ограничена, поэтому молекулы в значительно меньшей степени подвержены этим процессам. По этой же причине исключен и механизм инактивации путем сорбции на поверхности и часто удается затормозить необратимую диссоциацию олигомерных белков на субъе- диницы.
52
Иммобилизация на (или в) носителе, как правило, создает вокруг молекул фермента стерические ограничения, т. е. как бы экранирует их от внешнего раствора. Это приводит к существенному ограничению диффузии молекул других, не связанных с носителем ферментов, в част- ности протеаз, фосфорилаз, фосфатаз. Поэтому для иммобилизован- ных ферментов практически не наблюдаются такие процессы, как протеолиз, микробное заражение и фосфорилирование.
Иммобилизованные белки стабильнее нативных по отношению к инактивации в потоке. Причина заключается в том, что носитель ме- ханически защищает молекулы ферментов от деформаций в потоке, выполняя роль своеобразного демпфера.
В последние годы при иммобилизации начали активно приши- вать молекулу кофактора в районе активного центра фермента или совместно иммобилизовать молекулы кофактора и фермента на одном носителе в непосредственной близости друг от друга. С помощью та- ких приемов становится возможным подавить такой инактивацион- ный механизм, как десорбция кофактора из активного центра фермен- та.
Наиболее сложная задача – затормозить химические изменения в белке, приводящие к инактивации. Однако, и в этом случае иммоби- лизация, в ряде случаев, оказывает положительное влияние. Напри- мер, когда инактивация происходит под действием пероксида водо- рода или супероксидных радикалов, хорошо зарекомендовал себя следующий прием. Подвергающийся инактивации белок иммобили- зуют совместно с каталазой или супероксиддисмутазой – фермента- ми, катализирующими разложение Н
2
О
2
и О
2
соответственно.
Некоторые ферменты инактивируются вследствие окисления ки- слородом воздуха высокореакционных функциональных групп их ак- тивного центра и в первую очередь SH-групп. Такую инактивацию также удается подавить методами иммобилизации. Для этого фермент иммобилизуют в полиэлектролитной матрице, обладающей способно- стью «высаливать кислород». В результате фермент экранирован от контакта с инактиватором и стабильность его по отношению к окис- лению становится существенно выше, чем у неиммобилизованного.
Кроме того, можно создать условия для конкуренции за вещество
– инактиватор. Например, многие ферменты, имеющие SH-группы, необходимые для катализа, инактивируются в результате их «отрав- ления» катионами тяжелых металлов по механизму образования мер- каптидов. Иммобилизуя такой фермент с другим белком с высоким содержанием реакционно-способных SH-групп или пришивая к мат-
53 рице носителя низкомолекулярные тиолы, добиваются того, что ос- новная часть катионов металлов расходуется не на «отравление» фермента, а на модификацию SH-групп «несущественного» белка или тиола.
Далее, можно, в какой-то мере, предотвратить с помощью иммоби- лизации первичные обратимые стадии денатурации и диссоциации на- тивных белков.
Любой инактивационный процесс начинается с обратимой реакции
Ее молекулярный механизм сводится либо к обратимому конформационному изменению (обратимая денатурация), либо, в случае олигомерных белков, к обратимой диссоциации на субъединицы. В этом случае стабилизация ферментов состоит в том, чтобы подавить первую стадию.
На основе познания указанных процессов стало возможным прово- дить целенаправленный поиск конкретных путей стабилизации, как мо- номерных белков, так и ферментов с четвертичной структурой.
В общем случае можно указать три причины изменения стабильно- сти в результате иммобилизации:
1. Изменение конформации иммобилизованного фермента по срав- нению с нативной структурой.
2. Изменение микроокружения ферментной молекулы.
3. Ужесточение нативной конформации белковой глобулы.
Первые два фактора еще мало изучены. Более перспективным пред- ставляется третий путь – ужесточение (закрепление) нативной конфор- мации фермента с целью воспрепятствовать ее разворачиванию.
Ужесточение структуры фермента можно проводить несколькими путями.
Нековалентные связи (электростатические, водородные и т. д.) прак- тически не образуются в разбавленных растворах полимерных носите- лей.
Ситуация существенно изменяется при включении ферментов в концентрированные полимерные гели, поскольку здесь становится воз- можным многоточечное взаимодействие за счет слабых нековалентных сил фермента с носителем. Это происходит благодаря тому, что в таких гелях полимерные цепи со всех сторон окружают ферментную глобулу.
Такое многоточечное взаимодействие в гелевых системах действительно имеет место и приводит к существенной стабилизации ферментов.
С практической точки зрения применение гелевых систем имеет один существенный недостаток. Частички геля склонны к набуханию в воде, что приводит к снижению концентрации полимерных цепей в геле.
(N
D).
54
В результате эффект стабилизации включенного в гель фермента может ослабевать или вовсе исчезать.
Другой путь ужесточения структуры фермента заключается в его иммобилизации на носителе с образованием большого числа ковалент- ных связей (многоточечное ковалентное присоединение фермента к по- верхности носителя) (рис. 3.4).
В этом случае используют сополимеризационный метод иммобили- зации, позволяющий создать полимерный носитель, комплементарный молекуле фермента. Фермент химически модифицируют (например, по аминогруппам) аналогом мономера, т. е. соединением, содержащим не- насыщенные связи (например, хлорангидридом акриловой кислоты). При последующей сополимеризации с мономером белковая глобула форми- рует вокруг себя поверхность носителя, комплементарную собственной, и ковалентно к ней присоединяется. Сополимеризационный метод дает уникальную возможность получать препараты ферментов, пришитых различным числом ковалентных связей к поверхности носителя, за счет варьирования модификации на стадии обработки фермента аналогом мо- номера.
Эффект стабилизации возрастает с увеличением числа связей между ферментом и носителем. Эффект зависит только от числа ковалентных связей с носителем, и не зависит ни от плотности гелевого носителя (т. е. концентрации полимера в геле), ни от степени его набухания.
Рис. 3.4. Схематическое изображение иммобилизованных подходов к стабилизации ферментов:
а –
многоточечное ковалентное связывание;
б – сшивание биофункциональными реагентами;
в – включение в поры носителя.
Фермент
Биофункцио-нальный реагент
Активный центр
а б в
55
Еще один подход – внутримолекулярное сшивание фермента би- функциональными реагентами – увеличивает конформационную жест- кость белка, и, следовательно, его стабильность. Этот подход (внутримо- лекулярное сшивание белка) активно используется в природе для увели- чения стабильности белковых структур. К числу «природных сшивок» относятся как ковалентные S–S связи, так и нековалентные «солевые мостики», Са
2+
и др. металлов, связанные с молекулой белка и т. п.
Метод сшивок весьма эффективен, поскольку позволяет получать водорастворимые стабилизированные производные ферментов с относи- тельно низкой молекулярной массой (сравнимой с молекулярной массой самого фермента).
Разворачиванию белковой глобулы можно также воспрепятствовать, если поместить молекулу фермента в ячейку носителя, не взаимодейст- вующую с ней ни химически, ни сорбционно, но столь «тесную», кото- рая не давала бы возможности образовываться развернутой конформации по стерическим причинам. Этот прием называют как механическое включение фермента в «тесные» поры носителя.
Стабилизацию фермента подобным образом методически проще всего осуществить включением белков в полимерные гели. Включая фермент в гели различной концентрации, можно реализовать ситуацию, когда белковая глобула окажется «зажатой» полимерными цепями носи- теля и благодаря этому не сможет развернуться. В таких случаях дости- гаются существенные стабилизационные эффекты: включенные в гель ферменты в тысячи раз стабильнее своих нативных предшественников, причем стабилизация проявляется тем сильнее, чем выше концентрация полимера.
Существуют и другие методы стабилизации ферментов, не основан- ные на методе иммобилизации. Например, стабильные препараты фер- ментов можно создавать методами химической модификации и белковой инженерии.
3.5. Ферментные электроды
Ферментный электрод – это комбинация датчика, основанного на использовании ионселективного электрода, с иммобилизованным фер- ментом, обеспечивающая высокоселективный и высокочувствительный метод определения данного субстрата. Первые сообщения об измерении концентрации глюкозы в биологических растворах и тканях с помощью электрода, в котором использовали глюкозооксидазу, иммобилизован- ную в геле на поверхности полярографического кислородного электрода,
56 появились в 1962 году. Этиэлектроды были датчиками вольтамперомет- рического или амперометрического типа, т. е. они позволяли измерить ток при наложении постоянного напряжения. Первый потенциометриче- ский ферментный электрод (который позволяет измерять разность по- тенциалов в системе без внешнего приложения напряжения) был пред- ложен в 1969 г. для определения концентрации мочевины с помощью уреазы, иммобилизованный на рН электроде. К настоящему времени описано более 100 различных электродов вклющающие различные ферменты. Например, для определения L-Тирозина (тирозиндекарбок- силаза), L-Глутамина (глутаминаза), молочной кислоты (локтатдегид- рогеназа), янтарной кислоты (сукцинатдегидрогеназа), пенициллина
(пенициллиназа), холестерола (холестеролоксидаза) и т. д.
Для изготовления ферментного электрода сначала подбирают подходящую ферментную систему: действие электрода должно осно- вываться на первичной функции фермента, т. е. на основной реакции, которую он катализирует в природе. В некоторых случаях можно ис- пользовать фермент, для которого определяемое вещество служит вто- ричным субстратом – алкогольдегидрогеназу для определения уксус- ной кислоты.
При создании ферментных электродов следует обратить внимание на характеристики чистоты фермента. Это существенно для избежания побочных реакций с участием других субстратов. Также необходимо принимать во внимание и активность фермента.
Затем необходимо выбрать ионселективный датчик.
Таблица 3.2
Электродные датчики, используемые для конструирования
ферментных электродов
Датчики
Определяемое вещество
Датчики для потенциометрических электродов
NH
3
Мочевина, аминокислоты, глутамин, нитрат и др.
CO
2
Мочевина, аминокислоты, ферментные системы декарбок- силирования pH
Пенициллин, РНК, ДНК, глюкоза и др.
Датчики для амперометрических электродов
O
2
Глюкоза, аминокислоты, спирты, мочевая кислота, холесте- рол, фосфат, ферменты – катализирующие поглощение О
2
Pt или С
Окислительно-восстановительные ферменты, сульфат, холе- стерол, спирты, глюкоза, органические кислоты и др.
Тип датчика, на основе которого готовят электрод, следует выби- рать в соответствии с природой ферментативной реакции. Датчик дол-
57 жен реагировать на один из продуктов или субстратов ферментативной реакции.
Следует помнить, чем прочнее иммобилизован фермент, тем он ста- бильнее, тем дольше им можно пользоваться и тем больше измерений можно провести.
Изготавливают ферментные электроды несколькими способами.
Например, на основе фермента, физически включенного в гель, или ковалентно связанного и т. п. Процедура изготовления в общем виде сводится к следующему. Берут электродный датчик (ионселективный электрод) и поворачивают сенсорной частью вверх. На поверхность сенсорной части наносят фермент, накрывают диализной мембраной и закрепляют последнюю резиновым кольцом –электрод с диализной мембраной.
Сенсорную поверхность датчика покрывают нейлоновой сеточ- кой, которую закрепляют резиновым кольцом. Затем приготавливают раствор для получения геля, содержащего фермент, и наносят его на сеточку. Далее проводя полимеризацию геля при освещении раствора лампой с рефлектором, получают сухой и прочный слой геля, содер- жащего фермент. Для защиты ферментного слоя накрывают его диа- лизной мембраной и закрепляют еще одним резиновым кольцом.
В случае ковалентного связывания фермент иммобилизуют на не- растворимом носителе, а затем помещают на основной датчик и на- крывают диализной мембраной.
Следует отметить, что иммобилизация фермента заметно повышает его чувствительность к факторам окружающей среды. Например, при ис- пользовании в электроде алкогольоксидазы для определения уксусной кислоты помехой выступает природный субстрат – этанол. В этой же ро- ли могут выступать ингибиторы ферментов.
После изготовления ферментный электрод используют как любой другой ионселективный электрод.
Конечный ответ ферментного электрода определяет несколько ста- дий:
– перенос субстрата к поверхности электрода;
– диффузия субстрата через мембрану к активному центру фермента;
–
реакция в активном центре;
– перенос продукта ферментативной реакции через мембрану к по- верхности ионселективного электрода;
– измерение концентрации продукта у поверхности электрода.
Скорость первой стадии (переноса субстрата) сильнее других зави- сит от скорости перемешивания раствора: при интенсивном перемеши-
58 вании субстрат быстро доставляется к поверхности электрода. В случае фермента с высокой активностью мембрана может быть очень тонкой.
При этом влияние второй и четвертой стадий сводится к минимуму или вообще устраняется. Поскольку стадия третья очень быстрая, время от- клика электрода теоретически должна приближаться по времени отклика основного датчика. Многие исследователи показали, что это достигается при использовании тонких мембран и интенсивном перемешивании.
Весьма важной характеристикой электрода является его стабиль- ность, т. е. сохранение активности во времени, которая зависит от спосо- ба иммобилизации фермента. Параметры иммобилизации и стабильности фермента определяются раздельно в двух вариантах: при хранении в су- хом состоянии и при использовании электрода. Большинство раствори- мых ферментов, за исключением некоторых препаратов глюкозооксида- зы, которые весьма стабильны в неочищенном виде, в среднем сохраня- ют стабильность (активность) в течение недели или 25–30 анализов.
Ферменты, иммобилизованные физическим включением в гель, спо- собны сохранять активность 3–4 недели, что эквивалентно проведению
50–200 анализов. Для ковалентно иммобилизованного фермента этот диапазон составляет 200–1000 анализов. В последние годы получены коммерческие препараты ферментов на нейлоновых трубках, позволяю- щие проводить до 10 000 измерений.
Стабильность электрода определяется содержанием фермента в но- сителе, правильным подбором оптимальных условий эксплуатации и стабильностью самого датчика, на основе которого сделан электрод.
Ковалентное связывание по сравнению с простым включением в гель является предпочтительным по двум причинам: Во-первых, оно по- зволяет изменять рабочий диапазон рН; а во-вторых, обеспечивает луч- шее связывание любого фермента.
Рабочий диапазон определяемых концентраций для большинства ферментных электродов составляет 10
-2
–10
-4
М. Для некоторых электро- дов верхний предел может быть 10
-1
М (в зависимости от растворимости субстрата в водных растворах), а нижний может доходить до 10
-5
М или еще ниже в зависимости от порога чувствительности датчика.
Ухудшение работы ферментного электрода может проявляться в следующем:
– снижение со временем верхнего предела определяемых концен- траций, например, с 10
-1
М до 10
-2
М;
– уменьшении наклона калибровочной кривой (т. е. кривой зависи- мости потенциала от логарифма концентрации) с 60 мВ до 50 мВ, 40 мВ и ниже;
59
– увеличение времени отклика электрода, исходное значение кото- рого составляет 0,5–4 мин.
При изготовлении электрода очень важна высокая чистота препара- та, позволяющая использовать фермент в небольших количествах, что обеспечивает малую величину времени отклика.
В последние годы появились ферментные электроды, в которых в качестве чувствительного элемента используются ферменты целых кле- ток микроорганизмов и тканей. В этом случае целые клетки или ткани наносятся на поверхность ионселективных электродов. Впервые датчик такого типа, описан Дивисом в 1975 г., который отмечал следующие их достоинства:
1. Нет необходимости получать очищенные ферменты.
2. Электрод можно регинирировать погружением в питательную среду. Микроорганизмы сохраняют жизнеспособность долгое время.
3. Целые клетки могут содержать несколько кофакторов и фермен- тов, катализирующих реакции, которые трудно, или вообще невозможно осуществить с помощью одного иммобилизованного фермента. Кроме того, кофакторы, необходимые для ферментативных реакций, находятся естественно в иммобилизованном состоянии.
Однако у таких электродов есть и недостатки:
1. Низкая селективность, обусловленная присутствием в клетках микроорганизма ряд ферментов, которые могут катализировать побоч- ные реакции.
2. Часто наблюдается медленный отклик электрода (большая посто- янная времени ответа), поскольку концентрации ферментов в клетках низкие, а мембрана электрода довольно толстая, что замедляет диффузи- онные процессы.
В качестве примеров можно привести использование клеток Neuro-
spora europea для определения аммиака; Trichosporon brassicae – уксус- ной кислоты; Sarcina flava – глутамина; Azotobacter vinelandii – нитрат- ион; срезы почек свиньи – для определения глутамина.
Скачать 1.14 Mb.