Учебнометодический комплекс по учебной дисциплине иммобилизованные клетки и ферменты для специальностей
 Скачать 1.14 Mb.
|
БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Биологический факультет Кафедра клеточной биологии и биоинженерии растений УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ПО УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЕ Иммобилизованные клетки и ферменты для специальностей 1-31 01 01 Биология (по направлениям) направлений 1-31 01 01-01 Биология (научно-производственная деятельность) и 1-31 01 01-03 Биология (биотехнология); 1-31 01 02 Биохимия Составители: докт. биол. наук, профессор Юрин В.М. канд. биол. наук, доцент Дитченко Т.И. 2 РЕЦЕНЗЕНТЫ: Кафедра биотехнологии и биоэкологии Учреждения образования «Бело- русский государственный технологический университет»; Т.И. Фоменко, заведующая лабораторией клеточной биотехнологии ГНУ «Центральный ботанический сад НАН Беларуси», кандидат биологиче- ских наук 3 СОДЕРЖАНИЕ ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА 4 1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ 6 2. ПРАКТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ 125 3. КОНТРОЛЬ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ СТУДЕНТОВ 130 Задания для самоконтроля 130 Вопросы для подготовки к зачету 133 Темы рефератов 135 4. ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ 137 Учебно-программные материалы 137 Список рекомендуемой литературы и Интернет-ресурсов 137 4 ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Учебно-методический комплекс (УМК) по учебной дисциплине «Иммобилизованные клетки и ферменты» создан в соответствии с требо- ваниями Положения об учебно-методическом комплексе на уровне выс- шего образования и предназначен для студентов направлений специаль- ности 1-31 01 01-01 Биология (научно-производственная деятельность), 1-31 01 01-03 Биология (биотехнология) и специальности 1-31 01 02 Био- химия. Содержание разделов УМК соответствует образовательным стан- дартам высшего образования данных специальностей. Главная цель УМК – оказание методической помощи студентам в систематизации учебного материала в процессе подготовки к итоговой аттестации по учебной дис- циплине «Иммобилизованные клетки и ферменты». Структура УМК включает: 1. Учебно-методическое обеспечение дисциплины 1.1. Теоретический раздел (учебное издание для теоретического изу- чения учебной дисциплины). 1.2. Практический раздел (материалы для проведения лабораторных занятий по учебной дисциплине в соответствии с учебным планом). 2. Контроль самостоятельной работы студентов (материалы текущей и итоговой аттестации, позволяющие определить соответствие учебной деятельности обучающихся требованиям образовательных стандартов высшего образования и учебно-программной документации, в т.ч. вопро- сы для подготовки к зачету, задания, тесты, вопросы для самоконтроля, тематика рефератов и др.). 3. Вспомогательный раздел. 3.1. Учебно-программные материалы (типовая учебная программа, учебные программы учреждения высшего образования для студентов дневной и заочной форм получения образования). 3.2. Информационно-аналитические материалы (список рекомен- дуемой литературы, перечень электронных образовательных ресурсов и их адреса и др.). Работа с УМК должна включать ознакомление с тематическим пла- ном дисциплины, представленным в типовой учебной программе. С по- мощью учебной программы учреждения высшего образования по учеб- ной дисциплине можно получить информацию о тематике лекций и ла- бораторных занятий, перечнях рассматриваемых вопросов и рекомен- дуемой для их изучения литературы. Для подготовки к лабораторным за- нятиям и промежуточным зачетам необходимо использовать материалы, представленные в разделе учебно-методическое обеспечение дисципли- 5 ны, а также материалы для текущего контроля самостоятельной работы. Для написания рефератов могут быть использованы информационно- аналитические материалы, указанные в соответствующем разделе УМК. 6 1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ 1. Юрин, В. М. Иммобилизованные клетки и ферменты: курс лекций / В.М. Юрин. Минск: БГУ, 2006. 2. Краткие презентации лекций по учебной дисциплине для студен- тов дневной и заочной форм получения образования доступны по адресу http://bio.bsu.by/fbr/kursy_immobilization.html ВВЕДЕНИЕ Много тысяч лет человек умеет выпекать хлеб, делать вино, дубить кожу и т. д. Он научился этим необходимым операциям, не вникая в суть происходящих биологических процессов. Однако понимание клеточного метаболизма и каталитических свойств ферментов позволяют человеку более полно использовать возможности клеток и ферментов для бытовых промышленных, медицинских и др. целей. Почему иммобилизация? Во многих случаях разработка практиче- ских методов, включающих в качестве компонента биологический эле- мент, зависит от способности стабилизировать или сохранить этот био- логический элемент, будь то большая молекула или частица. В послед- ние годы набор способов сохранения активности биологических объек- тов значительно расширился, в разработке этих способов иммобилизация играет все большую роль. Иммобилизация – это процесс фиксации био- объекта с помощью физико-химических сил на носителе. Иммобилизация входит в дисциплину, носящую название «биотех- нология». Этот раздел науки, основываясь на последних достижениях в области микробиологии, биохимии, физиологии и молекулярной генети- ки, одной из своих целей ставит использование процессов, протекающих под действием ферментов, для получения необходимых человеку про- дуктов. Высокая специфичность ферментативного катализа обеспечивает большой выход продукта и позволяет создать практически безотходные производства. Эффективность ферментативных процессов, используе- мых в самых разных областях человеческой деятельности (медицина, энергетика, пищевая промышленность, микроэлектроника), удалось уве- личить с помощью иммобилизованных препаратов. Иммобилизованные ферменты и др. биопрепараты оказываются более стабильными и могут использоваться неоднократно. Однако нужно отметить, что применение иммобилизованных препа- ратов индивидуальных ферментов оказалось менее успешным, чем на- деялись. В качестве недостатков следует назвать нестабильность фер- 7 мента в процессе работы и способность катализировать одну единствен- ную реакцию. Кроме того, для практических целей могут использоваться те ферменты, которые не требуют регенерации кофакторов. Один из не- достатков попытались решить методом микрокапсулирования (инкапсу- лирование). Микрокапсулирование это удержание (иммобилизация) ис- ходного раствора, содержащего фермент или другие биопрепараты, а не создание физико-химических сил, необходимых для иммобилизации. В этом случае иммобилизуется целиком исходный раствор, а не отдельные молекулы, скажем фермента. При микрокапсулировании используют мембраны, подобные мембранам природных клеток. С помощью мем- бран осуществляется контроль размеров молекул, проникающих внутрь капсулы или выходящих из нее. Большие молекулы, также как ферменты или белки, удерживаются внутри микрокапсулы, тогда как малые моле- кулы субстрата и продукта могут свободно диффундировать через окру- жающую оболочку. Одним из преимуществ микрокапсулирования перед равномерным включением фермента является большая площадь поверх- ности, приходящая на единицу активности иммобилизованного фермен- та, что позволяет использовать высокие концентрации фермента в ис- ходном растворе и достигать высокой эффективности действия иммоби- лизованного фермента. Микрокапсулированию можно подвергать и от- дельные биомолекулы и клетки. Микрокапсулирование сейчас успешно используется при создании коммерческих препаратов, внутреннее содержимое которых составляют масло, духи, лекарственные средства и т. д. Вообще же недостатки, характерные для процесса иммобилизации ферментов, способствовали развитию интереса к использованию потен- циальных возможностей клеточного метаболизма, т. е. использованию целых клеток. Действительно, многие примеры иммобилизованных кле- ток можно найти в природе и впервые их применили в технологическом процессе более 150 лет назад (быстрый способ получения уксуса). Использование иммобилизованных клеток позволяет избежать не- обходимость выделения и очистки требуемых ферментов. Поскольку клетки микроорганизмов являются поистине бесконеч- ным источником самых разнообразных ферментов, естественно, что в первую очередь именно они были использованы для иммобилизации. Живая клетка, в отличие от фермента представляет собой готовый био- технологический реактор, в котором реализуются не только процессы, приводящие к образованию конечного продукта, но и ряд других, спо- собствующих поддержанию каталитической эффективности системы на высоком уровне (например, регенерация кофакторов). 8 Существует, по меньшей мере, четыре области, в которых находят применение иммобилизованные ферменты и клетки, а именно: промыш- ленность, охрана окружающей среды, различного рода анализы и произ- водство лекарственных препаратов. Примерами первой области являются синтез аминокислот, произ- водство сахарных сиропов, молочных продуктов и т. д. В системе охраны окружающей среды иммобилизованные препараты применяются для очистки сточных вод и гидролиза городских, промышленных и с/х сто- ков, содержащих целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин. При этих процес- сах утилизируется энергия в форме метана или этанола, т. е. очевидны социальные и экономические выгоды. Примеры производства лекарств – синтез антибиотиков, алкалоидов и т. д. Препараты микрокапсулирован- ных ферментов испытаны при лечении больных с генетическими нару- шениями, у которых отсутствуют соответствующие ферменты. Такие препараты могут применяться для улучшения пищеварения, удаления токсических метаболитов, предотвращение роста опухолей. Иммобилизованные ферменты могут быть использованы для анали- за, в частности применяются ферментные электроды, например для реги- страции концентрации глюкозы или мочевины в биологических или дру- гих жидкостях. Кроме того, можно надеяться, что помимо практического применения изучение включенных в носитель или инкапсулированных ферментов и клеток будет способствовать лучшему пониманию их функ- ционирования in vivo. Исследования в области иммобилизации ферментов и клеток чрез- вычайно важны и, по-видимому, сохранят свое значение в обозримом будущем. Развитие инженерной энзимологии и способов модификации клеток будет зависеть от результатов этих исследований все в большей степени. 9 Глава 1. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ИММОБИЛЛИЗАЦИИ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОСИТЕЛЕЙ Иммобилизацию можно рассматривать как физическое разделение биокатализатора (клеток, клеточных фракций или ферментов) и раство- рителя, при котором молекулы субстрата и продукта могут легко обме- ниваться между фазами. Разделение катализатора и растворителя может быть достигнуто либо адсорбционным, либо ковалентным связыванием с нерастворимым органическим или неорганическим носителем, либо свя- зыванием отдельных молекул катализатора друг с другом с образованием агрегатов или сополимеров. Недостатком этих методов иммобилизации является необходимость использования большого количества катализа- торов. Кроме того, химическая модификация, которой подвергаются препараты (ферменты, клетки) в процессе иммобилизации, может неже- лательным образом изменить их каталитические и другие свойства. По этой причине многие исследователи предпочитают отделение клеток или ферментов от остального объема и включение в носитель или инкапсу- лирование. Таким образом, катализатор можно включить в полимерную сетку, например полиакриламидного геля или геля альгината кальция, путем проведения полимеризации или реакции полярного сшивания геля в при- сутствии ферментов или клеток. Родственными методами являются либо инкапсулирование в липо- сомы, нейлоновые или коллодиевые мембраны, либо их физическое от- граничение от других компонентов в аппаратах для ультрафильтрации. Для облегчения работы с частицами, содержащими биокатализатор, им придают по возможности сферическую форму. При одностадийной катализируемой реакции иммобилизуют или подходящий фермент, или жизнеспособные клетки, обладающие необхо- димой активностью. В первом случае, чтобы увеличить степень включе- ния и свести к минимуму утечку фермента, требуется высокая степень сшивки носителя. Однако при высокой степени сшивки может ограни- читься диффузия молекул субстрата и продукта внутрь частиц носителя и из них наружу. Эта проблема исчезает в случае иммобилизации клеток. Поскольку размеры клеток относительно велики, то можно использовать носители с низкой степенью сшивки и, следовательно, с хорошими диф- фузионными свойствами. Для катализа многостадийных реакций, например превращение глюкозы в этанол, где регенерация и удержание кофакторов является обязательным условием, необходимо особое внимание уделять влиянию 10 сшивающих агентов на жизнеспособность клеток. Нужно также иметь ввиду и подачу и отвод необходимого для данных клеток количества га- зов (кислорода, СО 2 ). Таким образом, включение живых клеток требует мягких условий иммобилизации; носитель при этом должен представ- лять систему открытых пор, обеспечивающих хорошие условия для газо- обмена. К сожалению, частицы носителя, полученные с учетом этих тре- бований, обладают низкой прочностью. Этот фактор особенно важен при увеличении масштабов процесса. Для получения иммобилизованных ферментов и клеток использует- ся огромное число носителей. Основные требования, предъявляемые к материалам, которые могут быть применены в качестве носителя для иммобилизации: высокая меха- ническая, химическая и биологическая устойчивость (стойкость), обес- печивающая стабильность получаемых иммобилизованных препаратов; возможность получения технологически удобных форм (гранул, мем- бран, листов и т. д.); носитель не должен затрагивать активность фермен- та или ферментативные системы клетки при реализации конкретной тех- нологии, необходимо исключить нежелательные воздействия носителя (токсичность, температура, стресс и т. д.); надежное удержание фермента и клетки носителем; материал носителя не должен препятствовать обес- печению иммобилизованного препарата субстратами, газообмену и от- воду продуктов жизнедеятельности; высокая гидрофильность, обеспечи- вающая возможность реакций в водной среде; дешевизна носителя и простота иммобилизации, т. е. экономическая оправданность. Выполнить все требования невозможно, поэтому необходимо нахо- дить компромисс между «идеальным» и «реально возможным». Для при- ближения к оптимальному варианту необходима разработка научно- обоснованных подходов для выбора путей иммобилизации. Выбор путей иммобилизации и материала носителя на эмпирической основе – это на- дежда на случайную удачу, требующую больших затрат труда, времени и веществ. Поэтому необходимо в этом направлении проведение фундамен- тальных исследований. Отсутствие носителей, удовлетворяющих одновременно всем требо- ваниям, и разнообразие задач, стоящих перед экспериментаторами, обу- славливают широкий набор применяемых для иммобилизации материа- лов. Для иммобилизации используются как органические, так и неорга- нические материалы. Существующие в настоящее время органические полимерные носи- тели можно разделить на два класса: природные полимеры и синтетиче- 11 ские полимерные носители. В свою очередь класс природных полимеров можно подразделить на группы в соответствии с их биохимической классификацией: полисахаридные, белковые и липидные. Синтетические полимеры также могут быть подразделены на группы, например, в соот- ветствии с химическим строением основной цепи макромолекул: поли- метиленовые, полиамидные и полиэфирные носители. Рассмотрим основные классы полимерных носителей. Природные носители. Большое значение природных полимеров в качестве носителей для иммобилизации объясняется их доступностью и наличием реакционноспособных функциональных групп (в исходном или модифицированном препарате), легко вступающих в различные хи- мические реакции, а также высокой гидрофильностью. К недостаткам можно отнести неустойчивость к воздействию микроорганизмов, отно- сительно высокую стоимость многих из них. Полисахариды. Наиболее часто для иммобилизации используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Целлюлоза, представляет собой, поли-1,4-β-D-глюкопиранозил-D- глюкопиранозу: Целлюлоза отличается высокой степенью гидрофильности, а на- личие большого количества гидроксильных групп дает возможность ее легко модифицировать путем введения различных заместителей. Препараты целлюлозы для придания им химической устойчивости «сшивают» эпихлоргидрином. Для увеличения механической прочно- сти целлюлозу гранулируют путем частичного гидролиза, в результате которого разрушаются ее аморфные участки. На их место для сохране- ния прочности между кристаллическими участками вводят химические сшивки. Гранулированная целлюлоза благодаря простоте получения, сравнительно низкой стоимости относится к удобным носителям для иммобилизации ферментов. К недостаткам целлюлозы как носителя можно отнести ее неус- тойчивость к воздействию сильных кислот, щелочей и окислителей. ОН ОН СН 2 ОН О О ОН О ОН СН 2 ОН О n 12 Гранулированную целлюлозу довольно легко превращают в различ- ные ионообменные производные, которые имеют промышленное значе- ние (табл. 1.1). Таблица 1.1 Целлюлоза и некоторые ее производные Заместитель по ОН–группе Название препарата Фирма – Целлюлоза «Whatman» (Англия) О(СН 2 ) 2 NН 2 Аминоэтилцеллюлоза То же ОРО 3 Н Фосфорилцеллюлоза (Р-10) То же – Целлюлоза «Sigma» (США) – Целлюлоза «Bio-Rad-Labs» (США) О(СН 2 ) 2 N(С 2 Н 5 ) 2 Диэтиламиноэтилцеллюлоза То же ОСН 2 СООН Карбоксиметилцеллюлоза То же О(СН 2 ) 2 NН 2 Аминоэтилцеллюлоза То же n-Аминобензоилцеллюлоза То же n-Аминобензоилцеллюлоза «Serva» (Германия) «Reanal» (Вергрия) ОСОСН 2 Br Бромацетилцеллюлоза То же О(СН 2 ) 2 N(С 2 Н 5 ) 2 Бензоилдиэтиламиноэтил- целлюлоза То же ОСН 2 СОNНNН 2 Гидразидкарбоксиметил- целлюлоза «Miles Labs» (Англия) ОСОСН 2 Br Бромацетилцеллюлоза То же м- Аминобензилоксиметил- целлюлоза То же О(СН 2 ) 2 N(С 2 Н 5 ) 2 ДЭАЭ-целлюлоза НПО «Биохимреактив» ОСН 2 СООН КМ-целлюлоза То же n-Аминобензилцеллюлоза То же О(СН 2 ) 2 SО 3 Н Триэтиламмонийэтилцел- люлоза То же О(СН 2 ) 2 N(C 2 Н 5 ) 3 Сульфоэтилцеллюлоза То же К природным аминополисахаридам относится хитин. Его можно рассматривать как целлюлозу, в которой СН 2 ОН-группа заменена ацета- мидным остатком: ОСО NН 2 ОСО NН 2 ОСО ОСН 2 ОСН 2 NН 2 ОСН 2 NН 2 + 13 хитин R = – C хитозан R = – Н Хитин – основной компонент наружного скелета ракообразных, насекомых, а также клеточных оболочек некоторых грибов. Это со- единение является отходом промышленной переработки креветок и крабов, поэтому доступно в больших количествах при относительно низкой стоимости. Хитин обладает пористой структурой, не растворяется в воде, разбавленных кислотах и щелочах, а также в органических раствори- телях. Для переведения в реакционноспособную форму он может быть модифицирован глутаровым альдегидом, а также солями тяже- лых металлов. Обработка хитина концентрированными растворами щелочей (деацилирование) приводит к образованию хитозана. Хитозан имеет свободные аминогруппы, поэтому может исполь- зоваться для ковалентной иммобилизации с помощью бифункцио- нальных реагентов: диальдегиды, диизоцианаты. В отличие от хитина хитозан растворяется в минеральных и ор- ганических кислотах, поэтому для иммобилизации он часто применя- ется в виде растворов (рН 3–7). Полученные препараты иммобилизованных ферментов и других биобъектов на основе хитозана обладают высокой каталитической ак- тивностью и устойчивостью к микробному воздействию; наблюдается и повышение термостабильности белков, иммобилизованных на хито- зане. Декстран-поли-1,6-α-D-глюкопиранозил-D-глюкопираноза – раз- ветвленный полисахарид из бактериальных источников, содержащий остатки глюкозы, связанные, в основном, 1,6-глюкозидными связями (а также 1,2-, 1,3- и 1,4- связями): ОН СН 2 ОН О ОН О СН 2 ОН О Н NН R Н NН R Н Н Н О О СН 3 14 Фирмы «Pharmacia» и «Renal» выпускают ряд производных декст- рана, содержащих различные функциональные группы (табл. 1.2). Таблица 1.2 Коммерческие препараты производных декстрана Функциональная группа Название и марка Фирма ОСН 2 СООН Карбоксиметилсефадекс (СМ) «Pharmacia» (Швеция) О(СН 2 ) 3 SО 3 Н Сульфопропилсефадекс (SР) То же О(СН 2 ) 2 N(С 2 Н 5 ) 2 Диэтиламиноэтилсефадекс (DEAE) То же ОСН 2 СН 2 N(С 2 Н 5 ) 2 СН 2 – –СН(ОН)СН 3 Диэтил–(2–оксипропил) аминоэтилсефадекс (QAE) То же ОСН 2 СООН Молселект (СМ) «Reanal» (Венгрия) О(СН 2 ) 2 SО 3 Н Молселект (SE) То же О(СН 2 ) 2 N(С 2 Н 5 ) 2 Молселект (DEAE) То же Гели на основе декстрана обладают высокой стойкостью и гидро- фильностью (из-за наличия большого количества гидроксильных групп). К группе декстранов можно отнести и крахмал, представляющий смесь полисахаридов, основными компонентами которой являются ами- лоза-поли-1,4-α-D-глюкопиранозил-D-глюкопираноза и амилопектин – разветвленный полисахарид, состоящий из остатков D-глюкозы, связан- ной 1,4-α-глюкозидными связями, а в местах разветвлений – 1,6-α- глю- козидными связями. О ОН СН 2 О О О СН 2 НО НО ОН О–СН 2 ОН О ОН НС–ОН СН 2 НО ОН СН ОН О О 15 При химической модификации крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) получен новый носи- тель – губчатый крахмал. Этот носитель обладает повышенной устойчи- востью по отношению к ферментам, гидролизующим полисахариды. Введение диэтанол– и триэтаноламинных групп дает возможность при- менять губчатый крахмал для иммобилизации. Агароза-поли-β-галактопиранозил-3,6-ангидро-α-L-галактопираноза: Она широко используется как носитель для иммобилизации. Однако стоимость ее очень высока, поэтому разрабатываются различные методы ее модификации с целью получения легко регенерируемых форм. При охлаждении горячего 2–6 % водного раствора агарозы до температуры ниже 45 0 С образуются прочные крупнопористые гели, представляющие собой сложную смесь из заряженных и нейтральных полисахаридов. Гели на основе агарозы выпускаются под названиями «сефароза» и «биогель А» (табл. 1.3). Агар выделяют из некоторых красных водорослей. Точный со- став неизвестен. Установлено, что он содержит, по крайней мере, два полисахарида: агарозу и агаропектин. Гели агара образуются анало- гично агарозным при охлаждении до температуры ниже 38 0 С. После высушивания гель агара превращается в прозрачную пленку, что по- зволяет использовать для изучения иммобилизованных в геле препа- ратов оптические методы. К преимуществам агара следует отнести его низкую стоимость, нетоксичность и способность формировать механически прочные гели даже при малых концентрациях в раство- ре. Улучшить свойства агара можно сшиванием эпихлоргидрином, диэпоксидными агентами и т. д. Сшитый агар с регулируемой прони- цаемостью устойчив к нагреванию даже в щелочной среде, обладает высокой механической прочностью, а наличие большого количества оксигрупп позволяет легко модифицировать носитель. Это дало осно- вание отдельным исследователям считать агар почти идеальным но- сителем. ОН Н О СН 2 ОН О НО СН 2 ОН О О n О 16 Таблица 1.3 Агароза и некоторые ее производные Функциональная группа (заместитель по ОН–группе) Название и марка Концентрация агарозы, % Фирма – Сефароза 6В 6 «Pharmacia» (Швеция) – Сефароза 4В 4 То же – Сефароза 2В 2 То же –О(СН 2 ) 2 NН(С 2 Н 5 ) 2 Сl – ДЭАЭ-сефароза СL-6В 6 То же –ОСН 2 СООН КМ-сефароза СL-6В 6 То же –ОСN Бромциансефароза 4В 4 То же –ОСН 2 –СН–СН 2 –О– –(СН 2 ) 7 –СН 3 Октилсефароза СL-4В 4 То же –ОСН 2 –СНОН–СН 2 –О– Фенилсефароза СL-4В 4 То же Биогель А-0,5 10 «Bio-Rad Labs» США Биолгель А-1,5 8 То же Биолгель А-5 6 То же Биолгель А-15 4 То же Биолгель А-50 2 То же Биолгель А-150 1 То же –О(СН 2 ) 2 N(С 2 Н 5 ) 2 ДЭАЭ-биогель – То же –NH–(СН 2 ) 5 –СОО– Активированная СН-сефароза 4В 4 «Pharmacia» (Швеция) –ОСН 2 СН–СН 2 – –О(СН 2 ) 4 –О–СН 2 – –СН–СН 2 Эпоксиактивированная сефароза 6В 6 То же + ОН ОН О N О О 17 Альгиновые кислоты и их соли – это полисахариды бурых морских водорослей, состоящие из связанных β-1,4-связями остатков D- маннуроновой кислоты. Они служат основой при получении альгинатных гелей. В присутствии моновалентных катионов эти полисахариды даже в низких концентрациях образуют вязкий раствор, а в присутствии двухвалентных катионов, особенно Са 2+ , наблюдается образование ге- ля. В зависимости от присутствующего катиона эти гели и носят раз- личные названия: натрий альгинатный гель, кальций альгинатный гель и т. д. Характерной особенностью этих носителей является зависимость их растворимости от температуры и рН-раствора. Для иммобилизации биопрепаратов широкое распространение по- лучила система с альгинатом кальция. Выбор этого геля для иммоби- лизации произошел не случайно: условия включения в гель альгината кальция очень мягкие, полимер можно стерилизовать автоклавирова- нием, и кроме того, процесс иммобилизации обратим, что достигается добавлением агента, связывающего Са 2+ (например ЭДТА или лимон- ной кислоты). Последнее особенно важно было на начальных этапах исследования, поскольку необходимо было изучать свойства клеток по мере их нахождения в иммобилизованном состоянии. От соотношения концентрации альгината и Са 2+ зависит плот- ность сшивки геля. Стабильность геля возрастает с увеличением кон- центрации полимера, но при высоких концентрациях альгината масса становится вязкой, что может затруднять процесс образования гранул. Поэтому необходимо подобрать такие условия, которые бы позволили получать стабильный гель. Гепарин представляет собой кислый полисахарид, содержащий че- редующие звенья сульфатированной D-глюкуроновой кислоты (или L-идуроновой) и сульфатированного глюкозамина (или N- ацетилглюкозамина): О ОН О СООН О НО ОН СООН НО О О n 18 Гепарин успешно применяется для получения водорастворимых препаратов иммобилизованных ферментов, используемых в медицине для введения in vivo. κ-Каррагинан. Каррагинаны представляют собой гетерогенные полисахариды, содержащие главным образом эфиры α-D- галактопиранозилсерной кислоты. κ-Каррагинан – это нерастворимая фракция, которую получают при добавлении ионов Са 2+ к водному экстракту каррагинана. При на- гревании он растворятся, а при последующем охлаждении образует гель. Температура образования и качество геля зависят как от концен- трации полимера, так и от количества присутствующих в растворе ка- тионов (например, K + , NH 4 + , Ca 2+ или Ba 2+ ). Белки используют в качестве носителей для иммобилизации фер- ментов. Известно, что многие ферменты в клетке функционируют в тесном контакте с липидами и белками. Поэтому полагают, что изуче- ние поведения ферментов, иммобилизованных на белковых матрицах, позволит также лучше понять закономерности функционирования ферментов in vivo. С точки зрения практической значимости важными свойствами этих носителей являются высокая вместимость по отноше- нию к ферментам и способность к биодеградации, а также возмож- ность применения большинства из них (благодаря фибриллярной при- роде) в виде тонкой пленки (толщина 80 мкм). Иммобилизацию на белковых носителях можно проводить как в присутствии, так и отсут- ствии сшивающих агентов. К недостаткам белков как носителей, в частности для медицин- ских препаратов, используемых in vivo, следует отнести высокую им- муногенность (исключение составляют коллаген и фибрин). Наиболее часто в качестве носителей применяют структурные белки, такие как кератин, фиброин, коллаген; двигательные белки, в частности миозин, а также транспортные белки, например сывороточ- ный альбумин. ОН СООН О ОН О СН 2 ОSО 3 Н О NНSО 3 Н ОSО 3 Н О n НО НО 19 Коллаген – фибриллярный белок группы склеропротеидов, основной компонент хрящей и сухожилий, обладает высокой прочностью на раз- рыв. Особенностью этого белка является высокая гидрофильность. Лег- кость выделения коллагена и наличие большого числа групп для связы- вания ферментов делают возможным его использование в качестве носи- теля. Коллаген используют и в виде модифицированных производных. Например, блокированием амино- или карбоксильных групп изменяют поверхностный заряд носителя и, соответственно, гидрофильность, с по- мощью сшивающих аминов получают сжатую микроструктуру. Наибо- лее часто коллаген употребляется в азидной форме. В результате дли- тельной обработки коллагена кипящей водой, в ходе чего гидролизуются некоторые его ковалентные связи, получают желатин. Ценностью этого носителя, обладающего гелевой структурой, является нетоксичность, легкость биодеградации, что позволяет применять его в фармацевтиче- ской и пищевой промышленностях. Другим представителем фибриллярных белков группы склеропро- теидов является кератин. Из кератина почти полностью состоят шерсть, волосы, роговые покровы, шелк и т. д. Чаще всего кератин получают при переработке перьев. Таким образом, кератин дешев и доступен в боль- ших количествах. Существуют две формы кератина – α и β. α-Кератин характеризует- ся высоким содержанием цистеина, что способствует иммобилизации препаратов, содержащих SH-группы. β-Кератины характеризуются высо- ким содержанием глицина и аланина, что способствует образованию вы- тянутой зигзагообразной полипептидной цепи. Нити β-Кератина облада- ют мягкостью, гибкостью и нерастворимостью, однако по прочности ус- тупают α-Кератину. При иммобилизации препаратов на носителях белковой природы необходимо учитывать диффузионные ограничения, определяемые геле- вой структурой матрицы. Липиды. Иммобилизация ферментов на природных липидных носи- телях (конструирование ансамблей белок – липид) может рассматривать- ся как приближение к живой клетке. Для такой иммобилизации, как правило, используются природные липиды – компоненты биомембран. Обычно липидные носители приме- няются в виде монослоев на различных поверхностях или бислоев (как правило, сферической формы). Липиды, имеющие хотя бы небольшую полярную «головку», спо- собны образовывать мономолекулярную пленку на границе раздела фаз (вода –воздух, вода – неполярный растворитель). Липидные молекулы в 20 монослое расположены таким образом, что полярные «головки» погру- жены в водную среду, а углеводные группы направлены в воздух или не- полярную среду. Такая пленка способна сорбировать белковые молеку- лы. Изучение монослоев липидов, содержащих белок, помогает также установить природу взаимодействия липидов и белков в биологической мембране. Липидный монослой можно нанести на твердую подложку (силика- гель, сажа и т. д.). В качестве липидной матрицы используют обычно ле- цитин, фосфатидилэтаноламин и холестерин. Возможность варьировать структуру и ориентацию молекул в липидных слоях достигается подбо- ром полярности носителя и природы используемого растворителя липида. Если липид с молекулами бифильной природы, растворенный в неполярном органическом растворителе (бензол, гептан), адсорбиро- вать на полярном силикагеле, то в монослое липида углеводородные цепи будут ориентированы наружу. При адсорбции липида из поляр- ного растворителя на неполярной графитовой саже можно получить гидрофильный монослой, в котором полярные головки ориентированы в сторону растворителя. В качестве природных носителей используются липосомы. Для приготовления липосом наиболее часто используются фосфатидилхо- лин, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин и др. Размер и форма ли- посом зависит от способа их приготовления, а также от таких факто- ров, как кислотность среды, присутствие неорганических солей и при- роды используемого липида. Существует три различных типа липосом: мультиламеллярные, моноламеллярные и макровезикулярные. Мультиламеллярные липосо- мы представляют собой замкнутые упорядочные структуры, состоя- щие из нескольких концентрических липидных бислоев, отделенных один от другого водной средой. Расстояние между соседними бислоя- ми составляет 7,5 нм, диаметр центрального водного ядра равен 0,15 мкм, а общий диаметр мультиламеллярных липосом колеблется от 1–2 до 50 мкм. Ультрозвуковая обработка мультиламеллярных липосом приводит к трансформации их в моноламеллярные. Диаметр таких липосом со- ставляет 20–50 нм. Макровезикулярные липосомы образуются, например, путем слияния малых липосом, индуцируемого ионами Са 2+ , а также присут- ствием фосфолипидов с отрицательно заряженными головными груп- пами. Такие липосомы состоят из одного бислоя и имеют диаметр от 60 нм до 100 мкм. 21 Широкое применение липосом как носителей для ферментов и ле- карственных препаратов обусловлено простотой получения, легкостью регенерации иммобилизованного материала, а также возможностью ис- пользования in vivo благодаря близости свойств этих липидов – носите- лей и природных биомембран. Синтетические полимерные носители. Огромное разнообразие доступных синтетических полимеров обеспечило их широкое исполь- зование в качестве носителей для иммобилизации. Вводя в полимерные молекулы различные функциональные груп- пы, можно в широких пределах варьировать физические свойства но- сителей и создаваемое ими микроокружение для иммобилизованных препаратов. Синтетические полимеры применяются как для ковалент- ной иммобилизации, так и сорбционной, а также для получения гелей и микрокапсул. Полимеры на основе стирола являются основой многих промыш- ленных марок ионообменных материалов. Для сорбционной иммоби- лизации применяются как микропористые, так и макропористые (раз- мер пор 10–1000 нм) материалы. Сополимеры стирола в виде сфериче- ских частиц с различными сшивающими агентами можно получить гранульной полимеризацией. Геометрическая структура таких макро- пористых носителей (размер пор, удельная поверхность) варьирует в широких пределах при изменении количества агента и концентрации растворителя мономеров в реакционной среде. Наиболее часто в качестве сшивающего агента используется ди- винилбензол. Пористость сополимеров стирола регулируют полимеризацией в присутствии порообразователей, например добавок, разлагающихся при нагревании с выделением газообразных веществ (NH 4 Cl). В последние годы стали применяться носители, имеющие макро- сетчатую, изопористую и гетеропористую структуры. Макросетчатые полистиролы подобны стеклам. Они имеют стабильную структуру пор, не набухают в воде, отличаются повышенной механической прочно- стью. Получают их эмульсионной сополимеризацией стирола с диви- нилбензолом в присутствии осаждающего вещества. Изопористый по- листирол образуется при сшивании стирола в дихлорэтане, содержа- щем n-ксилилендихлорид. Под действием монохлордиметилового эфира и парообразователя получают гетеропористый полистирол с диаметром пор 1 мкм. При- менение гетеропористых носителей обеспечивает высокую остаточную активность биопрепаратов. 22 Немодифицированные полистирольные носители гидрофобны. Присоединением ионогенных групп в пароположении бензольных ра- дикалов можно придать некоторую гидрофильность, хотя в целом, со- храняется склонность полимера к гидрофобным взаимодействиям. Широкие возможности для разработки новых видов носителей от- крывает введение реакционноспособных ангидридныхгрупп в состав синтетических полимеров. В этом случае получают носитель при со- полимеризации эквимолярных количеств стирола и малеинового ан- гидрида. В присутствии избыточного количества диметилендиамина получают носитель, содержащий аминогруппы. Последние обладают высокой вместимостью по отношению к белкам, могут применяться как для ковалентной, так и нековалентной иммобилизации. Полиакриламидный гель получается при сополимеризации произ- водных акриловой кислоты со сшивающими агентами. Полиакриламид – носитель, часто используемый для включения ферментов и клеток, не обладает ионообменными свойствами, поэтому при иммобилизации рН-профиль активности препаратов практически не меняется. По этой же причине не происходит ни обогащения, ни обеднения носителя заряженными субстратами и продуктами. Однако отсутствие взаимодействия включенных белков с носителем не спо- собствует их удержанию. Для устранения утечки требуется высокая степень сшивки носителя, т. е. желательна как можно более полная по- лимеризация. К сожалению, мы это уже отмечали, при высокой степе- ни сшивки возникает проблема диффузионных ограничений. Таким образом, хотя включение препаратов в полиакриламидный гель используется довольно широко, методы иммобилизации, также как ковалентное сшивание с инертным носителем, имеют в этом слу- чае определенные преимущества. Кроме того, полиакриламидный гель вследствие токсичности ис- пользуемых для его получения мономеров (акриламида, бисакрилами- да) и выделении тепла при полимеризации снижает жизнеспособность клеток и ферментов. Но поскольку клетки значительно больше фер- ментов, то высокая степень сшивки необязательна. По этой причине для иммобилизации клеток в последнее время используют поперечно- сшитый и предварительно полимеризованный линейный полиакрила- мид. Полиамидные носители – это группа различных гетероцепных по- лимеров с повторяющейся амидной группой –С(О)–NН–. Один из способов получения основан на гомополиконденсации аминокарбоновых кислот, например ε-аминокапроновой кислоты. 23 Носители на основе поливинилового спирта обладают высокой ре- акционной способностью. Соответствующая обработка позволяет вво- дить в них различные функциональные группы: альдегидные, хлортриа- зиновые, дисульфидные и др. Для получения гидрофильных гелей носи- тели могут быть сшиты глутаровым альдегидом в кислой среде, а в ще- лочной – эпихлоргидрином. К достоинствам этих носителей следует от- нести, помимо высокого содержания реакционно-способных групп, большую вместимость по отношению к белкам. Гидрофильные полиуретановые полимеры, содержащие группиров- ку –NH–C–O являются достаточно удобными материалами для вклю- чения препаратов в гель; процедура иммобилизации в этом случае состо- ит в простом смешивании компонентов. Полиуретанты обладают большой стойкостью по отношению к воде и окислителем по сравнению с полиамидами. Серьезное значение в связи с использованием иммобилизованных препаратов, в частности в медицине, приобретает проблема биодеградации. Полимеры, имею- щие высокую молекулярную массу, могут накапливаться в организме; возникает необходимость создания таких синтетических полимеров (или выбора природных), которые будут расщепляться с образованием нетоксичных продуктов обмена. В этом отношении предпочтение от- дается природным полимерам, которые гидролизуются в организме ферментами. Так, например, в качестве носителя лекарственных пре- паратов наиболее широко применяют декстраннетоксичный,с малой иммуногенностью, способный к биодеструкции полисахарид. Среди синтетических полимерных материалов наибольшее при- менение в качестве носителей лекарственных препаратов имеют поли- меры на основе N-винилпирролидона. Проводятся такие попытки целенаправленного синтеза биодегра- дабельных полимеров, в частности полиуретанов, содержащих в ос- новной цепи дипептидные фрагментыи др. Неорганические материалы.Для иммобилизации используются различные типы неорганических носителей. Основными качествами, обуславливающими широкое внедрение неорганических материалов в промышленные процессы, являются легкость их регенерации и воз- можность придания им любой конфигурации. Носители применяются как в виде порошков, шариков, так и монолита. Неорганические носи- тели могут быть как пористыми, так и непористыми. К макропористым кремнеземам относятся силикагели, силохро- мы и макропористые стекла. Достоинства: механическая прочность, химическая инертность ко многим растворителям, наличие жесткого О 24 скелета с заданным размером пор, устойчивость к воздействию микро- организмов. Поверхность частиц кремнеземов покрыта гидрофильными и гидроксильными группами, обладающими слабовыраженными ки- слотными свойствами. К недостаткам этих носителей следует отнести использование их в ограниченном диапазоне рН и некоторую неспецифическую сорб- цию на их поверхности. Можно химически модифицировать кремнеземы путем введения различных реакционно-способных групп (–СN, –NO 2 , –NH 2 и др.) или гидрофобизировать поверхность соответствующими реагентами. Применение различных модифицирующих агентов дает возмож- ность целенаправленного изменения свойства поверхности кремне- земных носителей. Однако стоимость кремнеземных носителей отно- сительно высока, а модификация еще более повышает их стоимость, что является существенным ограничением во внедрении их в про- мышленности. Природные алюмосиликаты (глины, цеолиты), а также порис- тая керамика. Поверхность также может быть модифицирована раз- личными органическими веществами. Они характеризуются высокой плотностью поверхностных групп, связыванием белковых групп, что имеет немаловажное значение для эффективной иммобилизации. Уголь и графитированная сажа. Уголь может быть использован в качестве носителя, как для адсорбционной, так и для ковалентной иммобилизации. Достоинства графитированной сажи: однородность и электриче- ская проводимость ее поверхности. Последнее свойство важно при создании биоэлектрокаталитических систем на основе иммобилизо- ванных препаратов. К недостаткам можно отнести низкую механическую прочность. Весьма перспективны носители на основе металлов и их окси- дов. Эти носители характеризуются высокой механической прочно- стью, относительной дешевизной, стабильностью, хорошими гидро- динамическими свойствами. Металлические поверхности, используе- мые в качестве носителей, как правило модифицируют, либо создавая оксидную пленку на поверхности матрицы, либо покрывая их слоем полимера (производные полистирола, целлюлозы и т. д.). Это позво- ляет значительно повысить сорбционную вместимость носителя. 25 |