Учебное пособие Часть I самара Самарский государственный технический университет 2007

• Название: Учебное пособие Часть I самара Самарский государственный технический университет 2007
• Дата: 09.04.2018
• Размер: 1.81 Mb.
• Имя файла: aminoacids.doc
• Тип: Учебное пособие; #40742
• страница: 3 из 10

Образование солей. При рН, большем, чем pI, аминокислоты образуют с основаниями соли, легко растворимые в воде:



Поскольку кислые свойства аминокислот, за исключением аспарагиновой и глутаминовой кислот, выражены слабо, их нельзя титровать щелочами в водной среде. Аспарагиновую и глутаминовую кислоты можно титровать в водной среде щелочами по одной карбоксильной группе с индикатором фенолфталеин. Все аминокислоты, а также полипептиды можно титровать в среде 95%-ного спирта водным или лучше спиртовым раствором КОН с индикатором тимолфталеин.

Смеси аминокислот с их натриевыми или калиевыми солями широко применяются в биохимии для приготовления буферных растворов.

Образование эфиров. Метиловые и этиловые эфиры аминокислот получают обработкой суспензии аминокислоты в абсолютном метиловом или этиловом спирте током сухого хлористого водорода:



Эфиры аминокислот более реакционноспособны, чем свободные аминокислоты, поэтому они служат промежуточными веществами при получении амидов, гидроксамовых кислот, гидразидов, ацилазидов и других производных аминокислот, применяющихся в пептидном синтезе и использующихся для идентификации. В пептидном синтезе и для идентификации широко применяются бензиловые, п-нитробензиловые, трет-бутиловые, п-нитрофениловые, N-оксисукцинимидные и другие эфиры.

Эфиры аминокислот легко омыляются щелочами, а при обработке аммиаком образуют амиды:



Восстановление карбоксильной группы. Свободная карбоксильная группа восстанавливается до спиртовой группы под действием лития алюмогидрида (LiAlH₄). Но поскольку LiAlH₄ мгновенно реагирует с водой, спиртами и другими соединениями, содержащими активный водород с выделением 4 молей водорода, восстановление аминокислот проводят в апротонных растворителях, не взаимодействующих с ним, например в тетрагидрофуране (ТГФ). При этом 0,25 моля LiAlH₄ расходуется на образование солей аминокислоты и еще 0,5 моля собственно на восстановление. Общее уравнение реакции приведено ниже. После обработки реакционной смеси водой или кислотой выделяют α-аминоспирт:


α-Аминоспирты легко окисляются йодной кислотой до альдегидов:



Эти две последние реакции используются для установления строения новых аминокислот, а также для идентификации и количественного анализа уже известных.

Декарбоксилирование. При нагревании аминокислот в твердом состоянии в высококипящих растворителях или с раствором гидроксида бария образуются соответствующие амины:


В живых организмах из аминокислот под действием ферментов декарбоксилаз образуются биогенные амины. Например, в клетках мозга из глутаминовой кислоты образуется важный нейромедиатор ГАМК. Кроме того, декарбоксилирование имеет место при гнилостном расщеплении белков под действием ферментов, выделяемых микроорганизмами.

Другие реакции, характерные для карбоновых кислот, а именно образование ангидридов и галогенангидридов, в ряду аминокислот не характерны из-за мешающего влияния аминогруппы. Однако ациламинокислоты легко можно превратить как в симметричные, так и в смешанные ангидриды. Например:



1.1.4.2. Реакции с участием аминогруппы

Образование солей. Соли аминокислот с минеральными кислотами (хлористоводородной, серной и азотной), как правило, лучше растворимы в воде, чем свободные аминокислоты. Напротив, соли с такими кислотами, как пикриновая и пикролоновая, труднорастворимы, в связи с чем эти соли используются для идентификации и разделения аминокислот:



Пикриновая кислота Пикролоновая кислота
Причем, желтые или красные соли аминокислот с пикролоновой кислотой обычно менее растворимы, чем пикраты, и хорошо кристаллизуются из водных растворов.

Поскольку основные свойства аминокислот выражены слабо, их нельзя титровать кислотами в водной среде, за исключением лизина и аргинина, однако другие аминокислоты можно титровать по аминогруппе хлорной кислотой в среде ледяной уксусной кислоты:



Поскольку вода мешает этому определению, этот метод применим лишь для количественного анализа твердых сухих образцов.

N-Ацилирование. Аминокислоты легко реагируют с ангидридами и хлорангидридами кислот в щелочной среде (метод Шоттена – Баумана^) с образованием ациламинокислот:



При простом нагревании аминокислот с ангидридами или хлорангидридами кислот образуются азлактоны:



Ацильные производные аминокислот (карбобензоксильные, пара-нитрофенилсульфенильные, трет-бутилоксикарбонильные, формильные, 5-диметиламинонафтилсульфонильные (дансильные), трифторацетильные и др.) широко используются в синтезе пептидов и при изучении последовательностей аминокислот в белках.

N-Алкилирование. При действии галоидных алкилов на аминокислоты в щелочной среде могут быть получены моно-, ди– и триалкилпроизводные:



Триалкилпроизводные аминокислот представляют собой четвертичные аммониевые основания, внутренние соли которых называются бетаинами (термин происходит от названия «бетаин» – природное соединение, содержащиеся в клетках животных организмов).

N-2,4-Динитрофениламинокислоты (ДНФ-аминокислоты), а также упомянутые выше фенилизотиоцианатные производные аминокислот (ФТЦ-аминокислоты) нашли широкое применение при изучении первичной структуры белков и в синтезе пептидов. Они получаются при взаимодействии 2,4-динитрофторбензола и фенилизотиоцианата соответственно с аминокислотами в присутствии оснований:



ДНФ-аминокислоты


ФТЦ-аминокислоты


3-Фенил-5-R-тиогидантоины
Следует иметь в виду, что при нагревании ФТЦ-аминокислот, особенно в присутствии кислот, они легко циклизуются с отщеплением воды и образованием 3-фенил-5-R-тиогидантоинов.

Конденсация с карбонильными соединениями. Аминокислоты, подобно первичным аминам, взаимодействуют с альдегидами и кетонами с образованием азометинов – альдиминов и кетиминов соответственно (эта реакция обратима):



Азометины, или основания Шиффа, обладают гораздо меньшими основными свойствами, чем соответствующие амины (они не образуют солей даже с сильными кислотами в водной среде). В том случае, если азометиновая группа (>C=N-) сопряжена с ароматическим кольцом со стороны атома углерода или азота, то такие основания Шиффа^, как правило, окрашены. Основания Шиффа на основе α-аминокислот, в отличие от обычных азометинов, способны к изомеризации:



Эти свойства оснований Шиффа широко используется в синтезе, качественном и количественном анализе аминокислот. На основе реакции конденсации аминокислот с карбонильными соединениями разработаны следующие методы анализа аминокислот.

1. Титрование аминокислот водным раствором щелочи в избытке формалина (формольное титрование аминокислот, метод Сёренсена^) основано на следующих реакциях:





Метод Сёренсена позволяет определять аминокислоты с первичными аминогруппами и неприемлем для определения пролина и оксипролина, содержащих вторичную аминогруппу. Тример формальдегида (1,3,5-триоксан) реагирует специфично с оксипролином, давая окрашенное соединение с максимумом поглощения при 492-494 нм, что является специфической реакцией на оксипролин.

2. При взаимодействии аминокислот с фурфуролом в ледяной уксусной кислоте образуются окрашенные соединения с максимумом поглощения при 360-380 нм. Диаминокислоты лизин и орнитин дают при этом второй максимум поглощения при 515-530 нм, что позволяет идентифицировать их в присутствии других аминокислот:



Фурфурол

n = 3 – орнитин;

n = 4 – лизин
Таким образом, реакции с фурфуролом и тримером формальдегида позволяют качественно определять лизин, орнитин и оксипролин, как в виде индивидуальных соединений, так и в смеси с любыми другими аминокислотами.

3. В настоящее время интенсивно развивается наиболее чувствительный и высокоспецифический метод флюоресцентного количественного анализа аминокислот, позволяющий определять их не только в гидролизатах белков, но и непосредственно в различных жидкостях организма (кровь, моча и др.). Метод основан на реакции α-аминокислот с о-фталевым диальдегидом в присутствии меркаптоэтанола с образованием флюоресцирующих продуктов (реакция Циммермана):



4. Реакция α-аминокислот с нингидрином – основная групповая реакция на аминокислоты.

При нагревании α-аминокислот с нингидрином в водном растворе во всех случаях образуется один и тот же краситель фиолетового цвета. Без нагревания окраска тоже развивается, но гораздо медленнее.



С точки зрения авторов образование красителя становится возможным в результате изомеризации получающегося на первой стадии реакции основания Шиффа гидролиза продукта изомеризации с образованием кетокислоты и 2-аминоиндандиона-1,3, который конденсируется с нингидрином с образованием красителя – фиолетового Руэмана.

Поскольку реакция обычно осуществляется при нагревании раствора, образующиеся α-кетокислоты легко отщепляют углекислый газ и дают соответствующие альдегиды.

Реакцию с нингидрином обычно проводят в нейтральной среде. В присутствии ионов металлов, способных к комплексообразованию с α-аминокислотами, чувствительность реакции сильно уменьшается.

Для проведения реакции с окрашенными жидкостями , например коричневыми гидролизатами, в качестве экстрагента используют амиловый спирт.

Реакция с нингидрином имеет большое значение для обнаружения аминокислот на хроматограммах, электрофореграммах, а также при количественном аминокислотном анализе белковых гидролизатов. Фиолетовый Руэмана имеет максимум поглощения при 570 нм. При этом, как установили Мур и Стайн, оптическая плотность раствора пропорциональна молярной концентрации α-аминокислотных групп, что позволяет осуществлять количественное фотометрическое определение различных α-аминокислот.

β– и γ-Аминокислоты, например β-аланин, ГАМК с нингидрином, дают растворы желто-оранжевого цвета. При этом образуются лишь соответствующие основания Шиффа:



При взаимодействии пролина и оксипролина с нингидрином возникает ярко-желтая окраска с максимумом поглощения при 440 нм.

С нингидрином реагируют не только аминокислоты, но и многие аминосоединения: аминосахара, пептиды, белки, мочевина, креатин, аммиак и др. В связи с этим в помещении, где проводится анализ, не должно быть следов аммиака.

Из синтетических методов, в основе которых лежит конденсация α-аминокислот с карбонильными соединениями, следует отметить реакции трансаминирования (переаминирования). При кипячении водных растворов α-аминокислот с α-кетокислотами происходит переход α-аминогруппы от аминокислоты к α-кетокислоте:



Трансаминирование, так же, как и реакция с нингидрином, включает в себя стадию конденсации с образованием основания Шиффа, изомеризацию последнего, его гидролиз и обычно сопровождается декарбоксилированием. Эта реакция используется для препаративного получения альдегидов или α-аминокислот. Например, при взаимодействии фенилаланина с пировиноградной кислотой с хорошими выходами образуются фенилуксусный альдегид и аланин:



Реакции трансаминирования являются важнейшими в метаболизме аминокислот. Реакции трансаминирования осуществляются как в катаболических, так и в анаболических процессах с участием α-аминокислот. Они осуществляются под действием ферментов трансаминаз, коферментом которых является пиридоксальфосфат (PLP).

Представленная здесь альдегидная форма кофермента в свободном виде в организмах не встречается. В отсутствие субстратов альдегидная группа пиридоксальфосфата ковалентно связана с аминогруппой остатка лизина трансаминазы.

Механизм реакций трансаминирования заключается в следующем (рис.1.5). Во время реакции аминокислота вытесняет остаток лизина, при этом образуется альдимин. Затем альдимин изомеризуется в кетимин. Полученный кетимин гидролизуется до 2-кетокарбоновой кислоты и пиридоксаминфосфата.



Р и с.1.5. Механизм ферментативной реакции трансаминирования
Вторая часть реакции включает те же три стадии процесса, проте-

кающие в противоположном направлении. Пиридоксаминфосфат и вторая 2-кетокислота образуют кетимин, который изомеризуется в альдимин. Наконец, отщепляется вторая аминокислота и регенерируется кофермент.

В результате трансаминирования в организме человека из
2-кетокислот образуются следующие аминокислоты: аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты и их амиды – аспарагин и глутамин.

Окислительное дезаминирование и окисление. Окислительным дезаминированием называют реакции α-аминокислот, приводящие к образованию аммиака (т.е. степень окисления азота в ходе реакции не меняется). Эти реакции занимают важное место в метаболизме аминокислот. В этих реакциях аминогруппа вначале окисляется до иминогруппы. При этом восстановительные эквиваленты переносятся либо на НАД⁺, либо на НАДФ⁺, а образовавшаяся иминокислота неферментативно гидролизуется до аммиака и 2-кетокислоты:



Окислительное дезаминирование можно осуществить и препаративным путем. Например, при обработке водных растворов α-аминокислот N-бромсукцинимидом (NBS) происходит количественное декарбоксилирование аминокислот и образование соответствующего альдегида:



N-Бромсукцинимид
Интересно отметить, что при избытке NBS наблюдается образование нитрила (степень окисления азота не меняется), содержащего на один атом углерода меньше, чем исходные аминокислоты:



Собственно окисление аминогруппы аминокислот приводит к образованию соединений азота с более высокой степенью окисления чем в исходной аминокислоте. Важнейшей реакцией такого типа является взаимодействие аминокислот с азотистой кислотой, приводящее к образованию азота и оксикислот:



Азотистой кислотой окисляются первичные алифатические аминогруппы, находящиеся не только в α-положении, но и в любом другом. Например, при окислении моля лизина выделяется два моля азота.

Эта реакция лежит в основе количественного газометрического метода анализа аминокислот (метод ван-Слайка^), а также используется как общая групповая качественная реакция. Пролин этой реакции не дает, потому что не содержит в своей молекуле первичной аминогруппы.

1.1.4.3. Реакции с одновременным участием карбоксильной и аминогрупп

Образование комплексов с ионами металлов. Все α-амино-кислоты образуют прочные хелатные комплексы с ионами двухвалентных металлов. Их водные растворы в отличие от растворов соответствующих солей щелочных металлов обладают очень низкой электропроводностью. Это обусловлено тем, что хелатные комплексы с ионами двухвалентных металлов электронейтральны.

Этим же обусловлена их хорошая растворимость в полярных растворителях, несмешивающихся с водой, например в амиловом и бутиловом спиртах.

Устойчивость комплексов изменяется в следующей последовательности:

Cu²⁺ > Ni²⁺ > Zn²⁺ > Co²⁺ > Fe²⁺ > Mn²⁺ > Mg²⁺

Способность к комплексообразованию обеспечивает всасывание микроэлементов, таких, как Cu²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺ и др., из кишечника в кровь.

Комплексные соединения с α-аминокислотами образуют и соли железа (III). При прибавлении к водному раствору α-аминокислоты водного раствора FeCl₃ появляется красная окраска, исчезающая при прибавлении минеральной кислоты.

Медные комплексы α-аминокислот, окрашенные в синий цвет, используют для качественного и количественного анализа, а также для очистки α-аминокислот. Количественный анализ α-аминокислот можно осуществлять фотоэлектроколориметрическим и йодометрическим методами, основанными на реакции α-аминокислот с солями меди. Быстро развивается лигандообменный хроматографический анализ аминокислот и пептидов на колонках с силикагелем в присутствии ионов меди.