Учебное пособие Часть I самара Самарский государственный технический университет 2007

• Название: Учебное пособие Часть I самара Самарский государственный технический университет 2007
• Дата: 09.04.2018
• Размер: 1.81 Mb.
• Имя файла: aminoacids.doc
• Тип: Учебное пособие; #40742
• страница: 10 из 10

Опыт 17. Количественное определение суммы белков в яичном белке и яичном желтке методом Варбурга и Кристиана. В предварительно взвешенную мерную колбу емкостью 100 мл помещают около 5 г яичного белка, предварительно отделенного от желтка, и взвешивают (по разности определяют точную навеску белка). Белок растворяют в 60-80 мл фосфатного буфера с рН 6,5 и доводят до метки водой. 5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу емкостью 50 мл и доводят до метки водой. Полученный раствор помещают в кварцевую кювету толщиной 1 см и определяют оптическую плотность раствора при 260 нм и 280 нм. Вычисляют отношение D₂₈₀/D₂₆₀. По данным табл. 2.2 определяют значение множителя ƒ и содержание нуклеиновой кислоты в белке.

В том случае, если нуклеиновая кислота отсутствует, расчет можно проводить по любой из приведенных выше формул. При наличии нуклеиновой кислоты расчет концентрации белка проводят по второй формуле.

Определив содержание белка в фотометрируемом растворе в размерности мг/мл, рассчитывают содержание нуклеиновой кислоты в той же размерности по формуле
С_{нук. (мг/мл)} = С_{белка (мг/мл)}∙С_{нук, %} / 100 − С_{нук, % ,}
где С_{нук. (мг/мл)} – содержание нуклеиновой кислоты в фотометрируемом растворе, мг/мл; С_{нук, %} – содержание нуклеиновой кислоты, взятое из табл. 2.2, в % от общей массы белка и нуклеиновой кислоты.

Расчет концентрации белка и нуклеиновой кислоты в исходном материале (яичный белок) в размерности г/100 г проводят по однотипным формулам, учитывающим разведение исходного белка:
С_{г/100 г} = С_мг/мл∙V_к1∙V_к2∙100/V_п1000∙a = С_мг/мл∙100∙50∙100/5∙1000∙a = С_мг/мл∙100/а,
где а – навеска белка, г; С_мг/мл – концентрация белка или нуклеиновой кислоты; V_к1 и V_к2 – объемы мерных колб, мл; V_п -∙объем пипетки, мл; 1000 – множитель пересчета массы из мг в г; 100 – масса объекта, в которой содержится С г белка или нуклеиновой кислоты.

Определение белка в яичном желтке проводится аналогично.

Контрольные вопросы

1. Определите методом интерполяции значение множителя ƒ для соотношения D₂₈₀/D₂₆₀ = 1,53, используя данные табл. 2.2.

2. Определите, сколько процентов белка содержит яичный белок, если известно, что оптические плотности фотометрируемого раствора, приготовленного по приведенной выше методике из яичного белка массой 5,026 г, равны D₂₈₀ = 0,962 и D₂₆₀ = 0,621.

3. Какие соединения мешают определению белка методом Варбурга и Кристиана?

4. В чем преимущества и недостатки метода Варбурга и Кристиана по сравнению с другими методами определения белка по поглощению в УФ-области?
Спектроскопия в видимой области и фотоэлектроколориметрия основаны на измерении поглощения окрашенных продуктов реакции белка с теми или иными реагентами.

Реакции, которые используются для получения окрашенных продуктов с белком, должны удовлетворять ряду требований: 1) оптимальным является взаимодействие реагента с пептидным фрагментом молекулы, поскольку его мольная доля по сравнению с другими частями молекулы белка максимальна и мало зависит от его природы, что позволяет определять различные белки, используя в качестве стандарта подходящий белок; 2) реакция должна протекать количественно; 3) окраска продукта реакции должна быть стабильна во времени, 4) желательно, чтобы развитие окраски не зависело от температуры.

Для измерения поглощения окрашенного продукта реакции можно использовать как фотоэлектроколориметр, так и УФ-спектро-фотометр, однако предпочтение следует отдать последнему.

Перечисленным выше требованиям прежде всего удовлетворяет биуретовая реакция на белок. В количественном анализе, в отличие от качественного, используется не просто раствор сульфата меди и едкого натра, а так называемый биуретовый реактив, представляющий собой водный раствор сульфата меди, натрия-калия тартрата (для предотвращения образования гидроксида меди(II)), едкого натра и йодида калия (для предотвращения образования гидроксида меди (I)). Биуретовая реакция лежит в основе метода Лоури и нескольких его модификаций.

Биуретовый метод по Ярош отличается от метода Лоури добавлением к раствору белка мочевины с целью стабилизации окраски. Метод Лоури – Фолина характеризуется тем, что после проведения биуретовой реакции к раствору добавляют реактив Фолина – Чиокалтеу, который с остатком тирозина дает синее окрашивание, что приводит к увеличению чувствительности метода в несколько раз (1-10 мг в 1 мл и 50-500 мкг в 1 мл соответственно).

Перечисленным требованиям удовлетворяет и метод, основанный на связывании красителей белком. Связывание красителей с белком осуществляется за счет образования водородных связей, поэтому природа белка во многом нивелируется. Наибольшее применение для окрашивания белка имеет краситель кумасси бриллиантовый синий G-250. Следует иметь в виду, что в принципе различные белки могут обладать и различной способностью связывать данный краситель. В частности, бычий сывороточный альбумин по этой причине не может использоваться в качестве общего стандартного белка в этом методе.

Во всех этих методах требуется стандартный образец белка (обычно яичный альбумин). При серийных испытаниях концентрацию белка обычно определяют по градуировочному графику.
Опыт 18. Количественное определение белка методом Лоури

Реагент. В 500 мл воды растворяют 1,5 г СuSO₄∙5Н₂O и 6 г

натрия-калия тартрата (NaKC₄Н₄О₆∙4Н₂O). При интенсивном перемешивании добавляют 300 мл 10%-ного (масс./об.) раствора едкого натра и 1 г йодида калия..Объём смеси доводят до 1 л водой. Раствор хранят в пластиковой бутылке.

Методика. Смешивают 4,0 мл биуретового реагента и 1,0 мл раствора белка, разбавленного в случае необходимости до концентрации 1:10 мг/мл белка; выдерживают смесь при комнатной температуре в течение 30 мин. Определяют оптическую плотность раствора при длине волны между 540 и 560 нм. Концентрацию белка определяют с помощью градуировочного графика, построенного с использованием 5 растворов яичного альбумина с концентрациями 2, 4, 6, 8 и 10 мг/мл

Определению белка этим методом мешают пептиды, сахароза, желчные пигменты, которые дают окраску в биуретовой реакции; соли аммония, трис и глицерин, которые оказывают влияние на окраску, даваемую белками; липиды и детергенты, которые могут вызвать помутнение.
Опыт 19. Количественное определение белка методом Лоури -

Фолина

Реагенты

Раствор А – 2%-ный раствор Na₂СО₃ в 0,1 М NaОН.

Раствор Б – 0,5%-ный раствор СuSО₄∙5Н₂О в 1%-ном растворе

NaKC₄Н₄О₆∙4Н₂O.

Раствор В – смешивают 50 мл раствора А с 1 мл раствора Б перед

применением.

Раствор Г – Коммерческий или приготовленный стандартный реагент Фолина – Чиокалтеу*, разбавленный водой вдвое.

* Методика приготовления реагента Фолина – Чиокалтеу.

Метод А. 100 г вольфрамата натрия (Na₂WО₄∙2Н₂O) и 25 г молибдата натрия (Na₂MoО₄∙2Н₂O) растворяют в 700 мл воды, добавляют 50 мл 85%-ной фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной хлористоводородной кислоты. Смесь дефлегмируют 10 ч (вытяжной шкаф), слегка охлаждают, убирают обратный холодильник, добавляют 150 г сульфата лития, 50 мл воды и 5 капель бромной воды. Смесь нагревают до кипения и кипятят 15 мин до удаления брома. Охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят в мерную колбу емкостью 1 л и доводят водой до метки. При необходимости раствор фильтруют.

Метод Б. В круглодонную колбу помещают 70 мл воды, 10 г вольфрамата натрия, 2,5 г фосфорномолибденовой кислоты (Н₇Р(Мо₂О₇)₆∙Н₂О), 5 мл 85%-ной фосфорной кислоты, кипятят с обратным холодильником 2 ч, охлаждают, разбавляют водой до 100 мл, хорошо перемешивают и при необходимости фильтруют.

В темной склянке с притертой пробкой раствор может храниться в холодильнике длительное время. Внешний вид качественного реактива – прозрачный раствор ярко-желтого цвета.

Методика. Смешивают К 1,0 мл раствора белка, разбавленного в случае необходимости до концентрации 50 – 500 мкг/мл белка; добавляют 5,0 мл раствора В, хорошо перемешивают и выдерживают в течение 10 мин при комнатной температуре. Быстро при постоянном перемешивании добавляют 0,5 мл раствора Г, выдерживают 30 мин при комнатной температуре, а затем измеряют оптическую плотность раствора при 750 нм.

Концентрацию белка определяют по градуировочному графику, построенному с помощью яичного альбумина.

Определению белка этим методом мешают вещества, перечисленные выше в методе Лоури, а также тирозин, триптофан, фенольные, тиольные соединения и другие восстановители.
Опыт 20. Количественное определение белка методом связывания с красителем. Метод Бредфорда

Реагент.100 мг кумасси бриллиантового синего G-250 растворяют в 50 мл 95%-ного этилового спирта в мерной колбе емкостью 1 л, добавляют 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты, 700-800 мл воды, перемешивают и доводят водой до метки.

Методика. Для анализа используется раствор, разбавленный до концентрации 100-1000 мкг/мл. К 0,1 мл подготовленного раствора добавляют 5 мл реагента и хорошо перемешивают. Оптическую плотность измеряют при 595 нм не ранее, чем через 5 мин, и не позднее, чем через 1 ч после приготовления раствора, относительно раствора реагента.

Концентрацию белка определяют по градуировочному графику, на оси оптических плотностей которого откладывают соответствующие разности между оптической плотностью раствора белка, обработанного реагентом и оптической плотностью чистого реагента

Определению белка этим методом мешают сильнощелочные буферы и детергенты.

Контрольные вопросы

1. Объясните, почему в методах, основанных на проведении цветных реакций на белок, нецелесообразно использовать такие реакции, как ксантопротеиновая, Фоля, Миллона и другие реакции, являющиеся общими для белков, но в то же время специфическими для отдельных аминокислот.

2. Спланируйте методику приготовления из яичного белка фотометрируемого раствора для анализа его методом Лоури, если известно, что содержание белка в яичном белке около 20%.
Практическая контрольная работа
по количественному анализу аминокислот и белков

Задание. Каждый студент получает 10 мл раствора, содержащего неизвестное количество аминокислот и белка.

Цель работы – определить содержание суммы аминокислот и содержание белка в исследуемом растворе.

Алгоритм выполнения

1. 
   Установить, есть ли в растворе белок.
   
2. 
   Если есть белок, удалить его нагреванием.
   
3. 
   В оставшемся растворе определить содержание суммы аминокислот и пересчитать его на исходный раствор.
   
4. 
   Определить количественное содержание белка в исходном растворе методом Лоури и методом Варбурга и Кристиана.
   
5. 
   Все этапы работы запротоколировать и сделать мотивированное заключение о содержании белка и суммы аминокислот в исследуемом растворе.
   

Библиографический список

1. 
   Гринштейн Дж., Винниц М. Химия аминокислот и пептидов: Пер. с англ. – М.: Мир, 1965. – 822 с.
   
2. 
   Фердман Д.Л. Биохимия: Учебник для вузов. – М.: Высш. шк., 1966. – 644 с.
   
3. 
   Малер Г., Кордес Ю. Основы биологической химии: Пер с англ. – М.: Мир, 1970. – 567 с.
   
4. 
   Химия биологически активных природных соединений / Под ред. Н.А. Преображенского. – М.: Химия, 1970. – 512 с.
   
5. 
   Современные методы в биохимии. / Под ред. В.Н. Ореховича. – М.: Медицина, 1977. – 392 с.
   
6. 
   Пептиды: Пер. с англ. / Под ред. Э. Гросса, И. Майенхофера. – М.: Мир, 1983. – 422 с.
   
7. 
   Шрайнер Р., Фьюзон Р., Кёртин Д. и др. Идентификация органических соединений: Пер. с англ. – М.: Мир, 1983. – 703 с.
   
8. 
   Химическая энциклопедия: В 5 т. Т.1. – М., 1988. – 623 с
   
9. 
   Досон Р., Элиот Д., Элиот У. и др. Справочник биохимика: Пер с англ. – М.: Мир, 1991. – 543 с.
   
10. 
    Практикум по биохимии: Учеб. пособ. / Л.М. Пустовалова. – Ростов н/Д: Феникс, 1999. – 544 с.
    
11. 
    Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия: Пер. с нем. – М.: Мир, 2000. – 469 с.
    
12. 
    Биохимия: Краткий курс с упражнениями и заданиями: Учеб. пособ. для вузов / Под ред. Е.С. Северина, А.Я. Николаева. Сер. XXI век. М., 2001. –
    448 с.
    
13. 
    Практикум по биохимии: Учеб. пособ. / А.А. Чиркин. – Минск: Новое знание, 2002. – 512 с.
    
14. 
    Жеребцов Н.А., Попова Т.Н., Артюхов В.Г. Биохимия: Учебник для вузов. – Воронеж: Гос. ун-т, 2002. – 693 с.
    
15. 
    Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия: Учебник для вузов. – М.: Высш. шк., 2002. – 479 с.
    
16. 
    Энциклопедия биологической химии: В 4 т. Т.4. М., 2004. – 503 с.
    
17. 
    Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия: Учебник для вузов. – М.: Дрофа, 2004. – 640 с.
    
18. 
    Биохимические основы жизнедеятельности человека: Учеб. пособ. / Ю.Б. Филиппович, А.С. Коничев и др. – М.: ВЛАДОС, 2005. – 407 с.
    
19. 
    Тумаков С.А., Темирбулатов Р.А., Савченко Р.П. Методы количественного определения белков: теоретические основы, дифференцированный подход и практическое использование: Учеб. пособ. – Самара-Пенза, 2006. – 85 с.
    

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ 5

1. ВНЕАУДИТОРНАЯ ПОДГОТОВКА 6

1.1. АМИНОКИСЛОТЫ 6

1.1.1. СТРОЕНИЕ, КЛАССИФИКАЦИЯ, НОМЕНКЛАТУРА 6

1.1.2. Биологические функции аминокислот 15

1.1.3. Физико-химические свойства аминокислот 20

Кислотно-основные свойства протеиногенных аминокислот 25

1.1.4. Химические свойства аминокислот 26

1.1.4.1. РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ КАРБОКСИЛЬНОЙ ГРУППЫ 26

1.1.4.2. Реакции с участием аминогруппы 29

1.1.4.3. Реакции с одновременным участием карбоксильной и аминогрупп 39

1.1.4.4. Специфические реакции аминокислот 41

Специфические реакции, используемые для идентификации
и количественного анализа α-аминокислот и белков 41

1.2. Полипептиды 45

1.2.1. Природа пептидной связи 45

1.2.2. Классификация полипептидов, отдельные представили
и их биологическая роль 48

1.2.2.1. Малые линейные пептиды 49

Пептидные гормоны 52

1.2.2.2. Циклопептиды 55

1.2.2.3. Белки 63

1.2.2.3.1. Уровни структурной организации белков 65

1.2.2.3.2. Классификация белков 75

1.2.2.3.3. Физико-химические свойства белков 82

1.2.2.3.4. Выделение белков 83

Контрольные вопросы, задачи и упражнения 84

2. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ 87

2.1. Идентификация аминокислот и белков 87

2.1.1. Общие качественные реакции аминокислот 87

2.1.2. Специфические качественные реакции аминокислот 89

2.1.3. Хроматографические методы разделения
и идентификации аминокислот и белков 94

RF для аминокислот при разделении методом хроматографии на бумаге 99

Практическая контрольная работа по идентификации
аминокислот и белков химическими
и хроматографическими методами 101

2.2. Количественный анализ аминокислот и белков 102

2.2.1. Титриметрические методы анализа аминокислот 102

2.2.2. Спектральные методы
количественного определения белка 107

Множители ƒ для вычисления концентрации белка 110

Практическая контрольная работа
по количественному анализу аминокислот и белков 116

Библиографический список 117

Оглавление 119

Учебное издание
СМИРНОВ Виктор Александрович,

КЛИМОЧКИН Юрий Николаевич
Аминокислоты и полипептиды
Редактор С.И. Костерина

Технический редактор В.Ф. Елисеева

Компьютерная верстка Е.Э. Парсаданян
Подп. в печать 10.01.08.

Формат 60х84 ¹/₁₆. Бумага офсетная.

Печать офсетная.

Усл. п. л. 6,51. Уч.-изд. л. 6,38.

Тираж 100 экз. Рег. № 405.

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Самарский государственный технический университет»

443100. г. Самара, ул. Молодогвардейская, 244. Главный корпус
Отпечатано в типографии

Самарского государственного технического университета

443100. г. Самара, ул. Молодогвардейская, 244. Корпус №8

 Рихард Кун – немецкий биохимик Основные работы посвящены исследованиям каротиноидов и витаминов. Нобелевская премия (1938 г). Кристофер Ингольд -английский химик. Основные работы посвящены физической органической химии, основателем которой он является. Ввел представление об электро– и нуклеофильных реагентах и реакциях, о хиральности. Владимир Прелог – швейцарский химик. Основные работы посвящены стереохимии, синтезу и исследованию органических соединений, в том числе антибиотиков. Нобелевская премия (1975 г).

 Станфорд Мур и Уильям Хоуард Стайн – американские биохимики. Разработали автоматический аминокислотный анализатор. Установили первичную структуру рибонуклеазы. Нобелевская премия (1972 г).

 К. Шоттен – немецкий химик – органик. Разработал метод ацилирования аминов в водно-щелочной среде (1844 г.).

Эйген Бауман – немецкий химик – органик и биохимик. Открыл реакцию ацилирования спиртов в водно-щелочном растворе. Впервые получил тиомочевину, установил формулу цистина и обнаружил в ткани щитовидной железы йод.

 Хуго Йозеф Шифф – итальянский химик-органик. Открыл реакцию конденсации первичных аминов с альдегидами и изучил продукты этой реакции (1864 г.).

^ Сёрен Петер Сёренсен – датский биохимик разработал метод количественного определения аминокислот в водных растворах. Ввел понятие рН (1909 г.).

^

* Дональд Декстер ван-Слайк – американский биохимик. Основные работы посвящены разработке методов анализа в области биохимии и клинической медицины.

 Эмиль Герман Фишер – немецкий химик-органик. Основные работы посвящены химии белков, углеводов, пуриновых соединений. Нобелевская премия (1902 г.).

 За открытие пенициллина и его терапевтического эффекта в 1945 г. была присуждена
Нобелевская премия английским биохимикам Александеру Флемингу, Эрнсту Чейну и Хоуарду Флори.

 Фредерик Сенгер – английский биохимик. Основные работы посвящены химии белка. Разработал динитрофторбензольный метод определения N-концевых аминокислот, с помощью которого расшифровал строение инсулина. Установил, что инсулин состоит из двух цепей – цепи А, содержащей 21 аминокислотный остаток, и цепи В, содержащей 30 аминокислотных остатков. Предложил метод расшифровки первичной структуры ДНК. Нобелевские премии (1958 г., 1980 г.).

 Лайнус Карл Полинг – американский физик и химик. Основные работы посвящены изучению строения молекул и природы химической связи. Разработал представления о вторичной структуре полипептидной цепи в белках. Впервые дал описание полипептидной α-спирали (1951 г.., совместно с американским биохимиком Р.Кори). Нобелевская премия (1954 г.).

 Фридрих Мишер – швейцарский врач. Основные работы посвящены изучению химического состава и обмена веществ в клетке. Выделил нуклеиновую кислоту и белок протамин.

 Тирозин растворяют в 1М растворе серной кислоты, поскольку он мало растворим в воде (см. табл.1.3).

 Приготовление раствора гипобромида натрия. 15 г гидроксида натрия растворяют в 50 мл воды, охлаждают и добавляют 1 мл брома (работу проводить под тягой). Раствор при хранении в темной склянке пригоден в течение 3 месяцев.

^ Приготовление раствора нитропруссида натрия. 1,5 г нитропруссида натрия добавляют к
5 мл 1М серной кислоты, перемешивают и затем добавляют 95 мл воды (лучше использовать метанол) и 10 мл концентрированного раствора. Раствор фильтруют и хранят в закрытой темной склянке.



 Отто Генрих Варбург – немецкий биохимик. Основные работы посвящены изучению окислительно-восстановительных процессов в живой клетке преимущественно методами спектроскопии. Спектральным методом открыл дыхательные ферменты – цитохромы. Совместно со своим сотрудником Вальтером Кристианом открыл также дыхательный фермент желтого цвета – флавин. Нобелевская премия (1931 г.).