Учебное пособие Часть I самара Самарский государственный технический университет 2007

• Название: Учебное пособие Часть I самара Самарский государственный технический университет 2007
• Дата: 09.04.2018
• Размер: 1.81 Mb.
• Имя файла: aminoacids.doc
• Тип: Учебное пособие; #40742
• страница: 9 из 10

Гель-хроматография (гель-фильтрация). Этот метод применяется главным образом в химии природных соединений и биохимических исследованиях. Он. основан на диффузионных свойствах гелей, образуемых некоторыми полимерами – декстранами или полиакриламидом (сефадексы и биогели). При пропускании через слой геля смеси веществ с различной молекулярной массой, следовательно, различающихся по размеру молекул, более мелкие молекулы проникают в гранулы геля, а более крупные свободно проходят с растворителем мимо гранул. В результате первыми элюируются наиболее крупные молекулы и далее – по мере уменьшения их размера. Поскольку размер пор в гранулах не может быть идеально стандартизирован, то удовлетворительные результаты этот метод дает только при разделения веществ, отличающихся по молекулярной массе не менее, чем на 300-400 единиц. Именно поэтому этот метод применяется для разделения крупных веществ, например полисахаридов, пептидов, белков, полинуклеотидов.

Тонкослойная хроматография (ТСХ). Этот метод относится к адсорбционным и является одним из самых быстрых, простых и доступных методов хроматографического анализа. Хроматографирование осуществляется на пластинке, равномерно покрытой слоем адсорбента. Выпускаются готовые стандартные пластинки для тонкослойной хроматографии марки «Силуфол» из алюминиевой фольги, покрытой закрепленным слоем силикагеля.

Нанесение пробы. Анализируемую пробу раствора наносят с помощью микрокапилляра на пластинку на расстоянии 6-8 мм от ее края. Если проба представляет собой сухую смесь, то её растворяют полностью желательно в неполярном и легко испаряющемся растворителе. Если такого растворителя нет, растворяют в любом подходящем кроме растворов минеральных кислот и щелочей. В любом случае после нанесения пробы необходимо пластинку выдержать некоторое время до полного испарения растворителя.

Для получения качественных хроматограмм с выраженными пятнами необходимо соблюдать ряд правил: размер пятна в диаметре не должен превышать 2-3 мм; количество вещества в пятне не должно быть слишком большим (обычно для анализа достаточно 1-20 мкг). При несоблюдении этих правил получаются слишком большие вытянутые в длину пятна (пятна с «хвостами»), и вещества с близкими значениями R_f сольются в одно пятно. Именно поэтому для нанесения пятен используют микрокапилляры, которые можно сделать самостоятельно из капилляров для определения температуры плавления на спиртовке. Ширина и высота хроматографической пластинки, которую необходимо отрезать от продажной пластинки, выбираются с учетом поставленной задачи. Например, если на пластинку необходимо нанести сразу три пятна, то ширина пластинки должна составлять 20-25 мм, а если одно – 10-12 мм.

Высота пластинки для анализа смесей, содержащих не более 3 компонентов, достаточна 7-8 см. Линию старта и линию финиша целесообразно отметить тонким твердым графитовым карандашом.

Хроматографирование. Перед началом хроматографирования камера должна быть подготовлена (рис. 2.2). Большую часть стенок камеры обкладывают фильтровальной бумагой, оставляя свободную часть для наблюдения за пластинкой. Фильтровальную бумагу смачивают элюентом и наливают слой элюента высотой 3-4 мм. Камеру закрывают крышкой. Высушенную хроматографическую пластинку с нанесенными образцами аккуратно пинцетом помещают в хроматографическую камеру и закрывают ее пришлифованной крышкой. При помещении пластинки в камеру нанесенные пробы не должны оказаться ниже уровня жидкости. Наблюдают за поднятием фронта растворителя и, когда он достигнет линии финиша, пластинку вынимают из камеры и подсушивают. В качестве элюентов для эффективного разделения аминокислот применяется ряд обшепринятых систем (табл. 2.1).

Проявление хроматограмм. При хроматографировании бесцветных веществ их пятна необходимо обнаружить на хроматограмме. Это делается либо просмотром пластинки под ультрафиолетовой лампой, либо химическими методами. Самым общеупотребительным реагентом для проявления хроматограмм разпичных веществ является йод, который помещают в йодную камеру (обычно эксикатор). Пластинку помещают на 10 -20 с в йодную камеру, вынимают и карандашом отмечают быстро исчезающие коричневые пятна. Если йод приемлем для проявления хроматограмм широкого круга веществ, то нингидрин применяют лишь для проявления пятен аминокислот и пептидов. Однако используется не водный раствор, а ацетоновый с концентрацией 0,25% (масс./об.), поскольку вода может смыть пятна. Пластинку лучше быстро окунуть в раствор, но можно и опрыскивать аккуратно под тягой, чтобы не попасть на руки. После этого пластинку нагревают при 100ºС в течение 5 мин. Аминокислоты дают пурпурные пятна; гистидин и глицин – красно-серые; фенилаланин, тирозин и аспарагиновая кислота – синие; триптофан – коричневые; аспарагин – грязно-желтые; пролин – желтые. Чувствительность метода варьирует в диапазоне от 0,2 мкг для глицина до 2 мкг для гистидина.

Таблица 2.1

R_F для аминокислот при разделении методом хроматографии на бумаге

L-Аминокислота	RF
	н-Бутанол – 12 Уксусная кислота – 3 Вода – 5	н-Бутанол – 1* пиридин – 1 вода – 1
Глицин	0,23	0,29
Аланин	0,30	0,37
Серин	0,22	0,33
Цистеин	0,08	0,14
Аспарагиновая к-та	0,23	0,20
Аспарагин	0,12	0,20
Фенилаланин	0,60	0,63
Тирозин	0,45	0,60
Триптофан	0,50	0,62
Гистидин	0,23	0,29
Валин	0,51	0,48
Треонин	0,26	0,36
Метионин	0,50	0,53
Глутаминовая к-та	0,28	0,20
Глутамин	0,17	0,23
Лейцин	0,70	0,60
Изолейцин	0,67	0,56
Аргинин	0,15	0,15
Лизин	0,12	0,13
Пролин	0,34	0,34

* Указаны объёмные части.

После проявления хроматограмм рассчитывают хроматографические константы R_F (от англ. ratio of fronts – отношение фронтов, рис. 2.3). При четком выполнении рекомендованных условий они могут применяться для идентификации.



R_F вещества А рассчитывают как отношение длины пробега от линии старта до центра пятна А к фронту растворителя, т.е. R_FА =
= А/F. Аналогично R_F В = В/F (см. рис. 2.3). Полученные величины R_F сравнивают с табличными. Однако такая идентификация весьма ненадежна, поскольку R_F весьма вариабельна и зависит от многих факторов. Если исследуется препарат, в котором предполагается наличие определенных аминокислот, то на пластинку необходимо нанести свидетели, т.е. растворы предполагаемых веществ. Это увеличивает достоверность анализа.

Бумажная хроматография (БХ) широко применяется для анализа аминокислот и других полярных соединений: высших карбоновых кислот, высших спиртов, фенольных соединений и др. Носителем неподвижной фазы служит хроматографическая бумага – особый тип фильтровальной бумаги высокой чистоты и равномерной плотности. В зависимости от плотности бумага подразделяется на медленную, среднюю и быструю.

Неподвижной фазой, если бумага специально не обработана, является вода, находящаяся в порах целлюлозы (около 14-20% в воздушно-сухой целлюлозе). По технике выполнения нет принципиального отличия от ТСХ, если фронт растворителя движется снизу вверх (восходящая БХ). Однако лист бумаги не прислоняют к стенке камеры как пластинку, а всегда подвешивают в хроматографической камере вертикально. Для этого по диаметру стакана натягивают и приклеивают к наружным стенкам камеры тонкую нитку. Длина бумажной полоски равна расстоянию от дна стакана до верхнего края плюс еще 1 см. На бумаге делают сгиб и за этот сгиб подвешивают ее на нить так, чтобы ее нижний конец лишь касался дна, и закрывают крышку.
Опыт 13. Идентификация аминокислот методом ТСХ и БХ. На бумажную полоску наносят пятно исследуемого раствора аминокислоты, как описано выше, высушивают и хроматографируют в одной из систем, приведенных в табл. 2.1. Бумагу высушивают, смачивают 0,25%-ным раствором нингидрина в ацетоне и после испарения ацетона нагревают 5 мин в сушильном шкафу при 100ºС. Вычисляют R_F и, сопоставляя его с данными табл. 2.1, делают заключение о подлинности препарата.
Практическая контрольная работа по идентификации
аминокислот и белков химическими
и хроматографическими методами

Задание. Каждый студент получает 10 мл раствора, содержащего неизвестное количество неизвестных аминокислот. Раствор может также содержать белок.

Цель работы – определить, какие аминокислоты содержатся в исследуемом растворе и есть ли в нем белок.

Алгоритм выполнения:

1. 
   Установить, есть ли в растворе белок.
   
2. 
   Если есть белок, удалить его, а оставшийся раствор продолжать исследовать.
   
3. 
   Хроматографировать исследуемый раствор на бумаге в любой из систем, приведенных в табл. 2.1.
   
4. 
   Сделать предварительное заключение о наличии возможных аминокислот, отбросив явно неподходящие.
   
5. 
   Провести специфические реакции на предполагаемые аминокислоты
   
6. 
   Если химическими методами будут обнаружены какие-либо аминокислоты, провести БХ с использованием свидетелей.
   
7. 
   Если не все ингредиенты раствора после этого будут идентифицированы, провести БХ и ТСХ в двух системах с использованием свидетелей.
   
8. 
   Все этапы работы запротоколировать и сделать мотивированное заключение.
   

2.2. Количественный анализ аминокислот и белков

2.2.1. Титриметрические методы анализа аминокислот

Как видно из данных табл. 1.4, аминокислоты нельзя титровать ни кислотами, ни щелочами в водной среде, однако их можно определять методами неводного титрования – титрованием хлорной кислотой в среде ледяной уксусной кислоты или титрованием этилатом натрия в диметилформамиде. Эти методы приемлемы лишь для анализа сухих образцов и непригодны для определения аминокислот в водных растворах, поэтому их применение в биохимии не представляет интереса. Из всех протеиногенных аминокислот лишь аспарагиновую и глутаминовую аминокислоты можно определять алкалиметрически в водной среде, поскольку их кислые свойства выражены достаточно сильно за счет наличия в их молекулах двух карбоксильных групп.

Тем не менее есть два общих метода алкалиметрического титрования, которые позволяют проводить анализ водных растворов любых аминокислот.

Первый метод разработан еще в 20-х гг. прошлого века биохимиком Сёренсеном в период его работы в Баварской пивной компании, когда перед ним встала задача определения аминокислот в пиве. Сущность метода рассмотрена ранее.

Второй метод заключается в титровании водного раствора аминокислоты, разбавленного в 10 раз 96%-ным этиловым спиртом, 0,1М водным раствором КОН с индикатором тимолфталеином. По этому методу определяют содержание карбоксильных групп в небольших полипептидах, которые не осаждаются спиртом, и в белковых гидролизатах, предварительно обработанных катионитами.

Еще одним общим методом титриметрического анализа аминокислот является йодометрический метод, который приемлем для анализа кислых белковых гидролизатов. Метод основан на следующих реакциях и операциях:

Сначала получают суспензию ортофосфата меди и обрабатывают этой суспензией, взятой в избытке, в присутствии боратного буфера исследуемый раствор аминокислоты.

3CuSO₄ + 2Na₂НPO₄ + 2NaOH Cu₃(PO₄)₂ + 3Na₂SO₄ + 2H₂O





I₂ + 2 Na₂S₂O₃ 2 NaI + Na₂S₄O₆
При этом образуется растворимая комплексная медная соль аминокислоты, которую отфильтровывают от избытка ортофосфата меди. Аликвотную часть фильтрата обрабатывают избытком йодида калия в присутствии уксусной кислоты и выделившийся йод оттитровывают тиосульфатом натрия. Молярная масса эквивалента аминокислоты равна двум молекулярным массам аминокислоты (Эаминокислоты = 2Маминокислоты), соответственно эквивалент аминокислотного азота равен двум его атомным массам (Э_N = 2A_N = 28,01). Следует отметить, что этим методом определяется не любой азот, а только α-аминокислотный.
Опыт 14. Определение аминокислот методом формольного титрования. К раствору, содержащему около 1 мэкв аминокислоты, добавляют равный объем предварительно нейтрализованного по фенолфталеину формалина* и титруют 0,1М раствором NaOH до появления розоватого окрашивания.

* К 100 мл формалина ( 38%-ный водный раствор формальдегида) добавляют 8-10 капель раствора фенолфталеина и прикапывают 0,1М раствор NaOH до появления розоватого окрашивания (этот объем щелочи замерять не надо).

1 мл 0,1М раствора NaOH соответствует 0,001401 г аминокислотного азота или 0,1мэкв г аминокислоты.

Контрольные вопросы

1. Какую массу имеет 1 мэкв глутаминовой кислоты в этом методе?

2. Какую массу имеет 1 мэкв аланина в этом методе?

3. Почему кислые белковые гидролизаты нельзя анализировать этим методом?

4. В какой форме должен находиться катионит, чтобы его можно было использовать для удаления минеральных кислот из кислых белковых гидролизатов?
Опыт 15. Определение карбоксильных групп методом титрования в этиловом спирте. К 5 мл водного раствора гидролизата белка, содержащего около 1 мэкв карбоксильных групп, добавляют 50 мл 96%-ного этилового спирта, предварительно нейтрализованного по тимолфталеину*, и титруют 0,1М раствором КОН до появления синего окрашивания.

* К 100 мл 96%-ного этилового спирта добавляют 8-10 капель раствора тимолфталеина и прикапывают 0,1М раствор КOH до появления синего окрашивания (этот объем щелочи замерять не надо).

1 мл 0,1М раствора КOH соответствует 0,004502 г карбоксильных групп.

Если известна молекулярная масса полипептида или аминокислоты, то можно определить число карбоксильных групп, содержащихся в молекуле, по формуле

N = M∙V/А∙10000,

где N – число карбоксильных групп в молекуле;

V – объем 0,1М раствора КОН, пошедший на титрование, мл;

А – сухая навеска полипептида или аминокислоты, г;

М – молекулярная масса полипептида или аминокислоты, Да;

10⁴ – пересчетный коэффициент для 0,1М раствора КОН.

Примечание. Метод неприемлем для анализа кислых белковых гидролизатов.

Контрольные вопросы

1. Сколько мл 0,1М раствора КОН пойдет на титрование 0,147 г глутаминовой кислоты в этом методе?

2. Какую массу имеет 1 мэкв аланина в этом методе?

3. Как определяется пересчетный коэффициент в вышеприведенной формуле? Рассчитайте его для 0,02М раствора КОН.
Опыт 16. Определение аминокислотного азота в кислых белковых гидролизатах йодометрическим методом. 2 мл кислого гидролизата белка, содержащего около 1% суммы аминокислот, помещают в мерную колбу емкостью 25 мл, добавляют 1 каплю раствора тимолфталеина и по каплям добавляют 1М раствор NaOH до появления голубоватого окрашивания. Затем в колбу добавляют 10 мл суспензии ортофосфата меди*, тщательно перемешивают в течение 2 мин и доводят до метки водой. Полученную суспензию фильтруют через плотный фильтр. Первые 5-6 мл фильтрата отбрасывают. 10 мл фильтрата помещают в колбу для титрования, добавляют 2 мл 10% (масс./об.) раствора KI и 0,5 мл ледяной уксусной кислоты, перемешивают и титруют выделившийся йод 0,02М раствором тиосульфата натрия до слабой окраски йода, добавляют 4 капли раствора крахмала и продолжают титрование до исчезновения синего окрашивания.

* Приготовление суспензии ортофосфата меди. Предварительно готовят 3 раствора.

1. Раствор А – 50,0 г CuSO₄∙5H₂O растворяют в 1 л воды.

2. Раствор Б – 64,3 г Na₂HPO₄ и 7,2 г NaOH растворяют в 1 л воды.

3. Раствор В – 28,6 г Na₂В₄O₇∙10H₂O растворяют в 800 мл воды, добавляют 50 мл 1М раствора HCl и доводят до 1 л водой.

Суспензия ортофосфата меди – к 100 мл раствора Б добавляют порциями при перемешивании 50 мл раствора А и затем добавляют 100 мл раствора В. Перед употреблением суспензии её тщательно взбалтывают и отбирают на анализ цилиндром. Срок годности 1 день.

1 мл 0,02М раствора Na₂S₂O₃ соответствует 0,5602 мг аминокислотного азота.

Контрольные вопросы

1. Опираясь на реакции, лежащие в основе метода, рассчитайте титр аминокислотного азота по 0,02М раствору Na₂S₂O₃.

2. Приведите формулу для расчета содержания аминокислотного азота в размерности мг/100 мл с учетом приведенной выше методики.

3. Суспензия ортофосфата меди должна для анализа браться в избытке. Проверьте, действительно ли это так.

4. Можно ли в этом методе использовать вместо сульфата меди хлорид меди (СuCl₂∙2H₂O) и, если да, то сколько граммов его надо взять для приготовления раствора А?

5. Зная содержание аминокислотного азота, можно рассчитать, сколько белка подверглось полному гидролизу, и определить содержание суммы аминокислот, образовавшихся при этом. Рассчитайте необходимые для этого пересчетные коэффициенты, если известно, что все белки, согласно Г.Мульдеру (1836 г.), содержат общий гипотетический радикал – «протеин», имеющий эмпирическую формулу C₄₀H₆₂N₁₀O₁₂.

2.2.2. Спектральные методы
количественного определения белка

Для количественного определения белка в водных растворах широко используются методы УФ-спектроскопии, спектроскопии в видимой области и фотоэлектроколориметрии.

Количественный анализ белков в ближней УФ-области электронного спектра заключается в измерении собственного поглощения. Типичные УФ-спектры белков в ближней (кварцевой) области (200-350 нм) представлены на рис. 2.4. Максимум поглощения вблизи 280 нм обусловлен наличием в их структуре остатков ароматических аминокислот (Phe, Tyr, Trp, His). Резкое увеличение поглощения в направлении от 240 нм к 200 нм с максимумом в вакуумной области около 180 нм (на рисунке не показано) обусловлено возбуждением электронов атома азота пептидной группы (n→π* переход).

Поглощение в УФ-области количественно описывается законом Бера – Ламберта – Бугера:

D = − lgI/I_o = εLC,

где D – оптическая плотность; I – интенсивность света, прошедшего через образец; I_o – интенсивность падающего на образец света;
ε – молярный коэффициент поглощения, л/моль∙см; L – толщина слоя, см; C – концентрация, моль/л. В том случае, если концентрация используется в размерности г/100 мл, коэффициент пропорциональности называется удельным коэффициентом поглощения и обозначается символом Е^1%_{1 см} .

Аналитической полосой при определении концентрации белка обычно является λ_{280 нм}, соответствующая максимуму поглощения. Исследуемый раствор готовят так, чтобы оптическая плотность фотометрируемого раствора лежала в зоне 0,1-1,0. Значения D₂₈₀ для большинства белков при концентрации 1 мг/мл находятся в диапазоне 0,5-2,0, хотя известно также довольно много белков, для которых D₂₈₀ не попадает в указанный диапазон. Молярный коэффициент поглощения тем больше, чем больше доля остатков аминокислот с ароматическими ядрами в молекуле белка. Для определения концентрации используются несколько методических приемов.

1. Расчет с использованием известного значения коэффициента поглощения:

C = D/ε∙L.

Это самый простой метод, однако применение его весьма ограничено по следующим причинам. Как видно из рис. 2.4, коэффициенты поглощения разных белков весьма отличаются друг от друга, иногда в несколько раз (сравни спектры рибонуклеазы и химотрипсиногена), поэтому рассматриваемый метод приемлем только для определения концентрации белка с известным значением ε в растворах, не содержащих других белков и аминокислот с ароматическими заместителями. Анализ раствора неизвестного белка или раствора, содержащего несколько белков, таким методом не возможен.

2. Расчеты в методах с использованием стандартных образцов. Использование стандартного образца исключает необходимость использования величины ε. Различают несколько методических подходов к определению концентрации с использованием стандартных образцов: метод стандартов, метод градуировочного графика и метод добавок.

Метод стандартов состоит в измерении оптической плотности раствора стандартного белка (D_ст.)известной концентрации (C_ст.) и измерении оптической плотности (D_ис.) исследуемого раствора белка в кюветах одинаковой толщины. В этих условиях имеем
D_ис. = εLC_ис; D_ст. = εLC_ст.
Поделив одно уравнение на другое, после преобразования имеем
С_ис. = D_ис.∙С_ст. / D_ст.
Метод градуировочного графика состоит в измерении оптических плотностей серии стандартных растворов (обычно 5-6) известной концентрации и построении градуировочного графика в координатах «оптическая плотность – концентрация белка в исследуемом растворе». Этот метод удобен при серийных испытаниях.

Метод добавок заключается в измерении оптической плотности исследуемого раствора, к которому после этого добавляют известное количество стандартного образца белка и вновь измеряют оптическую плотность.

Очевидно, что С_ис. = D_ис.∙С_ст. / D_ис.+ст. – D_ис.

Итак, анализ возможностей определения концентрации белка в растворах путем измерения непосредственного поглощения белка при одной аналитической длине волны в УФ-области показывает, что он приемлем лишь для анализа растворов индивидуальных известных белков.

Лучшим методом определения концентрации белка по его непосредственному поглощению является метод Варбурга^ и Кристиана, основанный на измерении оптической плотности при двух длинах волн – 280 и 260 нм. При этом не требуется использование стандартного образца и знание значения коэффициента поглощения. Метод базируется на том, что отношение D280/D260 для различных белков – величина маловариабельная и равна 1,75 (сравни с рис.2.4). Это позволяет определять обшую концентрацию белка при анализе смесей белков.

Расчет при этом проводится по простой формуле
С_{белка (мг/мл)} = 1,55D₂₈₀ − 0,76D_260.
Более того, метод позволяет определять белок в присутствии нуклеиновых кислот. При этом используются пересчетный множитель ƒ (табл. 2.2). В этом случае расчет производится по формуле

С_{белка (мг/мл)} = D₂₈₀ ∙ƒ.
Таблица 2.2

Множители ƒ для вычисления концентрации белка

D280/D260	Содержание нуклеиновой кислоты*, %	ƒ	D280/D260	Содержание нуклеиновой кислоты*, %	ƒ
1,75	0	1,118	0,86	5,2	0,671
1,60	0,30	1,078	0,84	5,6	0,650
1,50	0,56	1,047	0,82	6,1	0,628
1,40	0,87	1,011	0,80	6,6	0,605
1,30	1,26	0,969	0,78	7,1	0,581
1,25	1,49	0,946	0,76	7,8	0,555
1,20	1,75	0,921	0,74	8,5	0,528
1,15	2,05	0,893	0,72	9,3	0,500
1,10	2,40	0,863	0,70	10,3	0,470
1,05	2,80	0,831	0,68	11,4	0,438
1,00	3,3	0,794	0,66	12,8	0,404
0,96	3,7	0,763	0,64	14,5	0,368
0,92	4,3	0,728	0,62	16,6	0,330
0,90	4,6	0,710	0,60	19,2	0,289
0,88	4,9	0,691

* Содержание нуклеиновой кислоты относительно суммы концентраций белка и нуклеиновой кислоты.
Коэффициенты для расчета концентрации белка (1,55 и 0,76) и значения пересчетного множителя ƒ получены путем измерения поглощения кристаллической дрожжевой енолазы (при концентрации 1 мг/мл – D₂₆₀ = 0,512, D₂₈₀ = 0,894) и очищенной дрожжевой нуклеиновой кислоты (при концентрации 1 мг/мл – D₂₆₀ = 22,1, D₂₈₀ = 10,8).

При этом по данным табл. 2.2 можно рассчитать не только значение множителя ƒ, но и определить содержание нуклеиновой кислоты в исследуемом растворе.