Иммунология. Основы медицинской иммунологии. Учебное пособие Рекомендовано Ученым советом Военномедицинской академии имени С. М. Кирова для курсантов и студентов
 Скачать 7.86 Mb.
|
|
Глава 10. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ИММУНОПАТОЛОГИИ Современные методы диагностики иммунопатологии подразделяются на несколько групп. Одни из них направлены на выявление дефектного звена и оценки выявленной иммунной дисфункции. Другие определяют этиологическую причину заболевания, а также количественные изменения в изучаемом дефектном звене. Данные направления исследований важны для постановки диагноза, выбора средств терапии, а также оценки эффективности проводимой терапии. Применение поликлональных антител в настоящее время используется для скрининговых исследований и этиологической диагностики инфекционной патологии. Использование моноклональных антител объединяет более широкий спектр исследований: - идентификация субпопуляций лимфоцитов человека (метод флюоресцирующих антител, метод проточной цитометрии); - установление функций молекул клеточной поверхности; - диагностика новообразований; - анализ эмбрионального развития и многие другие. Определение уровней иммуноглобулинов является важным в диагностике инфекционной патологии, миеломной болезни, лимфопролиферативных заболеваний (для этого в настоящее время по- прежнему используют методы преципитации в агаре и иммуноферментный анализ). Исследование системы комплемента включает как оценку количественного содержания определенных компонентов, так и их функциональную активность, т.е. способность перфорировать (лизировать) клетки-мишени. В скрининговых исследованиях основными объектами исследования являются компоненты С3, С4, С5. Определение других 419 комонентов комплемента проводится гораздо реже, при подозрении на первичный иммунодефицит. Оценку системы комплемента проводят двумя методами. Метод, позволяющий оценить функциональную активность белков системы комплемента по 50% гемолизу и количественное определение компонентов комплемента методом ИФА. Обнаружение аутоантител с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции и ИФА (антинуклеарный фактор, антицентромерные, антимихондриальные, антинейтрофильные антитела и др.) в сыворотке крови используется при диагностике аутоиммунной патологии. Реакции гиперчувствительности 1 типа выявляются с помощью определения общего IgЕ методом ИФА, иммунокомплексные реакции выявляются определением иммуноглобулинов классов G или М. Определение количества лимфоцитов используется для оценки состояния клеточного звена иммунитета. Для этого в настоящее время используется иммунофенотипирование с использованием моноклональных антител к CD-антигенам, экспрессируемым различными популяциями лимфоцитов. Подсчет лимфоцитов проводится в основном методом проточной цитометрии, позволяющей идентифицировать каждую клетку по интенсивности флюоресцентного сигнала. В последние годы все больше молекулярно-биологических методов находят практическое применение в различных областях медицины, промышленности и сельского хозяйства. Один из таких методов ˗ полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая нарабатывать в пробирке определенный участок молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) практически в неограниченных количествах. В медицине ПЦР применяют при диагностике инфекционных и наследственных заболеваний, при диагностике рака и иммунных патологий. ПЦР используют для идентификации личности и определения биологического родства индивидов. Санитарно-эпидемиологические службы 420 используют ПЦР для контроля за микробиологическим загрязнением окружающей среды и продуктов питания, а также для выявления генетически модифицированных источников пищи (ГМИ). 10.1. Метод флюоресцирующих антител Используют два варианта метода – прямой и непрямой иммунофлюоресценции. Метод прямой иммунофлюоресценции используется для скрининговых исследований. Объект исследования (взвесь микроорганизмов, суспензия живых клеток) обрабатывается антителами, соединенными с флюорохромом и которые тропны соответствующим антигенам. Инкубируется во влажной камере и оценивается с помощью люминесцентного микроскопа. Заключение дается по специфическому зеленому свечению и характерной морфологической картине. Непрямая иммунофлюоресценция – метод, основанный на использовании специфичности иммунологической реакции антиген-антитело и чувствительности флюоресцентной микроскопии. При применении этого метода суспензию живых клеток вначале обрабатывают антителами, специфическими к выявляемому антигену, а затем – антителами, соединенными с флюороохромом и направленными против специфических антител. Оценка результатов производится по специфическому свечению клеток в люминесцентном микроскопе. Непрямая иммунофлюоресценция увеличивает время исследования и несколько снижает чувствительность, но повышает специфичность метода. Методика и особенности постановки этих двух реакций описаны во многих учебниках и пособиях. Схема постановки метода флюоресцирующих антител в диагностике инфекционной, аутоиммунной патологии представлена на рис. 10.1. 421 Рис. 10.1. Реакция прямой и непрямой иммунофлюоресценции 10.2. Иммуноферментный анализ В основе иммуноферментного анализа лежит иммунная реакция взаимодействия антигена с антителом. Для выявления образовавшихся иммунных комплексов [антиген-антитело] используется фермент, которым предварительно метится узнающий компонент (антиген или антитело). Сам фермент, естественно, не виден, поэтому визуализация присутствия вещества, определяемого методом ИФА, достигается применением посредника – хромогена. Это особое химическое соединение, хорошо растворимое в воде, раствор которого бесцветен. Превращение бесцветного хромогена в цветное вещество хромофор происходит под действием фермента, для которого хромоген является субстратом. Слова "хромоген" и "хромофор" в переводе с греческого означают "производящий цвет" и "несущий цвет", соответственно. В другом варианте ИФА хромоген окисляется продуктом реакции, которую катализирует ферментная метка. Окисленное соединение приобретает цветную окраску. В зависимости от модификации 422 иммуноферментного анализа хромофор либо остается в растворе, либо выпадает в осадок. Меченный ферментом специфический компонент в конце проведения иммунной реакции находится в двух состояниях: связанном (в составе комплекса [антиген – антитело]) и свободном (не вступивший в реакцию его избыток). Количество образовавшихся комплексов [антиген – антитело], а тем самым и содержание определяемого вещества, оценивают по каталитической активности ферментной метки. Перед проведением ферментативной реакции необходимо разделить свободную и связанную фракции ферментной метки. С этой целью применяют иммуносорбент, состоящий из двух связанных между собой особым образом компонентов: специфического реагента, выполняющего роль "ловушки", и нерастворимого вещества, которое именуется термином "твердая фаза", и на поверхности которого образуются иммунные комплексы. После образования на твердой фазе специфического комплекса [антиген-антитело] жидкая фаза удаляется. Вместе с другими веществами и реагентами, содержащимися в растворе, удаляется и не вступивший в специфическую связь реагент, меченый ферментом. В итоге на твердой фазе остается только ферментная метка, входящая в состав комплекса [антиген – антитело] С внесением на твердую фазу хромоген – субстратного раствора начинается ферментативная реакция, результаты которой определенным образом регистрируются. Твердая фаза может быть представлена различными полимерными материалами и иметь разную форму. Плоскодонные 96-луночные планшеты и шарики изготавливаются из полистирола, полоски мембран – из нитроцеллюлозы и полиамидов. Применение шариков, по сравнению с цилиндрическими лунками, позволяет использовать большую площадь для адсорбции и проводить более равномерную отмывку всех участков поверхности. Еще большей сорбционной емкостью обладает нитроцеллюлоза 423 и полиамиды, из которых изготавливают мембраны. В настоящее время применяются планшеты из материалов нового поколения, которые значительно повысили чувствительность метода. В общем виде схема ИФА представлена на рис. 10.2. Рис. 10.2. Схема проведения ИФА-анализа (сэндвич-метод) и полистироловый планшет с результатами ИФА-анализа (по Д. Мейл, Дж. Бростофф, 2007) Для обнаружения антигенов используют в основном следующие методы ИФА: конкурентный метод, "сэндвич" метод и двойной "сэндвич" метод. Конкурентный метод. В конкурентном методе процесс происходит с участием трех компонентов: связанных с твердой фазой антител против определяемого вещества (антигена), меченного ферментом антигена 424 (конъюгата) и антигена опытной пробы. При этом имеет место конкуренция между фиксированным количеством меченого антигена и неизвестным количеством определяемого антигена. Так как количество антител на твердой фазе ограничено, конъюгата связывается тем меньше, чем больше анализируемого антигена в пробе. После удаления в ходе промывки не связавшихся компонентов измеряют ферментативную активность иммобилизованного комплекса антиген – антитело. Особенностью сэндвич-метода является создание сложного иммунного комплекса. Комплекс образован двумя антителами и антигеном между ними. Условием одновременного связывания обоими антителами определяемого антигена является наличие двух антигенных детерминант (эпитопов). Кроме того, эпитопы на молекуле антигена должны быть расположены друг от друга на расстоянии, достаточном, чтобы антитела свободно связывались с соответствующими специфическими участками. Это возможно только на крупных молекулах массой более 1000 Да. Сравнение двух методов иммуноферментного анализа представлено на рис. 10.3. Рис.10.3. Схема сравнения двух методов (конкурентного и сзндвич) (по Д. Мейл, Дж. Бростофф, 2007) 425 Искусство разработчиков таких тест-систем состоит в том, чтобы, проанализировав антигенный состав вещества, найти подходящую пару эпитопов, а затем к каждому из них получить специфические антитела. Это стало возможным благодаря использованию моноклональных антител, которые обладают высокой специфичностью и реагируют только с определенной антигенной детерминантой. Иммобилизованное на твердой фазе первое антитело, связываясь с соответствующим эпитопом, захватывает из раствора молекулу антигена. Антитело, входящее в состав ферментного конъюгата, обладает специфичностью к другому участку поверхности молекулы антигена. Связывание антигена первым антителом не препятствует связыванию со вторым (конъюгатом), поэтому опытный образец и конъюгат вносят на твердую фазу одновременно. По окончании инкубации проводят промывку, удаляют несвязавшуюся часть конъюгата, вносят раствор субстрата (хромогена) и измеряют ферментативную активность твердой фазы, которая пропорциональна количеству антигена в пробе. Специфичность данного метода значительно выше конкурентного, так как идентификация молекулы определяемого вещества происходит только при условии узнавания одновременно двух антигенных детерминант. Кроме того, отпадает необходимость в дополнительной промывке. Данный вариант ИФА получил наиболее широкое распространение для обнаружения антигенов возбудителей инфекционных заболеваний, определения в крови концентрации онкомаркеров и других специфических белков и используется во многих коммерческих тест-системах. Метод двойного "сэндвича". Данная схема постановки анализа, по сравнению с "сэндвич"- методом, несколько усложняется за счет применения третьих антител. Начальные этапы проводятся аналогично с теми же реагентами, что и в предыдущем методе, но антитела 2 не имеют ферментной метки. Помечены ферментом антивидовые антитела 3 против антител 2. 426 Результаты исследования могли бы быть искажены, если бы антитела 3 реагировали и с антителами 1. Во избежание этого животные, от которых получены антитела 1 и 2 должны принадлежать к разным видам. Например, если антитела 2 получены из кроличьей иммунной сыворотки, то антитела 1 должны быть получены из сыворотки другого вида животных (коза, мышь и т.д., но не кролик). Соответственно антитела 3 – это антитела к иммуноглобулинам кролика. 10.3. Метод проточной цитометрии Метод основан на использовании моноклональных антител, конъюгированных (прямой метод) или неконъюгированных с флюоресцентной меткой (непрямой метод). При использовании неконъюгированных антител применяются связывающие антимышиные поликлональные антитела, меченные флюоресцентной меткой. В качестве флюоресцеиновых красителей используются флюоресцинизотиоцианат (ФИТЦ), который дает зеленое окрашивание или R-фикоэритрии (ФЭ), который дает красно-оранжевое окрашивание. Каждый из используемых флюорохромов имеет «свою» длины волны, поэтому прибор может быть оснащен датчиками для различных флюоресцентных красителей. Учет результатов проводится с помощью проточного цитофлюориметра. Принцип его работы заключается в следующем: суспензия предварительно окрашенных клеток под давлением впрыскивается в центр быстро движущегося в том же направлении потока жидкости, в результате чего скорость движения клеток резко возрастает, и они выстраиваются, образуя столбик, окруженный оболочечной жидкостью. Благодаря приему гидродинамической фокусировки создаются условия ламинарного потока без перемешивания суспензии клеток с обтекающей жидкостью. Попадая в измерительную камеру прибора, клетки возбуждаются светом определенной длины волны, идущим от аргонового лазера или ртутно-кварцевой лампы, и посылают световые сигналы другой длины волны, которые, проходя через 427 систему оптических линз, фильтров, двухцветовых зеркал, регистрируются фотоэлектронным умножителем, преобразующим эти световые сигналы в электрические, которые обрабатываются компьютером и выдаются как характеристики клеток в виде гистограмм. При этом в случае одномерной гистограммы на оси абсцисс откладывается интенсивность флюоресценции клеток, а по оси ординат - число клеток с определенной интенсивностью флюоресценции (рис. 10.4). Рис. 10.4. Схема проведения проточной цитофлюориметрии (по Д. Мейл, Дж. Бростофф, 2007) Результаты проточной цитометрии отличаются высокой точностью, благодаря подсчету большого количества клеток. Важным достоинством 428 метода является воспроизводимость получаемых результатов, его относительная простота. К недостаткам можно отнести достаточно высокую стоимость исследования. 10.4. Полимеразная цепная реакция Открытие полимеразной цепной реакции стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять данную область науки на качественно новый уровень. Внедрение полимеразной цепной реакции в медицину открыло новое диагностическое направление – ДНК-диагностику. ПЦР в настоящее время представляет собой наиболее технологичный метод для исследования геномов организмов и вирусов. Метод применяют в специально спланированных и оборудованных ПЦР-лабораториях, работающих в различных областях медицинских и биологических исследований. Под ПЦР-анализом понимают последовательно выполняемые этапы пробоподготовки, амплификации и детекции полученных продуктов, которые проводят в условиях in vitro с применением специального оборудования и реактивов для каждого из них. В настоящее время ПЦР представляет процесс, протекающий в одной пробирке и состоящий из повторных циклов амплификации (размножения, копирования) специфической последовательности молекулы ДНК с целью получения достаточно большого количества копий, которые могут быть выявлены обычными методами детекции. Одним из ключевых компонентов реакции являются "праймеры"– синтетические олигонуклеотиды, состоящие из 20-30 оснований, комплементарных "сайтам" (участкам) отжига (присоединения) на идентифицируемой матричной ДНК. Каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий, протекающих при различных температурах: денатурации, отжига и удлинения. Во время 1-ой стадии – денатурации, происходит плавление ДНК при температуре 95°С, при этом нити ДНК разъединяются и становятся доступными для праймеров. При 429 отжиге ("anneling") реакционная смесь охлаждается д конца цепочки ДНК, как правило, по одному на каждую цепь. Следующая стадия – удлинение новой цепочки ДНК посредством присоединения имеющихся в реакционной смеси коротких нуклеотидов по принципу комплементарности. Удлинение начинается от праймеров и катализируется ферментом ДНК-полимеразой при оптимуме температуры 72°С. ДНК-полимераза, используемая в современных методиках – Tag-полимераза, выделенная из термостабильной бактерии Termus aquaticus, живущей в горячих источниках, высоко стабильна и сохраняет активность до конца процесса амплификации. Ранние версии ПЦР требовали добавления новых порций нетермостабильных ДНК-полимераз после этапа денатурации ДНК. Tag-полимераза вводится в реакционную смесь однократно. Проведение этапов отжига и удлинения при высоких температурах значительно снижает риск неспецифической амплификации. Полимеразная цепная реакция протекает автоматически в программируемом термостате – термоциклере (амплификаторе). Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной ДНК, повторяется до 30 раз в соответствии с заданной программой термоциклера. С каждым новым циклом число молекул матричной ДНК удваивается, по завершении процесса количество копий нарастает в геометрической прогрессии. Так, если один цикл продолжается менее 3 минут, то менее чем через 2 часа можно получить около миллиарда копий определяемой последовательности ДНК. Во время первого цикла удлинение новой цепочки от праймера заканчивается произвольно (рис.10.5). 430 Рис. 10.5.Схематическое изображение первого цикла ПЦР: 1 — денатурация при 96 °С; 2 — отжиг при 68 °С; 3 — элонгация при 72 °С (Р — полимераза); 4 — завершение первого цикла. В большинстве случаев проводимой в научных лабораториях ПЦР, а также в коммерческих отечественных наборах реактивов в качестве метода детекции ранее использовался электрофорез, с помощью которого производилось разделение амплифицированного материала по размеру ампликонов. Другие методы детекции основаны на идентификации меченых компонентов реакции. Так, в тест-системах фирмы "Хоффманн-Ла Рош", являющейся мировым лидером применения метода ПЦР в медицине, используются праймеры, меченные биотином, соответственно меченным оказывается и продукт реакции амплификации ампликон. На стадии детекции 431 биотин прочно связывается с авидином, входящим в состав конъюгата с ферментом пероксидазой хрена. Далее так же, как при иммуноферментном анализе, добавляется хромоген ТМБ и субстрат перекись водорода для проведения ферментативной реакции, протекающей с изменением окраски раствора. Реакцию останавливают добавлением серной кислоты. Интенсивность окраски измеряют на плашечном фотометре при 430 нм. Развитие окраски, имеющее место только при образовании ампликон-биотин- авидин-ферментного комплекса, прямо свидетельствует о том, что фрагмент матричной ДНК был амплифицирован посредством ПЦР, и соответственно вирус или другой выявляемый агент присутствует в исходном материале. |