Практикум Люта. В. Л. Люта о. В. Кононов в а. Люта о. В. Кононов

• Название: В. Л. Люта о. В. Кононов в а. Люта о. В. Кононов
• Дата: 06.09.2018
• Размер: 1.23 Mb.
• Имя файла: Практикум Люта.doc
• Тип: Документы; #49945
• страница: 5 из 14

4. Проведспия дезінфекції піпеток, робочого місця, патологічного матеріалу, рук

Завдання 4. Ознайомтеся з технікою проведення дезін­фекції піпеток, інфікованого матеріалу, робочого місця.

Градуйовані, пастерівські піпетки, шпателі, металеві ін­струменти відразу після використання опускають у посудину з дезінфекційним розчином, яка стоїть на кожному робочому місці.

Відпрацьований патологічний матеріал (кал, сеча, мокро­тиння, кров, спинномозкова рідина) обробляють сухими дезін­фекційними засобами або їх розчинами. Патологічний матеріал (гній, сеча, кров, мокротиння тощо), посуд, меблі та примі­щення знезаражують бактерицидними дезінфекційними засо­бами. Ці засоби застосовують у комбінації з детергентами та дісю високої температури. Вибір дезінфекційного засобу, його концентрація, експозиція (термін дії) залежать від біологічних властивостей мікроорганізмів і властивостей патологічного ма­теріалу, в якому містяться ці мікроби. Так, для знезараження мокротиння хворого на туберкульоз застосовують 2,5 % розчин дезактину (експозиція — 360 хв), а випорожнень хворого на ди­зентерію — 0,5 % розчин дезактину (експозиція — 60 хв). Або засипають сухим хлорним вапном із розрахунку 200 г дезін­фекційного засобу на 1 кг виділень, перемішують і витримують 1 год. Посуд опускають в 1 % розчин хлораміну на 30 хв або 1 % розчин МсдіДес чи Тетраліну на 60 хв.

Робоче місце після закінчення роботи протирають ганчір­кою, змоченою дезінфекційним розчином (0,2 % розчиноМ Сеп-таміну, 0,75 % розчином МедіДес чи Тетраліну).
Завдання 5. Проведіть дезінфекцію рук.

Алгоритм "Дезінфекція рук":

• 
  зробіть із вати дві кульки діаметром 1—2 см;
  
• 
  візьміть пінцетом одну кульку, змочіть її у розчині дезін­фектанту;
  
• 
  протріть нею руки в такій послідовності: ліва рука — тильна сторона, долонна сторона, між пальцями, нігтьо­ва пластинка, під нігтями; нрава рука — у такій самій по­слідовності;
  
• 
  кульку опустіть у посудину з дезінфекційним розчином;
  
• 
  візьміть пінцетом другу кульку і все повторіть;
  
• 
  вимийте руки водою з милом;
  
• 
  висушіть руки, змастіть їх кремом для рук.
  

Контрольні запитання

1. 
   Що таке асептика й антисептика?
   
2. 
   Що таке дезінфекція? Які є її види?
   
3. 
   Які дезінфекційні засоби можуть бути використані в Україні?
   
4. 
   Від чого залежить вибір дезінфекційного засобу і термін проведення дезінфекції?
   

1. 
   Як дезінфекційні засоби виливають на макроорганізм? Як з ними слід поводитися?
   
2. 
   Що таке стерилізація? Які існують види стерилізації?
   
3. 
   Які апарати використовують для стерилізації?
   
4. 
   Які умови стерилізації в паровому стерилізаторі, сухо-жаровій шафі, інактиваторі, в апараті для зсідання й інактивації сироватки?
   
5. 
   Як контролюють режим роботи стерилізаторів?
   

10. 
    Як проводять перевірку якості стерилізації?
    
11. 
    В якому разі і як проводять механічну стерилізацію?
    
12. 
    Як проводять дезінфекцію піпеток, патологічного мате­ріалу, робочого місця, рук?
    

Тести

1. Дія дезінфекційних засобів на мікроорганізми залежить
від:

а) природи дезінфекційних засобів;

б) концентрації та температури їх розчинів;

в) тривалості дії;

г) усі відповіді правильні.

2. Для стерилізації бактеріологічних петель використовують:

а) фламбування;

б) сухожаровий метод;

в) тиндалізацію;

г) гласперленову стерилізацію.

3. Медичні вироби з гуми, полімерів, скла стерилізують:

а) 1 % розчином дезоксону-1;

б) хлороформом;

в) ефіром;

г) толуолом.

4. Неповним є метод стерилізації:

а) сухим жаром;

б) автоклавуванням;

в) ультрафіолетовим випромінюванням;

г) кип'ятінням.

5. Медичні вироби одноразового використання (шприці) сте-
рилізують:

а) ультрафіолетовими випромінюванням;

б) радіаційним випромінюванням;

в) водяною парою;

г) сухим жаром.

Ситуаційні задачі

1. 
   У сухожарову шафу помістили металічні інструменти, вату, піпетки, флакони з ізотонічним розчином натрію хлори­ду, гумові рукавички і простерилізували за температури 180 °С протягом 60 хв. Дайте оцінку цим діям.
   
2. 
   Під час бактеріологічного дослідження вовни був виді­лений збудник сибірки. Після ідентифікації збудника лабора­торний посуд, який був при цьому задіяний, і культуру збудни­ка простерилізували в паровому стерилізаторі за температури 120 °С протягом 30 хв. Дайте оцінку цим діям.
   
3. 
   У корови, хворої на туберкульоз, мікобактерії виділяють­ся з молоком. Чи молена пити молоко хворої тварини після пас­теризації?
   
4. 
   Металеві хірургічні інструменти прокип'ятили у дисти­льованій воді протягом ЗО хв. Чи можна їх вважати стерильни­ми?
   

Домашнє завдання

Підготуйтеся до практичного заняття 5.

Рекомендації щодо самопідготовки до практичного заняття 5

1. 
   Ознайомтеся з темою і метою практичного заняття, запи­шіть у щоденнику тему і план заняття.
   
2. 
   Вивчіть теоретичний матеріал (див. підручник, с. 136— 164; практикум, с. 67—78).
   

Практичне заняття 5 СЕРОЛОГІЧНИЙ МЕТОД ДОСЛІДЖЕННЯ

Мета заняття:

• 
  навчитися пояснювати роль антигенів як індукторів імунної відповіді;
  

• 
  навчитися пояснювати роль антитіл в імунній відповіді;
  
• 
  розуміти суть серологічного методу досліджений;
  
• 
  мати поняття про діагностичні препарати;
  
• 
  уміти проводити реакцію аглютинації.
  

Оснащення: адсорбована аглютинуюча полівалентна еше-рихіозна сироватка ОКЛ в ампулах і розчинена та розлита у стерильні пробірки, в які вмонтовані настерівські піпетки, сте­рильний ізотонічний розчин натрію хлориду (у пробірках), сте­рильні піпетки об'ємом 1—2 см³, гумова груша, чиста культура Е. coli на скошеному МПА, предметні стекла, бактеріологічні петлі, пінцети, спиртівка, сірники, маркери, дезінфекційпий розчин, спирт, вата, заздалегідь поставлена розгорнута реакція аглютинації, бланк направлення.

План

1. 
   Серологічні реакції, їх застосування.
   
2. 
   Проведення орієнтовної реакції аглютинації на склі. Об­лік та оцінювання її результатів.
   
3. 
   Проведення розгорнутої реакції аглютинації. Облік та оцінювання її результатів.
   

Хід заняття 1. Серологічні реакції, їх застосування

Завдання 1. Ознайомтеся з умовами проведення сероло­гічних реакцій та їх застосуванням.

І Серологічні реакції ґрунтуються на взаємодії антигену зі специфічним антитілом. Оскільки ці реакції високосиецифіч-ні, чутливі і можуть відбуватися in vitro, їх широко використо­вують у лабораторній практиці.

( За допомогою серологічних реакцій можна вирішити дві проблеми:

1. 
   визначити невідоме антитіло або невідомий антиген у си­роватці крові хворого — серологічна діагностика;
   
2. 
   визначити рід, вид, тип збудника, виділеного із патоло­гічного матеріалу хворого, — серологічна ідентифікація культури мікроорганізмів. )
   

Проведення серологічних реакцій потребує підготовки по­суду, інструментів, апаратури й окремих інгредієнтів (від лат. Ingrediens— той, що входить), тобто окремих компонентів реакції: антитіла, антигену і неспецифічних компонентів.

Для постановки серологічних реакцій використовують чистий, сухий скляний посуд: аглютииаційні, преципітаційні, центрифужні пробірки, піпетки градуйовані (або піпеточний дозатор) і пастерівські, чашки Петрі, предметні стекла. Скло має бути прозорим, без плям і подряпин. Для проведення серологічної реакції у пробірках слід підібрати їх так, щоб вони були однаковими за висотою і діаметром, мали однакову конфігурацію дна, однаковий колір скла.

Замість пробірок часто використовують полістиролові планшети багаторазового й одноразового використання. На планшеті є лунки, однакові за розміром і конфігурацією дна. їх використовують для постановки реакцій гемаглютинації, мікропреципітації, ІФА.

Використовують такі інструменти й апаратуру: бактеріологічну петлю, пінцет, штативи з гніздами, що відповідають діаметру пробірок, лупу, аглютиноскоп, термостат, холодильник, центрифугу на 2000—3000 об/хв.

Специфічними компонентами серологічних реакцій є імунна діагностична сироватка (відоме антитіло) і діагностикум (відомий антиген).

• Імунними діагностичними називають сироватки, що міс­тять відомі специфічні антитіла. їх виготовляють із крові тварин (кроликів, коней, ослів, овець), яких попередньо іму­нізують (заражають) відповідним антигеном (мікробами чи токсином) за певною схемою. Після накопичення антитіл (при­близно через 2 тиж після останнього введення антигену) беруть кров і виробляють із неї сироватку. В отриманій сироватці ви­значають активність (титр). Титр — це найбільше розведення, в якому сироватка спричинює видиму реакцію з відповідним антигеном в умовах досліду. Сироватки розливають в ампули, частіше їх ліофілізують, потім запаюють. На ампулі зазнача­ють назву сироватки, її об'єм і титр. Перед використанням їх розчиняють у дистильованій воді або ізотонічному розчині на­трію хлориду (як зазначено в інструкції). Зберігають сироватки у холодильнику за температури від 4 до 10 °С.

Імунні діагностичні сироватки бувають нативні (неад-сорбовапі) й адсорбовані.

• Неадсорбовані сироватки містять природні антитіла, які накопичилися в крові упродовж життя тварини, групові антитіла, які здатні взаємодіяти з бактеріями, що мають однакові антигени (бактерії одного роду, родини), — це неспецифічні антитіла та специфічні антитіла, які здатні взаємодіяти з бактеріями, що були використані для імунізації тварин.

Імунна діагностична сироватка містить набагато більше специфічних антитіл, ніж неспецифічних. Після розведення неадсорбованих сироваток концентрація неспецифічних антитіл стає настільки малою, що вони не здатні спричинити видиму реакцію з антигеном, а концентрація специфічних антитіл хоч і зменшується, але залишається достатньою, щоб зумовити видиму реакцію з антигеном. Тому під час проведення серологічної реакції неадсорбовані сироватки обов'язково розводять до титру, вказаного на етикетці.

'Адсорбовані імунні діагностичні сироватки високоспеци-фічні. Неспецифічні антив-іла з них видаляють методом ад­сорбції.

Адсорбовані сироватки можуть бути монорецепториими (містять антитіла до одного антигену) і полівалентними(містять антитіла до 2 антигенів і більше). Титр антитіл в адсорбованих сироватках невисокий (від 1:20 до 1:320), тому їх не розводять. Адсорбовані сироватки використовують для проведення реакції аглютинації на склі з метою вивчення антигенної структури бактерій, тобто для серологічної ідентифікації культури. І • Ампули з ліофілізованими сироватками вміщують у короб­ки, в кожну коробку кладуть інструкцію щодо використання сироватки.

На коробці зазначають назву сироватки, її призначення, кількість ампул, об'єм в 1 ампулі, серію, термін придатності, умови зберігання, адресу підприємства-виробника, крім того, для неадсорбованих сироваток зазначають титр.

В інструкції зазначають: назву сироватки, її призначення, спосіб застосування, схему проведення серологічної реакції і врахування її результатів, термін придатності сироватки, умови зберігання і транспортування, адресу підприємства, що виготовило препарат.

На ампулі зазначають: назву сироватки, об'єм, серію, конт­рольний номер, дату придатності, на ампулах з неадсорбовани-ми сироватками — титр.

Перед використанням звертають увагу на термін при­датності, цілість ампули, чіткість підписів на ампулі, відпо­відність підпису на ампулі, інструкції й на коробці, фізичні властивості препарату (відповідність зовнішнього вигляду до зазначеного в інструкції) і розчиняють в об'ємі ізотонічного розчину натрію хлориду, який зазначено на етикетці.

2. Проведення орієнтовної реакції аглютинації па склі. Облік та оцінка її результатів

Аглютинація (від лат. agglu.Una.Uo— приклеювання) — це склеювання і випадання в осад клітин (у мікробіології — бакте­ріальних клітин) після їх взаємодії зі специфічними антитіла­ми. Тому результатом реакції аглютинації є утворення пластів­ців унаслідок склеювання бактеріальних клітин. Осад в реакції аглютинації називається аглютинатом.

Орієнтовна реакція аглютинації на склі частіше використо­вується для визначення антигенної структури мікроорганізмів, але інколи і для прискореної серологічної діагностики (реакція Хеддльсона для діагностики бруцельозу).

Завдання 2. Проведіть орієнтовну реакцію аглютинації на склі та облік її результатів з метою ідентифікації куль­тури бактерій.

Проведення реакції аглютинації (РА) на склі з метою серо­логічної ідентифікації культури є завершальним етапом іден­тифікації багатьох мікробних культур після попереднього їх вивчення за культуральними, морфологічними, тинкторіаль-ними і ферментативними властивостями. Для постановки цієї реакції використовують інгредієнти: специфічну аглютинуючу адсорбовану сироватку (відоме антитіло), підготовлену згідно з інструкцією, ізотонічний розчин натрію хлориду і невідому, але підозрілу культуру (невідомий антиген).

Алгоритм "Проведення та облік результатів орієнтов­ної Р А":

• 
  знежирте предметне скло, нанесіть маркером три кола діаметром близько 1 см на однаковій відстані одне від од­ного, скло переверніть;
  
• 
  підпишіть: під І колом — Д (дослід), під II — КС (конт­роль сироватки), під III — КА (контроль антигену), за­значте номер аналізу;
  
• 
  зафламбуйте предметне скло, покладіть його у кришку чашки Петрі;
  
• 
  нанесіть пастерівською піпеткою на кола Д і КС по 1 кра­плі аглютинуючої сироватки, на коло КА — 1 краплю ізо­тонічного розчину натрію хлориду;
  
• 
  розітріть і змішайте бактеріологічною петлею досліджу­вану культуру з краплею ізотонічного розчину натрію хлориду (КА);
  

• 
  змішайте досліджувану культуру з краплею сироватки (Д);
  
• 
  оцініть результати через 1—3 хв;
  

Увага! Оцінювання результату починають з оцінювання контролів: КА — рівномірне помутніння, КС — крапля про­зора. У разі появи пластівців у колі Д на фоні прозорої рідини реакція позитивна (антиген відповідає антитілу), а в разі рів­номірного помутніння — реакція негативна (антиген не відпо­відає антитілу). Іноді результат оцінюють за допомогою лупи або мікроскопа (реакція мікроаглютинації).
— помістіть предметне скло в дезінфекційний розчин.

3. Проведення розгорнутої реакції аглютинації. Облік та оцінювання її результатів

Завдання 3. Ознайомтеся з технікою проведення та об­ліком результатів розгорнутої реакції аглютинації.

Розгорнуту реакцію аглютинації здебільшого використову­ють для серологічної діагностики інфекційних хвороб: для діа­гностики черевного тифу — реакцію Відаля, для діагностики бруцельозу — реакцію Райта й інші, визначення титру імунної аглютинуючої сироватки, а також для серологічної ідентифіка­ції культури бактерій (Е. coli, бруцел).

Для проведення розгорнутої реакції аглютинації з метою серологічної діагностики використовують такі інгредієнти: си­роватку крові хворого (невідоме антитіло), діагностикум (відо­мий антиген) та ізотонічний розчин натрію хлориду.

Для серологічного дослідження у хворого беруть кров на 5—7-й день від початку захворювання, коли в ній накопичить­ся достатня кількість антитіл; у реконвалесцента — з метою ретроспективного діагнозу; у здорової людини — з метою вияв­лення латентної інфекції або бактеріоносійства.

Кров слід брати натще або не раніше ніж через 6 год після споживання їжі, оскільки в ній можуть накопичуватися краплі жиру, що робить сироватку каламутною (хільозна сироватка) та непридатною для дослідження. Найчастіше кров забирають із ліктьової вени або з пучки IV пальця, можна брати із мочки вуха, у дітей грудного віку — із п'ятки.

Забір крові потрібно проводити в асептичних умовах та з до­триманням правил техніки безпеки.

На суху чисту стерильну пробірку наклеюють етикетку, в якій зазначають: номер і назву матеріалу, заклад (відділення), або місце, де був взятий матеріал, прізвище, ім'я та по батькові хворого, дату і час взяття матеріалу. Окремо заповнюють бланк направлення встановленого зразка, в якому зазначають: номер і назву матеріалу, заклад (відділення) або місце, де був взятий матеріал, кратність направлення матеріалу (первинно чи по­вторно), прізвище, ім'я та по батькові хворого, його вік, дату захворювання, попередній діагноз, мету дослідження, дату і час взяття матеріалу, прізвище та посаду особи, яка направляє матеріал на мікробіологічне дослідження.

Потім одягають маску і гумові рукавички, ретельно обро­бляють ділянку шкіри на ліктьовому згині послідовно двома ватними тампонами, змочепими 70 % етиловим спиртом. Кров беруть стерильпим шприцом в об'ємі 3—5 см³. Для запобігання гемолізу голку знімають зі шприца, а кров обережно вилива­ють через канюлю у стерильну пробірку так, щоб вона стікала по стінці пробірки. Пробірку закривають гумовою пробкою. Краще збирати кров у спеціальну пробірку типу "Епендорф". Потім кров доставляють до лабораторії не пізніше 2—3 год у спеціальних контейнерах або біксах, на дно яких кладуть сер­ветку з адсорбівного матеріалу. Направлення на дослідження упаковують окремо.

Забороняється обертати направлення навколо посудини з об'єктом дослідження та вкладати його в контейнер або бікс!

Для отримання сироватки кров вміщують у термостат за температури 37 °С на ЗО хв (довше залишати не можна, оскіль­ки відбудеться гемоліз). Утворений згусток відокремлюють від стінок пробірки стерильною запаяною пастерівською піпеткою або скляною паличкою і ставлять у холодильник за температу­ри 4—10 °С на 1—2 год, а для кращого відстоювання — на 18— 20 год. Можна відділяти сироватку центрифугуванням.

Сироватку можна зберігати над згустком не довше ніж 48 год (пізніше настає гемоліз). Якщо сироватка буде викорис­тана пізніше ніж через 48 год, її відсмоктують стерильною пі­петкою з гумовою грушею і переносять у стерильну пробірку. Чиста стерильна сироватка зберігається у холодильнику до 1 міс. Головна вимога до сироватки — її прозорість.

Для постановки розгорнутої реакції аглютинації з метою се­рологічної діагностики використовують здебільшого стандарт­ні антигени, які виробляють у науково-дослідних закладах. Вони містять інактивовані мікроорганізми або їх антигени. Ці антигени називають діагностикумами (від грец. йіадпояШгоз — здатний розпізнавати). Діаностикуми для реакції аглютинації випускають у рідкому або ліофілізованому стані в ампулах або флаконах.

Перед використанням діагностикум перевіряють на придат­ність. Звертають увагу на цілість посудини, чіткість надпису на ампулі чи флаконі, відповідність його надпису, зазначеному в інструкції та на коробці, відповідність зовнішнього вигляду до зазначеного в інструкції, термін придатності.

Перед використанням рідкий діагностикум збовтують, ліо-філізований — розчиняють. Він повинен бути рівномірно кала­мутним, не утворювати пластівців.

Розгорнуту реакцію аглютинації з метою серологічної діа­гностики проводять здебільшого для виявлення антитіл у си­роватці крові хворого. Оскільки використовують нативну си­роватку, перед постановкою реакції її розводять. Розведення сироватки називається титруванням.

Алгоритм "Проведення розгорнутої реакції аглютинації": — підберіть 7 аглютинаційних пробірок однакового розмі­ру, кольору скла, однакової конфігурації дпа і 1 пробірку для робочого розведення;

• 
  візьміть стерильні градуйовані піпетки об'ємом 5 см³ і 1 см³; 1 пастерівську піпетку;
  
• 
  поставте у штатив 3 стерильні пробірки і позначте, для яких піпеток вони призначені;
  
• 
  розгорніть стерильні піпетки і поставте у відповідні про­бірки;
  

Увага! Піпетки мають зберігатися до кінця досліду!

• 
  підпишіть пробірки: І — номер, вид антигену, 1:50; II — 1:100; III — 1:200; IV — 1:400; V — 1:800; VI — КС (контроль сироватки); VII — КА (контроль антигену); окрему пробірку позначте літерами Рр (робоче розведен­ня);
  
• 
  внесіть у пробірку, позначену Рр, піпеткою об'ємом 5 см³ 4,9 см³ ізотонічного розчину натрію хлориду, у дослідні (крім першої і КС) — по 1 см³;
  
• 
  внесіть піпеткою об'ємом 1 см³ 0,1 см³ досліджуваної си­роватки в пробірку, позначену Рр, перемішайте (розве­дення 1:50);
  
• 
  внесіть по 1 см³ розведеної (1:50) сироватки у пробірки першу, другу і КС;
  
• 
  перемішайте та перенесіть 1 см³ сироватки з другої про­бірки у третю, 1 см³ із третьої у четверту, 1 см³ із четвер­тої у п'яту, 1 см³ із п'ятої у дезінфекційний розчин;
  
• 
  додайте пастерівською піпеткою у кожну пробірку (крім КС) по 2 краплі діагностикуму;
  

Увага! Діагностикум додається у кожну пробірку обов'язково в однаковій кількості!

• 
  струсіть пробірки та поставте їх у термостат (37 С);
  
• 
  вийміть пробірки з термостата через 2 год;
  
• 
  проведіть попередній облік результатів, поставте пробір­ки в штатив і залиште їх за кімнатної температури;
  
• 
  проведіть остаточний облік результату реакції через 18— 20 год.
  

Облік результату розгорнутої реакції аглютинації почина­ють з контролю: КС — рідина прозора, КА — рівномірне помут­ніііня або осад у вигляді ґудзика, а під час збовтування утворю­ється рівномірне помутніння (реакція негативна).

Потім оглядають дослідні пробірки, порівнюючи пробір­ки першу і другу, другу і третю, третю і четверту, четверту і п'яту.

Увага! У разі позитивної реакції утворюється осад, що по­криває все дно пробірки у вигляді перевернутої парасольки, під час збовтування видно пластівці.

Реакція різко позитивна (++++) — осад у вигляді перевер­нутої парасольки на все дно, рідина прозора.

Реакція позитивна (+++) — розмір осаду менший, відсутнє повне просвітління рідини.

Реакція слабопозитивна (++) — розмір осаду ще менший, рідина каламутна.

Сумнівний результат реакції (+) — незначний осад, рідина каламутна.

Реакція негативна — осаду немає або осад у вигляді ґудзи­ка, рідина рівномірно каламутна.

Позитивним вважають результат з оцінкою осаду (++++) або (+++).

Останнє розведення, в якому реакція аглютинації має по­зитивне значення, називається титром сироватки, його зазна­чають у відповіді.

Здебільшого діагностичним вважають титр сироватки 1:100. Але ніколи не обмежуються одноразовим проведенням реакції аглютинації. Зазвичай її повторюють через 1—2 тиж. За наяв­ності захворювання кількість антитіл (титр сироватки) у крові зростає, тому під час повторного проведення реакції аглюти­нації спостерігається наростання титру антитіл у сироватці у 2—4 рази. Це дає змогу відрізнити хворого від тієї людини, яка перехворіла або якій було зроблено щеплення. В останніх двох випадках зростання титру антитіл у сироватці крові не спосте­рігається.