Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения

• Название: Виды микроскопии назначение и принципы применения
• Анкор: Общая микробиология.doc
• Дата: 12.12.2017
• Размер: 1.57 Mb.
• Имя файла: Общая микробиология.doc
• Тип: Литература; #11046
• страница: 40 из 40

Задания к лабораторному занятию

1. 
   Приготовление убитой стафилококковой аутовакцины (имитационная постановка).
   

Убитую аутовакцину готовят из штамма возбудителя, выделенного непосредственно от больного. Этапы приготовления:

• 
  Посев стаффилококка в пробирку со скошенным питательным агаром.
  
• 
  Проверка чистоты выросшей культуры – приготовьте мазок со скошенного МПА, окрасьте по Граму, промикроскопируйте.
  
• 
  Получение маточной взвеси микробных клеток – смойте культуру 5 мл изотонического раствора хлорида натрия.
  
• 
  Прогревание бактериальной взвеси на водяной бане: температура прогревания 80ºС, время прогревания 30 минут.
  
• 
  Контроль на стерильность – высейте на МПА каплю прогретой взвеси бактерий.
  
• 
  Стандартизация вакцины по оптическому стандарту: 1 мл прогретой микробной взвеси разведите стерильным изотоническим раствором хлорида натрия, сравнивая ее мутность с мутностью оптического стандарта №10 (1млрд. микробных тел в 1 мл), остальной объем взвеси бактерий разведите, добавляя соответствующее количество изотонического раствора хлорида натрия.
  
• 
  Упаковка вакцины – разлейте вакцину в ампулы по 1 мл и запаяйте их в пламени газовой горелки.
  
• 
  Этикетировка вакцины – оформите этикетку вакцины:
  

Министерство здравоохранения Украины

Национальная фармацевтическая академия Украины

Кафедра микробиологии

Стафилококковая вакцина (убитая)

1 мл содержит 1 млрд микробных тел

Дата изготовления……………….

Изготовитель…………………….

Хранить при температуре 2-10ºС

2. 
   Титрование дифтерийной антитоксической сыворотки методом флоккуляции по Рамону.
   

В результате взаимодействия токсина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная и ранняя («инициальная») флоккуляция происходит в пробирке, где антиген и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях. Реакцию ставят в два этапа:

1 – по стандартной сыворотке устанавливают количество Lf (Limes flocculation) в 1 мл токсина. Lf токсина определяется его количеством, которое дает «инициальную» флоккуляцию с международной единицей (МЕ) сыворотки. Установив силу токсина, приступают к определению силы сыворотки.

2 – в ряд пробирок наливают по 2 мл известной силы токсина и испытуемую антитоксическую сыворотку в количестве 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 мл. Пробирки выдерживают в водяной бане при температуре 45ºС в течение 30 минут до проявления «инициальной» флоккуляции (опалесценция, переходящая в помутнение). «Инициальная» флоккуляция проявляется в той пробирке, где количество токсина соответствует количеству международных единиц сыворотки.

Ингредиенты	№ пробирки
	1	2	3	4
Антитоксическая сыворотка, мл	0,1	0,2	0,3	0,4
Токсин, мл	2,0	2,0	2,0	2,0
Результаты

3. 
   Получение антителообразующих гибридом методом слияния В-лимфоцитов селезенки и миеломных клеток мышей.
   

После иммунизации мышей антигеном антитела вырабатываются главным образом В-лимфоцитами селезенки. В-лимфоциты не могут длительно культивироваться in vitro и после нескольких делений гибнут. Клетки же лимфоидных опухолей костного мозга (плазмоцитом или миелом) обладают способностью бесконечно культивироваться in vitro.

Для того, чтобы получить антителопродуцирующие клетки, синтезирующие моноклональные антитела известной специфичности (к определенному антигену), проводят гибридизацию В-лимфоцитов, выделенных от иммунизированных антигеном животных, и миеломных клеток. Полученные антителопродуцирующие клетки называются гибридомами. Этапы получения антителообразующих гибридом:

1. Иммунизация мышей антигеном.

Мышам многократно, по определенной схеме, вводят антиген внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно. Для иммунизации подходят любые схемы введения антигена, которые стимулируют формирование гуморального иммунного ответа, опосредованного В-лимфоцитами селезенки. Клетки селезенки получают, как правило, на 4 день после последней инъекции антигена.

2. 
   Получение клеток селезенки мышей
   

а) Убейте мышь цервикальной дислокацией или усыпите в сосуде (15 мин с эфиром при закрытой крышке).

б) Закрепите мышь на парафиновой панели, вcкройте брюшную полость, извлеките пинцетом селезенку (с соблюдением правил асептики) и поместите в гомогенизатор, в который предварительно внесите 5 мл среды для слияния клеток (содержит аминокислоты, витамины, углеводы, неорганические соли).

в) Получите суспензию клеток селезенки, растирая ее пестиком о стенки гомогенизатора. Из каждой селезенки обычно получают 510⁷ клеток.

г) Отберите стерильной пипеткой 1 каплю взвеси клеток из гомогенизатора, приготовьте препарат «раздавленная капля» и промикроскопируйте клетки.

д) Перенесите полученную суспензию клеток селезенки в стерильные центрифужные пробирки и отмойте их при центрифугировании. Для этого клетки осадите в течение 5 мин при 1500 об/мин, слейте надосадочную жидкость в колбу-приемник, ресуспендируйте осадок в 1 мл среды для слияния.

3. 
   Гибридизация и культивирование гибридом
   

а) Внесите к 1 мл полученной суспензии клеток селезенки равный объем взвеси миеломных клеток (концентрация 10 клеток/мл), тщательно перемешайте и осадите клетки центрифугированием в течение 5 мин при 1500 об/мин.

б) Надосадочную жидкость слейте в колбу-приемник, осадок клеток ресуспендируйте в 1-2 каплях среды для слияния, добавьте по каплям 1 мл полиэтиленгликоля (ПЭГ) и 4 мл среды того же состава, добиваясь равномерного распределения клеток во всем объеме.

в) Осадите клетки при центрифугировании указанным выше способом и слейте надосадочную жидкость в колбу-приемник.

г) Осадок аккуратно ресуспендируйте в 10 мл селективной среды, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ), которая способствует выживанию только гибридных клеток.

д) Отберите из суспензии пробы по 0,2 мл и внесите в лунки микропланшет. Культуры клеток инкубируют в атмосфере СО₂ при 37ºС в течение 15-18 суток. Начиная с 4 дня, необходимо менять питательную среду в лунках. Быстрорастущие клоны в виде плотных колоний клеток становятся различимыми на 5-6 день. Контроль за образованием клонов осуществляют с помощью инвертированного микроскопа. По окончании культивирования проверяют антителообразующую способность клонов иммуноферментным анализом (ИФА).

4. 
   Оформите протокол занятия.