Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения
 Скачать 1.57 Mb.
|
Реакция нейтрализацииВ основе этой реакции лежит способность специфических антител нейтрализовать токсическое действие антигена. Роль антигена может выполнять микробный экзотоксин. В этом случае обезвреживание токсина в ходе физико-химической реакции нейтрализации происходит за счет связывания его свободных аминогрупп, что приводит к потере токсичности. Для проведения реакции исследуемый материал, в котором предполагается наличие экзотоксина, смешивают с антитоксической сывороткой, выдерживают в термостате и вводят животным (морским свинкам, мышам). Контрольным животным вводят фильтрат исследуемого материала, не обработанный сывороткой. В том случае, если произойдет нейтрализация экзотоксина антитоксической сывороткой, животные опытной группы останутся живыми. Контрольные животные погибнут в результате действия экзотоксина. Если антиген – вирусный материал, антитела нейтрализуют инфекционное и цитопатическое действие вирусов в чувствительных к вирусу живых системах. Реакция нейтрализации инфекционного и цитопатического действия вирусов воспроизводится в чувствительных к вирусу живых системах. Из материала, содержащего вирус, готовят серийные разведения и добавляют к ним специфическую сыворотку в разведении в соответствии с титром, указанным в инструкции. Смесь инкубируют 30-60 минут при температуре 37С, после чего заражают ею культуру ткани, куриные эмбрионы или лабораторных животных. Контролем служит чувствительная система, зараженная вирусом обработанным нормальной сывороткой. Положительной считают РН при отсутствии ЦПД в культуре клеток, изменений в куриных эмбрионах, а также заболнвания или гибели животных. На основании результатов РН определяют индекс нейтрализации – отношение титра вируса в контроле к титру вируса в опыте. Если индекс нейтрализации менее 10 – реакция отрицательная, от 11 до 49 – сомнительная, от 50 и выше – положительная (достоверное соответствие вируса антисыворотке). Наиболее чувствительным вариантом РН является подавление вирусного бляшкообразования под действием вирусспецифической антисыворотки (реакция редукции вирусных бляшек). РН позволяет определить видовую и типовую принадлежность вируса. Феномен иммуноклеточного прилипанияМетод, разработанный Г.Дж.В.Носселом с соавторами (1961), основан на способности бактерий прилипать к поверхности малых лимфоцитов – клеток, вырабатывающих специфические антитела после иммунизации животных соответствующими микроорганизмами, и получил название иммуноклеточного прилипания или скучивания. Феномен иммуноклеточного прилипания был использован для дальнейшего совершенствования методов выявления клеток, образующих антитела к антигенам микробного происхождения. В частности, заслуживает внимание модификация метода с использованием в качестве антигена эритроцитов, нагруженных различными микробными гаптенами. Такие эритроциты приобретают способность специфически прикрепляться в опытах in vitro к поверхности изолированных лимфоидных клеток животного, иммунизированного тем микроорганизмом, из которого выделен гаптен. При этом под микроскопом удается наблюдать так называемые розетки, каждая из которых представляет собой лимфоидную антителопродуцирующую клетку, окруженную прочно приставшими к ней эритроцитами. Просмотрев в общей сложности 30004000 лимфоидных клеток в нескольких препаратах, определяют процент розеткообразующих клеток, адсорбировавших не менее двух эритроцитов, - процент адсорбции. Описанный метод был разработан Я.С.Шварцманом и А.В.Исполатовой (1966) и получил название непрямой гемадсорбции по аналогии с реакцией непрямой гемагглютинации. Реакция непрямой гемадсорбции по чувствительности не уступает реакции прилипания бактерий и превосходит ее по специфичности, особенно в тех случаях, когда изучают образование антител к антигенам неподвижных бактерий. Задания к лабораторному занятию.
Тема: Иммуномодулирующие препараты Цель: Знать принципы технологии, применения и хранения иммунных препаратов; освоить методы приготовления убитых аутовакцин, антителообразующих гибридом; уметь определять титр сыворотки по Рамону. Вопросы для самоподготовки
Литература
Общая характеристика, основы производства и применения бактерийных и вирусных препаратов. Бактерийные и вирусные препараты, применяемые в практике здравоохранения, в соответствии с целевым назначением и принципами изготовления можно разделить на следующие группы: вакцины, анатоксины, сыворотки, иммуноглобулины, моноклональные антитела, бактериофаги и аллергены. Общей характерной особенностью всех видов бактерийных и вирусных препаратов, используемых для профилактики, лечения и диагностики инфекционных заболеваний, является специфичность их действия, что отличает эти препараты от химиопрепаратов и антибиотиков. Вакцины. Большую группу составляют наиболее широко применяемые в практике профилактические препараты, предназначенные для создания активного иммунитета против определенных инфекционных заболеваний. В нее входят различного типа вакцинные препараты. В настоящее время в практике здравоохранения с целью профилактики инфекционных заболеваний применяют следующие вакцинные препараты: 1) вакцины живые, изготовляемые на основе использования живых ослабленных, апатогенных микроорганизмов – так называемых вакцинных штаммов; 2) вакцины убитые, получаемые путем инактивации различными методами патогенных возбудителей инфекционных заболеваний; 3) вакцины химические антигены, извлекаемые из микроорганизмов различными химическими методами; 4) анатоксины, получаемые путем обезвреживания формалином токсинов, являющихся продуктом метаболизма некоторых патогенных микроорганизмов; 5) вакцины искусственные – единая синтетическая макромолекула, в которой совмещены гаптенная или слабоантигенная детерминанта с синтетической полиэлектролитной структурой. Вакцинные, или аттенуированные, штаммы микроорганизмов получают различными методами. В некоторых случаях в качестве вакцинных штаммов, используют культуры, полученные путем отбора из числа выделяемых от больных людей и животных микроорганизмов, так называемых спонтанных мутантов, обладающих присущими вакцинным штаммам свойствами, В других случаях для получения вакцинных штаммов используют воздействие на патогенные культуры различных физических, химических и биологических факторов с последующим отбором из обработанной популяции апатогенных вариантов. Одним из главных требований, предъявляемых к вакцинным штаммам, является стойкая, наследственно закрепленная утрата ими патогенных свойств. Живые вакцины, полученные на основе аттенуированных вакцинных штаммов микроорганизмов, обладают рядом существенных преимуществ перед вакцинами других типов – убитыми и химическими. Главными их преимуществами являются высокая напряженность, прочность и длительность обусловливаемого ими иммунитета, приближающегося к постинфекционному. Важным достоинством живых вакцин является возможность для большинства из них однократного введения. Развитие «вакцинальной инфекции», сопровождающееся размножением вакцинного штамма в организме, образованием и поступлением в организм в течение достаточно длительного времени активных антигенных субстанций, полностью обеспечивает формирование напряженного иммунитета и исключает в большинстве случаев необходимость повторных инъекций, производимых при использовании вакцин других типов. Важным преимуществом живых вакцин перед другими видами является возможность применения не только путем подкожного введения, но и другими, более простыми путями (накожно через скарифицированную кожу, перорально, интраназально), более удобными при проведении в первую очередь массовой вакцинации. Живые вакцины наряду с отмеченными преимуществами имеют ряд недостатков, связанных с тем, что действующим началом этих препаратов являются живые микроорганизмы. Cтрогое соблюдение условий транспортировки, хранения и применения живых вакцин является одним из основных факторов, определяющих их эффективность в практике. Живые вакцины должны транспортироваться и храниться обязательно при температуре не выше 4-8°С. Отрицательные температуры при транспортировке и хранении не влияют на активность сухих препаратов. Совершенно недопустимо нарушение вакуума в ампулах с живыми вакцинами: попадание в ампулы воздуха и влаги приводит к инактивации препарата. Живые вакцины не содержат консервантов, поэтому при вскрытии ампул и растворении их содержимого необходимо строго соблюдать правила асептики. В то же время следует помнить, что совершенно недопустим контакт с живыми вакцинами любых дезинфицирующих средств, инактивирующих микроорганизмы, и воздействие высокой температуры на всех этапах подготовки препарата к применению. Учитывая особенности формирования иммунитета в ответ на введение живых вакцин, основанные на развитии «вакцинальной инфекции» очень важно в случаях применения живых бактерийных вакцин исключить за 1-2 дня до прививки и по меньшей мере на 1-й неделе после нее прием таких препаратов, как антибиотики, сульфаниламиды, иммуноглобулины, применение которых при вакцинации живыми бактерийными препаратами может резко уменьшить интенсивность «вакцинальной инфекции» и, следовательно, снизить эффект прививки. Живые вирусные вакцины можно применять одновременно с антибиотиками, так как на размножение вирусов в организме последние не влияют. Вакцины убитые в отличие от живых представляют собой препараты, приготовленные с использованием так называемых производственных штаммов возбудителей соответствующих инфекций, обладающих полноценными антигенными свойствами и высокой вирулентностью. При изготовлении убитых вакцин специально отобранные и проверенные производственные штаммы бактерий выращивают на искусственных питательных средах (плотных или жидких), а штаммы вирусов – в организме животных или культурах тканей. Получаемые после культивирования взвеси бактерий или вирусов подвергают инактивации различными физическими и химическими методами, основными требованиями к которым являются надежность инактивации и минимальное повреждающее действие на антигены бактерий и вирусов. В зависимости от вида микроорганизма применяют тот или иной метод инактивации, оптимальный для данного возбудителя. Полученные после инактивации взвеси микроорганизмов разводят до необходимой концентрации и затем разливают в ампулы или флаконы. Некоторые убитые вакцины готовят в сухом виде. Высушивание препаратов обеспечивает их большую стабильность, а также приводит к удалению из препаратов инактивирующих агентов (формалин, фенол) и тем самым снижает их реактогенность. Убитые вакцины более устойчивы при хранений, чем живые. Тем не менее, чтобы исключить возможность изменения их свойств, убитые вакцины необходимо хранить при низких температурах (2-10°С). Замораживание жидких убитых вакцин недопустимо, так как при последующем оттаивании могут измениться физические свойства препарата: в нем могут появляться хлопья, происходить разрушение и лизис микробных клеток. Это приведет к повышению реактогенности вакцины за счет выхода бактерийных антигенов в жидкую фазу препарата. Хранение и транспортировка сухих препаратов при отрицательных температурах допускаются, так как не представляют для них опасности. Эффективность убитых бактерийных и вирусных вакцин в целом ниже, чем живых. Основной способ их применения – подкожные инъекции, которые необходимо повторять из-за относительно короткого срока создаваемого убитыми вакцинами иммунитета. Так называемые химические вакцины представляют собой наиболее активные по иммунологическим свойствам спрецифические компоненты – антигены, извлекаемые из микробных клеток физико-химическими методами. Это сложные комплексы органических соединений – полисахаридов, полипептидов, липидов. Изготовление и применение химических вакцин основано на предпосылке, что выделенные из микробной клетки иммунологически активные субстанции, освобожденные от балластных, иммунологически неактивных веществ клетки, должны быть более эффективны и менее реактогенны по сравнению с так называемыми корпускулярными вакцинами, изготовленными путем инактивации цельных микробных клеток. Это позволяет вводить человеку большие дозы антигенов, что повышает иммунологический эффект, а также создает возможность применения ассоциированных препаратов, направленных одновременно против нескольких инфекций. Кроме того, извлеченные из микробной клетки антигены более стабильны и их легче стандартизировать, чем корпускулярные вакцины. Наряду с токсичностью, т. е. способностью вызывать патологические процессы в живом организме, токсины обладают весьма важным в практическом отношении свойством – антигенностью, т. е. способностью при введении в организм в небольших дозах вызывать образование специфических антител – антитоксинов. После добавления 0,3-0,4% формалина и выдерживания в течение нескольких дней при 37-40° Сº токсины полностью теряют токсичность, но сохраняют антигенные свойства. Полученные таким образом из токсинов препараты были названы Рамоном анатоксинами. В ряде стран такие препараты называют токсоидами. Анатоксины, предназначенные для иммунизации людей, готовят в виде очищенных, концентрированных препаратов, адсорбированных на гидрате окиси алюминия. Необходимость очистки и концентрации первоначально полученных, так называемых нативных анатоксинов связана с тем, что изготовленные на искусственных питательных средах препараты содержат большое количество балластных веществ питательной среды, не обладающих специфической активностью и способных при введении в организм вызывать различные местные и общие реакции. Для очистки от балластных веществ нативные анатоксины подвергают специальной обработке различными химическими и физическими методами, в результате чего препараты не только освобождаются от балластных веществ, но и концентрируются по объему, что позволяет вводить необходимую дозу препарата в значительно меньшем объеме, а также осуществлять одновременную иммунизацию несколькими препаратами. Иммуногенность анатоксинов, как и ряда других вакцин, зависит не только от качества антигена, т. е. специфической активности, степени чистоты и концентрации, но и от физико-химического состояния используемого для иммунизации препарата. Адсорбция препаратов на различных минеральных адсорбентах (гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия, фосфат кальция и др.) обусловливает резкое повышение эффективности вакцинации. Это объясняется прежде всего созданием в месте инъекции адсорбированного препарата депо антигена, а также замедленным его всасыванием: дробное поступление антигена из места инъекции обеспечивает эффект суммации антигенного раздражения (по принципу физиологического закона суммации раздражения), резко повышает иммунологический эффект. Помимо этого, депонирующее вещество вызывает в месте инъекции воспалительную реакцию, которая, с одной стороны, препятствуя всасыванию антигена, усиливает депонирующее действие антигена, а с другой, являясь неспецифическим стимулятором, усиливает плазмоцитарные реакции в лимфатических тканях организма, участвующих в иммуногенезе. Адсорбированные препараты перед употреблением необходимо взбалтывать, чтобы обеспечить равномерное распределение во всём объеме активного начала, которое перед взбалтыванием находится в осадке вместе с адсорбентом. Искусственная вакцина представляет собой соединение специфического естественного или синтетического антигена (гаптены, белки, полисахариды) с иммунопотенциатором. Получение исскуственных антигенов проводится в двух основных направлениях: первое – химический синтез антигенных молекул, копирующих полностью или частично природные белковые или полисахаридные антигены бактерий, вирусов и т.д.; второе – генно-инженерный синтез необходимых антигенов. При конструировании искусственных вакцин наиболее перспективными являются те антигены, против которых удается стимулировать иммунный ответ вопреки природной “неотвечаемости” организма, и те, которые являются наиболее общими для разновидностей данного возбудителя, поскольку они открывают возможность создания полиспецифических вакцин, эффективных сразу против нескольких серотипов данного возбудителя. Иммунопотенциаторы – это агенты разнообразной природы, неспецифически стимулирующие иммунный ответ к специфическим антигенам ( полисахариды бактериального и растительного происхождения; бактериальные гликопептиды; нуклеиновые кислоты; синтетические полипептиды, гликопептиды, полинуклеотиды; синтетические карбоцепные и гетероцепные полианионы и поликатионы). |