Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения
 Скачать 1.57 Mb.
|
Этапы создания искусственной вакциныНакопление биомассы данного микроорганизма Выделение высокоочищенного перспективного антигена белковой или полисахаридной природы Анализ первичной структуры молекулы антигена (прямой или через последовательность нуклеотидов, кодирующей нуклеиновые кислоты) Разработка искусственного синтеза данной антигенной молекулы или ее части, ответственной за антигенность Наработка искусственного антигена (создание технологии) Поиск молекул-носителей, способных стимулировать иммунитет Отработка технологии синтеза носителей данного типа Отработка технологии получения высокоиммуногенных искусственных комплексов носитель-антиген или носитель-несколько антигенов разных возбудителей или антиген-носитель-стимулятор Создание искусственной вакцины, испытание ее эффективности и безвредности На схеме представлены этапы получения искусственных вакцин на основе выделенных или синтезированных антигенов и их иммунопотенциаторов. В настоящее время разработаны и испытаны искусственные противосальмонелезные вакцины, вакцины против гриппа. Определены перспективы создания аллерговакцин и противораковых вакцин. Современные биотехнологические разработки предусматривают создание рекомбинантных вакцин и вакцин-антигенов. Вакцины обоих типов основаны на генноинженерном подходе. Для получения рекомбинантных вакцин обычно используют хорошо известный вирус коровьей оспы (осповакцины). В его ДНК встраивают чужеродные гены, кодирующие иммуногенные белки различных возбудителей (гемагглютинин вируса гриппа, гликопротеин D вируса герпеса, поверхностный антиген вируса гепатита В, антиген малярийного плазмодия). Получаются вакцины против соответствующих инфекций. К их достоинствам относится возможность создания поливалентных вакцинных препаратов на основе объединения участков ДНК различных патогенов «под эгидой» ДНК вируса осповакцины. Вакцины-антигены получают, клонируя гены возбудителя в E.coli, дрожжах, клетках насекомых и млекопитающих. Клонирован ген поверхностного антигена HBS-вируса гепатита В, ген белка оболочки VPI-вируса ящура. Вакцины-антигены высокостабильны при хранении и перевозке, сравнительно просты в изготовлении, содержат минимальное количество белка и поэтому малоопасны как аллергены. Они гарантированы от остаточной инфекционности. Проблемой является низкая иммуногенность, к повышению которой ведет добавление иммунопотенциаторов (метод, используемый при создании искусственных вакцин); иммобилизация вакцин на носителях; включение в липосомы. В случае использования липосомальных вакцин иммунный ответ усиливается вследствие того, что антигены, ассоциированные с липосомами попадают непосредственно в антигенпредставляющие клетки. На рис.? дается схема конструкции липосомальной вакцины против гепатита А. В липосому включают кроме антигена (вирусный капсид) еще белки, способствующие слиянию мембран липосом и клеток, в данном случае гемагглютинин вируса гриппа. Для таких препаратов сейчас используют термин «виросомы». В США заканчиваются клинические испытания нескольких оральных вакцин (против возбудителей рода Shigella и патогенных E.coli). Липосомы представляют возможность конструировать поливалентные вакцины, например, против нескольких штаммов гриппа и др. Сывороточные препараты позволяют создавать пассивный иммунитет в очень короткие сроки, что особенно важно при экстренной профилактике заболеваний с коротким инкубационным периодом и лечении уже развившейся болезни. Эти препараты получают путем специальной обработки крови искусственно иммунизированных животных, а также крови людей, перенесших соответствующее инфекционное заболевание или иммунизированных соответствующим, вакцинным препаратом. По направленности действия лечебно-профилактические сывороточные препараты можно разделить на три группы – антитоксические, антибактериальные и антивирусные. Антитоксические сыворотки, действующим началом которых являются антитоксины, применяют с целью профилактики и лечения так называемых токсинемических инфекций, т. е, инфекций, в основе которых лежит действие на организм ядовитых продуктов жизнедеятельности микробов – токсинов. К числу таких инфекций относятся столбняк, дифтерия, ботулизм, газовая и стафилококковая инфекции. Антитоксическими являются также сыворотки против ядов змей, содержащие в достаточно высокой концентрации антитела к змеиным ядам. Антитоксины антитоксических сывороток способны нейтрализовать действие соответствующих токсинов, что и обеспечивает их лечебно-профилактический эффект. Антибактериальные сыворотки, ранее широко применявшиеся в практике, в настоящее время используют в ограниченных количествах. Это объясняется, с одной стороны, их относительно малой эффективностью, а с другой – широким внедрением в практику высокоэффективных химиотерапевтических препаратов и антибиотиков. Действующим началом, антибактериальных сывороток является комплекс антител-агглютининов, бактсриолизинов и опсонинов, способствующих фагоцитозу и лизису микробных клеток в организме. Антивирусные сыворотки в последнее время находят все более широкое применение как для профилактики, так и лечения ряда вирусных заболеваний – кори, гриппа, бешенства, клещевого энцефалита, гепатита. В ряде случаев эти препараты можно использовать с целью профилактики поствакцинальных осложнений и осложнений после применения живых вакцин – оспенной и коревой. Действующим началом антивирусных сывороток являются вируснейтрализующие антитела, способные инактивировать соответствующие вирусы. Антитоксические, антибактериальные и некоторые антивирусные сыворотки готовят путем гипериммунизации (по специально разработанным схемам) крупных животных, главным образом лошадей. Лошади являются наиболее подходящим для этой цели видом животных; от них удается получать высокоактивные сыворотки в достаточно больших количествах. Гипериммунные сыворотки, получаемые из крови животных путем удаления форменных элементов и фибрина и называемые нативными, перед практическим применением подвергаются очистке и концентрации. Принципы очистки основаны на выделении из сыворотки специальными методами активных, белковых фракций, преимущественно глобулиновых, и удалении балластных фракций, не являющихся носителями антител. Выделенные активные фракции растворяют в меньшем по сравнению с исходным объеме, что в итоге позволяет вводить препарат в меньших объемах и с меньшим содержанием чужеродных для организма белков сыворотки. С целью уменьшения возможности побочных реакций, в частности анафилактических, некоторые сыворотки в процессе очистки подвергают обработке протеолитическими ферментами. Получаемые путем такой обработки препараты содержат расщепленные белковые молекулы с меньшим молекулярным весом, что обусловливает их меньшую анафилактогенность. Сывороточные препараты, получаемые из крови животных, имеют два существенных недостатка, связанных с их гетерогенностью, т. е. чужеродностью для человека. Первый недостаток заключается в том, что введение их в организм может сопровождаться различными реакциями, связанными с сенсибилизирующим действием сывороточных белков (сывороточная болезнь, анафилактический шок). Из них наибольшую опасность представляют реакция немедленного типа –анафилактический шок, развивающийся, как правило, у лиц, получавших ранее сыворотку и, следовательно, уже сенсибилизированных к гетерогенному белку. Перед введением любых гетерогенных сывороток необходимо определять индивидуальную чувствительность организма к белкам данной сыворотки путем постановки специальной внутрикожной пробы. Вторым недостатком гетерогенных сывороток является кратковременность обусловливаемого ими пассивного иммунитета, длительность которого ограничивается 1-2 нед. Выведение антител из организма происходит как за счет естественного процесса распада белков введенной сыворотки, так и образования антител к белкам введенной сыворотки, являющейся для организма чужеродным антигеном. После повторного введения сыворотки длительность пребывания антител в организме еще более сокращается в результате действия ранее образовавшихся антител к белкам введенной сыворотки. Иммуноглобулины, получаемые из крови человека, выгодно отличаются от сывороточных препаратов животного происхождения тем, что, не являясь для человеческого организма чужеродными, практически нереактогенны. При введении таких препаратов человеку антитела циркулируют в организме значительно дольше, чем антитела гетерогенных сывороток, обеспечивая состояние невосприимчивости в течение 4-5 нед. Иммуноглобулины получают путем фракционирования (по методу Кона) из донорской, плацентарной и абортной крови человека. Их выпускают в очищенном и концентрированном виде. . Получение моноклональных антител базируется на гибридомной технологии, в основе которой слияние клетки-продуцента с раковой клеткой и клонирование полученной гибридомной клеточной линии. При слиянии В-лимфоцита с миеломной клеткой получаются В-гибридомные клоны, применяемые как продуценты моноклональных антител. Важное преимущество моноклональных антител – их однородность, способность избирательно связываться с протективной частью антигена, инактивируя его, что имеет большое практическое значение для распознавания и лечения заболеваний, вызываемых чужеродными агентами. Моноклональные антитела успешно применяют в аналитических целях для изучения клеточных органелл, их структуры или отдельных биомолекул. В современной фармацевтической промышленности моноклональные антитела используют для очистки лекарственных препаратов. На первых этапах для гибридизации использовали исключительно миеломные клетки и В-лимфоциты мышей и крыс. Продуцируемые ими моноклональные антитела имеют ограниченное терапевтическое применение, так как они сами представляют чужеродный белок для человеческого организма. Сегодня уже получены гибридомы человека – продуценты моноклональных антител. Общая схема получения гибридом на основе миеломных клеток и иммунных лимфоцитов включает следующие этапы.
Бактериофаги представляют собой живые агенты, близкие по своей природе к вирусам и паразитирующие внутри бактериальных клеток. Проникая внутрь бактериальных клеток, они размножаются, вызывая их разрушение. На этом свойстве основано их применение с лечебно-профилактической целью. Учитывая эту специфичность, бактериофаги для практического применения готовят в виде поливалентных препаратов, включающие набор бактериофагов, активных в отношении различных типов и рас возбудителя. При получении бактериофагов производят систематический контроль за специфичностью фагов в отношении циркулирующих в природе рас возбудителей и периодически, по мере необходимости, заменяют производственные расы бактериофага. Производство бактериофагов основано на заражении активно растущей в жидкой питательной среде бактериальной культуры соответствующего возбудителя специфическим бактериофагом, что приводит к интенсивному размножению фагов, разрушению бактериальных клеток и выходу в жидкую среду большого числа фаговых частиц. Культуральная жидкость, освобожденная (при помощи стерилизующих фильтров) от оставшихся микробных клеток и их разрушенных частиц, представляет собой активный препарат бактериофага, поскольку фильтры не задерживают частиц фага. К полученному фильтрату добавляют в качестве консерванта раствор хинозола, препятствующий размножению в нем случайно попавших единичных бактерий. Препараты бактериофагов в основном применяют перорально. Прием бактериофага не сопровождается выработкой активного иммунитета, и его применение не может заменить вакцинацию, поэтому целесообразно сочетание фагопрофилактики и вакцинации. Для диагностики ряда инфекционных заболеваний и аллергических состояний человека инфекционной и неинфекционной природы широко используются разнообразные препараты, объединенные под общим названием «аллергены». Применение аллергенов основано на способности кожи сенсибилизированного к определенному агенту организма реагировать на его введение усиленной реакцией. Применяемые в практике аллергены разнообразны по своей природе, методам изготовления и химическому составу. Все аллергены могут быть разделены на две основные группы – бактериальные, или инфекционные, и неинфекционные. Бактериальные аллергены готовят из соответствующих микроорганизмов. Препараты представляют собой взвесь убитых микробных клеток или извлеченных из них различных активных фракций. К группе бактериальных аллергенов относятся туберкулин, тулярин, бруцеллин, антраксин, малеин, дизентерин. Эти аллергены используют в практике как для диагностики соответствующих инфекционных заболеваний, так и для выявления состояния иммунитета после активной иммунизации вакцинными препаратами. Группа бактериальных аллергенов включает также большое число препаратов, применяемых с целью диагностики разнообразных аллергических заболеваний человека инфекционной природы, вызываемых различными микроорганизмами – стафилококками, стрептококками, палочками кишечной группы и др. К числу таких аллергических заболеваний относятся бронхиальная астма, хронические процессы в носоглотке, отиты, полиартриты и др. Помимо диагностических целей, эти аллергены после определения сенсибилизирующего агента успешно применяют также с целью десенсибилизирующей терапии. Группа аллергенов неинфекционной природы включает разнообразные препараты, основными из которых являются бытовые, эпидермальные и пыльцовые аллергены. Бытовые аллергены готовят из домашней пыли (пыль подушек, матрацев, ковров, книг). Эпидермальные аллергены представляют собой экстракты из шерсти животных, перьев птиц. Пыльцовые аллергены готовят из пыльцы разнообразных растений, вызывающей у человека сезонные заболевания аллергического характера. Все аллергены неинфекционной природы используют как для определения аллергизирующего агента, так и с целью последующей десенсибилизирующей терапии. Профессор Дикий И.Л. (кафедра микробиологии НФАУ ) с соавторами предложили новый усовершенствованный способ получения тканевого аллергена для диагностики аутоаллергических процессов при хроническом тонзиллите. Способ осуществляется следующим образом:
1 н. раствором HCl (200 мл на 4 г влажной массы осадка). Гидролиз ведут в течение 30 мин при кипячении.
Основу биологически активного начала аллергодиагностикума составляют олигосахариды, представленные в ткани миндалин в составе соединительнотканных и ретикулярных волокон. Последнее объясняет высокую диагностическую ценность полученного аллергена и дает возможность его химической идентификации. Система производства и контроля бактерийных и вирусных препаратов Бактерийные и вирусные препараты представляют собой вид продукции, к производству и контролю которой предъявляются особо жесткие требования. Это обусловлено прежде всего тем, что их готовят, как правило, на основе патогенных или ослабленных микроорганизмов. Это обстоятельство требует соблюдения четко регламентированных условий технологии производства, гарантирующих, с одной стороны, безопасность работающего персонала, с другой – безвредность, эффективность и стандартность препаратов. Основным условием для производства любого препарата является наличие специальной, утвержденной Министерством здравоохранения Украины технической документации, включающей технические условия (ТУ) и регламент производства. Технические условия на препараты регламентируют основные показатели качества, которым должны обладать выпускаемые в практику препараты. В этом документе кратко и четко изложены следующие данные: название препарата, характеристика его действующего начала, критерии качества, назначение препарата с включением «Наставления по применению», которое прилагается к препарату при его выпуске, методы контроля, при помощи которых оценивается соответствие препарата установленным качественным показателям, характеристика лекарственной формы, условия хранения и транспортировки препарата, срок годности и порядок его продления. Регламент производства является вторым обязательным документом, необходимым для организации производства бактерийных и вирусных препаратов, утверждаемым также Министерством здравоохранения Украины. Этот документ детально регламентирует технические и технологические условия производства, которые должны обеспечить изготовление и выпуск препаратов, полностью отвечающих требованиям, изложенным в технических условиях. Контроль препаратов осуществляется на всех этапах производства, начиная с оценки качества исходного сырья и реактивов, используемых в производстве, качества производственных штаммов микроорганизмов, питательных сред, полуфабрикатов и кончая готовой продукцией. Аспекты GMP Основная идея GMP (Good Manufacturing Practice) связана с обеспечением надлежащей системы производства и контроля, гарантирующей получение качественных лекарственных средств. При этом правила GMP предусматривают строгое документирование процесса производства, а директивы ЕС – обеспечение соответствия качества промышленных серий препаратов требованиям регистрационной и лицензионной документации. К основному тексту Европейской GMP существуют 14 Приложений. Действие Приложения 2 к GMP по производству биологических лекарственных препаратов для человека распространяется на:
При производстве биологических лекарственных препаратов необходимо руководствоваться «Общими требованиями ВОЗ к производственным предприятиям и контрольным лабораториям». В Приложении по биологическим препаратам не даются подробные требования к отдельным классам биологических препаратов, требования к которым изложены в других руководствах, изданных Комитетом по патентованным лекарственным препаратам /Committee for Proprietary Medicinal Products – CPMP/, например, руководство по моноклональным антителам, руководство по препаратам, получаемым методом ДНК-рекомбинантной технологии и др. Производство биологических лекарственных препаратов имеет свои особенности, вытекающие из природы продуктов и процессов. В отличие от обычных лекарственных препаратов, которые получают химическими или физическими методами с высокой степенью постоянства, производство биологических лекарственных препаратов сопряжено с биологическими процессами и материалами, такими как культивирование клеток или экстракция материала из живого организма. Изменчивость биологических процессов приводит к непостоянству диапазона и природы побочных продуктов. При контроле биологических лекарственных препаратов часто необходимо использовать биологические и аналитические методы контроля. Особое значение приобретает контроль во время процесса производства биологических лекарственных препаратов. В Приложении, по сравнению с основным текстом GMP, значительно расширены требования к персоналу: к его обучению, иммунологическому статусу, контролю состояния здоровья, подчеркивается о недопустимости переходов в течение рабочего дня из помещения, где обрабатываются одни микроорганизмы в помещение с другими организмами, а если такой переход неизбежен о необходимости особых мер предосторожности. |