1 Жебентяев Александр Ильич
 Скачать 5.46 Mb.
|
|
Обнаружение метанола 1. Реакция окисления метанола до формальдегида. Предварительно проверяют наличие формальдегида в исследуемом растворе. Для окисления метанола до формальдегида чаще применяют перманганат калия. 5CH 3 OH + KMnO 4 + 3H 2 SO 4 → 5HCOH + 2 MnSO 4 + K 2 SO 4 + 8 H 2 O (7.112) Избыток КМО 4 удаляют прибавлением щавелевой кислоты, гидросульфита натрия или других восстановителей. Обнаружение формальдегида проводят при помощи хромотроповой, фуксинсернистой кислот и резорцина (методики описаны при обнаружении формальдегида). Предложено несколько вариантов реакции окисления метанола в зависимости от содержания метанола в пробе: 1 ) к 2 мл исследуемого раствора или дистиллята прибавляют 1 мл раствора перманганата калия, содержащего фосфорную кислоту (смесь 100 мл 3%-го раствора перманганата калия и 15 мл 87%-го раствора фосфорной кислоты). Раствор нагревают при 50 º С на водяной бане в течение 10 мин, затем для удаления избытка окислителя 318 Глава 7. Летучие токсиканты прибавляют 1 мл 5%-го раствора щавелевой кислоты в разбавленной (1:1) серной кислоте. 2 ) в микропробирку вносят каплю исследуемого раствора, прибавляют каплю 5%-го раствора фосфорной кислоты и каплю 5%-го раствора перманганата калия. Раствор перемешивают в течение 1 мин, прибавляют небольшое количество твердого гидросульфита натрия и содержимое пробирки взбалтывают до обесцвечивания. Если в пробирке появится бурый осадок оксида марганца (IV), то еще прибавляют каплю раствора фосфорной кислоты и немного гидросульфита натрия. Обнаружение метилового спирта после его окисления. После окисления метилового спирта до формальдегида последний определяют при помощи реакций с хромотроповой кислотой, фуксинсернистой кислотой и с резорцином. Эти реакции описаны выше при определении формальдегида. Из данных реакций специфической на метиловый спирт (после его окисления) является реакция с хромотроповой кислотой. Не дают этой реакции этиловый, пропиловый, бутиловый, амиловый и изоамиловый спирты. 2. Реакция образования метилсалицилата. При нагревании дистиллята, содержащего метанол, с салициловой и концентрированной серной кислотами ощущается характерный запах метилсалицилата. Предел обнаружения – 0,3 мг/мл дистиллята. OH COOH + CH 3 OH + H 2 O OH COOCH 3 (7.113) Этой реакции мешает этанол. Методика реакции образования метилсалицилата: к 1 мл дистиллята прибавляют 1 мл 50% раствора серной кислоты и 0,1 г салицилата натрия. Смесь нагревают на водяной бане – появление характерного запаха указывает на наличие метанола или этанола в дистилляте. Количественное определение 1. Метод газовой хроматографии. 2. Фотометрический метод: метанол окисляют до формальдегида, который с фуксинсернистой кислотой образует окрашенное соединение. 319 Глава 7. Летучие токсиканты 7.7.6.2. Этанол Свойства, токсикологическое значение Этанол (C 2 H 5 OH) – бесцветная жидкость с характерным запахом, плотность 0,813–0,816, температура кипения 77–77,5 0 С. Смешивается с водой, эфиром и другими органическими растворителями. Получают этанол путем брожения крахмалсодержащих продуктов (зерно, картофель), фруктов, сахара. Полученный таким способом спирт-сырец содержит сивушные масла, которые относительно медленно подвергаются метаболизму в организме и соответственно их действие на организм более продолжительное. Этанол может поступать в организм при приеме внутрь, при вдыхании паров этанола. В последние годы острые отравления этанолом занимают первое место (около 60%) среди отравлений токсическими веществами. К тому же поступление в организм значительных количеств этанола может привести к скоропостижной смерти при заболеваниях сердечно-сосудистой системы. Поэтому в настоящем пособии уделено значительное внимание рассмотрению острой алкогольной интоксикации. 7.7.6.2.1. Острая алкогольная интоксикация Этанол при приеме внутрь может вызывать острое смертельное отравление. Смертельной дозой для человека считается 6–8 мл этанола на 1 кг массы тела (в среднем 300 мл 96% этанола). В связи с различной чувствительностью к алкоголю, а также неодинаковыми условиями его приема (крепость напитка, темп приема, степень наполнения желудка пищей и др.) установить какую-то однозначную смертельную дозу этанола не представляется возможным. Известны случаи смерти от 100– 150 г этанола, однако иногда прием 600–800 г чистого спирта не вызывал смертельного исхода. В организме этанол претерпевает две фазы превращения – резорбция (всасывание) и элиминация (выведение). В клинической картине острого отравления этанолом выделяют наиболее характерные симптомы. В токсикогенной фазе – это коматозное состояние и другие неврологические расстройства, нарушения дыхания, функции сердечно-сосудистой системы. Соматогенная фаза характеризуется психоневрологическими расстройством, воспалительными поражениями органов дыхания и др. Для обозначения совокупности патологических изменений, которые возникают при длительном и неумеренном приеме алкоголя шведским врачом М. Гуссом в 1849 году было введено понятие «хронический алкоголизм». При хроническом алкоголизме снижается уровень антиоксидантов и повышается риск возникновения инсультов. Лечением хронического алкоголизма занимаются наркологи. 320 Глава 7. Летучие токсиканты Этанол действует преимущественно на нервную систему. Под его влиянием исчезает рефлекторная возбудимость – ЦНС теряет способность передавать нервные импульсы, в то время как возбудимость исполнительных органов и периферических нервов сохраняется. Этанол – один из самых сильных возбудителей секреции желудочных желез, он действует, главным образом, через ЦНС. Однако выделяемый при этом желудочный сок беден ферментами и обладает пониженной пищеварительной способностью. Наркотический эффект этанола зависит от скорости резорбции, фазы интоксикации, степени развития толерантности к алкоголю, концентрации алкоголя в крови. В обычных условиях около 20% принятого этанола всасывается в желудке, остальные 80% - в тонком кишечнике. Малоконцентрированные спиртные напитки (до 30% этанола) всасываются быстрее, замедляют всасывание этанола пищевые массы. Максимум концентрации этанола в крови достигается через 45– 90 минут. До 90% поступившего в организм этанола окисляется в печени с участием трех ферментов: алкогольдегидрогеназы, каталазы и CYP2E1 . Окисление происходит до ацетальдегида и затем до уксусной кислоты, которая в организме окисляется до углекислоты и воды. Около 10% этанола выделяется в неизменном виде через легкие и почки. Токсические и смертельные концентрации этанола в крови находятся в широком диапазоне и зависят от многих факторов и в первую очередь от индивидуальной переносимости (выносливости). Считают низшей смертельной концентрацией этанола в крови 3 0 / 00 , а средняя – 4 0 / 00 . За высшую смертельную концентрацию большинство судебно-медицинских экспертов принимают 5–6 0 / 00 Смерть может наступить в любой период алкогольного опьянения: 12% - в заключительной стадии резорбции; 52% - в раннем периоде фазы элиминации и 36% – в конце фазы элиминации. В настоящее время наблюдаются случаи комбинированного отравления (этанол, пропанол, бутанол). Замечено, что при наличии в крови небольших количеств высших спиртов (менее 0,1 0 / 00 ) смерть может наступить при концентрации этанола в крови 1,5–2,5 0 / 00 , т.е ниже той, которая считается смертельной. Суррогаты алкоголя делят на 2 группы: 1. Препараты, приготовленные на основе этанола и содержащие различные примеси. 2. Препараты, не содержащие этанола и представляющие собой одноатомные или многоатомные спирты, хлорированные углеводороды (ложные суррогаты). Их токсическая опасность значительно выше. К препаратам первой группы относятся: 321 Глава 7. Летучие токсиканты - гидролизный и сульфитный спирты, которые представляют собой спирт этиловый, полученный из древесины путем гидролиза; - денатурат – технический спирт с незначительной примесью метилового спиртов и альдегидов; - одеколоны и лосьоны – распространенные косметические средства, содержащие до 60% этилового спирта, эфирные масла и прочие примеси; - клей БФ, основой которого являются фенольно- формальдегидная смола и поливинилацеталь, растворенные в этиловом спирте, ацетоне; - политура – технический этиловый спирт с содержанием ацетона, бутилового и амилового спиртов; - « нигрозин» - морилка для дерева, которая содержит этиловый алкоголь и красящие вещества, вызывающие интенсивное и длительное прокрашивание кожных покровов и слизистых оболочек в синий цвет. В зависимости от степени алкогольной интоксикации различают три степени опьянения: легкую (слабую), среднюю и тяжелую (сильную). Легкая степень опьянения характеризуется состоянием не сильного возбуждения, повышением настроения, переоценкой своих сил и возможностей. При средней степени состояние эйфории достигает наибольшей выраженности: человек делается развязным, благодушным, веселым. Тяжелая степень опьянения характеризуется глубоко разлитым торможением, человек находится как бы в глубоком сне. Возможна потеря сознания, температура тела понижается, кожа лица бледнеет. Дыхание поверхностное, замедленное. Зависимость состояния человека от уровня этанола в крови: до 0,3 0 / 00 - влияние этанола отсутствует; 0,3-0,5 0 / 00 - незначительное влияние этанола; 0,5-1,5 0 / 00 - легкое опьянение 1,5-2,5 0 / 00 - опьянение средней тяжести 2,5-3,0 0 / 00 - сильное опьянение 3,0-5,0 0 / 00 - тяжелое отравление этанолом (возможен летальный исход). Свыше 5,0 0 / 00 - смертельное отравление. Эти данные имеют смысл, если с момента применения этанола прошло не более 3 часов. Большой токсичностью обладает уксусный альдегид. Хотя он окисляется до уксусной кислоты, но какое-то количество его остается. Он значительно токсичнее этанола. При алкоголизме изменяется метаболизм этанола в печени. Это происходит потому, что активность акогольдегидрогеназы с прогрессированием алкоголизма и 322 Глава 7. Летучие токсиканты нарушением деятельности печени снижается. Происходит накопление этанола в организме, снижается темп его утилизации. Этанол легко проникает через все биологические мембраны и во все органы, ткани, клетки организма. В результате приема этанола может развиться витаминная недостаточность (тиамина, никотиновой, фолиевой кислот). Этанол всасывается слизистыми оболочками нижнего отдела желудка и тонкой кишки и по системе воротной вены поступает в печень, где этанол подвергается метаболизму. Алкоголь особенно опасен для беременных женщин. Он очень быстро проникает в околоплодные воды и задерживается там. У взрослых есть выделительная система, печень, которая превращает спирт в уксусный альдегид, затем в уксусную кислоту, которая разлагается на углекислоту и воду. У зародыша выделительная система не сформирована, а печени вообще нет в первые три месяца. Уксусный альдегид в 1000 раз токсичнее этанола и разрушает в организме плода все его системы: видоизменяет белки, разрушает мелкие сосуды, усиливает выброс гормонов в кровь. Особенную опасность уксусный альдегид представляет для нервных клеток, так как поражает их мембраны, которые состоят из белков и липидов. У беременных, пренебрегающих запретом на алкоголь, нарушена нормальная перестройка организма при беременности, что является причиной токсикоза и различных эндокринных нарушений. Повышается риск выкидышей, а если ребенок доношен – то он рождается с алкогольным синдромом плода (АСП). Физических отклонений может и не быть, позже появятся психические отклонения (замедленное умственное развитие, различные двигательные нарушения, слабая память и др.). У таких детей обычно плохое настроение и, повзрослев, они ищут утешение в алкоголе и наркотиках. Эффект АСП может возникнуть и у детей рожденных непьющими женщинами, но от пьющих мужчин. Вопросами алкоголизма, наркомании и токсикомании занимается медицинская наука – наркология. Наркология – это медицинская наука, изучающая условия возникновения, механизмы формирования зависимости от психоактивных веществ, их токсические эффекты с целью разработки адекватных методов диагностики, лечения и профилактики обусловленных ими заболеваний. Считают, что при употреблении 7–8 л спирта на одного человека в год – обстановка в стране терпимая. В России и Беларуси (2000–2010 годы) потребление спирта составляет около 14 л спирта на одного жителя в год. От 25 до 50% случаев самоубийств, совершаемых по разным причинам, приходится на пьяниц и алкоголиков. 85% случаев смерти и болезней пищеварительного тракта приходится на алкогольный цирроз печени. В результате проведенных эпидемиологических исследований установлена зависимость частоты возникновения злокачественных 323 Глава 7. Летучие токсиканты новообразований от количества этанола, поступившего в организм. Такая зависимость объясняется канцерогенностью ингредиентов в алкогольных напитках, возрастанием активности проканцерогенов клетки в результате активации этанолом фермента CYP2E1, угнетением функции иммунной системы, повышением абсорбции растворимых в этаноле канцерогенов и др. Курение и употребление алкоголя способствуют развитию злокачественных новообразований ротовой полости и гортани. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) в 2011г опубликовала доклад о положении в области алкоголя и здоровья. В рейтинге «самых пьющих» фигурируют Молдова (18,22 литра алкоголя на человека в год), Чехия (16,45), Венгрия (16,27), Россия (15,76), Украина (15,6), Эстония (15,57), Андорра (15,48), Румыния (15,3), Словения (15,19), Беларусь (15,13) и Великобритания (13,37). ВОЗ зарегистрировала 6,2 % смертей от алкоголя среди мужского населения против 1,1 % среди женского. По данным ВОЗ каждый пятый человек в России и странах СНГ умирает от злоупотребления алкоголем. Всего в мире по причинам, связанным с употреблением спиртного, ежегодно умирают около 2,5 млн человек. Основная задача лечения алкоголизма заключается в прекращении приема этанола и выработке к нему отрицательного отношения. Медикаментозное лечение необходимо сочетать с психотерапией. При лечении алкоголизма применяются различные лекарственные средства, например, дисульфирам (тетурам, антабус). N C 2 H 5 C 2 H 5 C S S S C S N C 2 H 5 C 2 H 5 (7.114) Механизм действия дисульфирама заключается в том, что он задерживает окисление этанола на уровне ацетальдегида. Накопление ацетальдегида сопровождается чувством страха, головными болями, обильным потоотделением, тошнотой, рвотой, гипотензией. Лечение дисульфирамом проводится под контролем врача. Тетурам пролонгированного действия (эспераль) имплантируется в подкожную клетчатку. 7.7.6.2.2. Методы определения этанола Из современных экспресс-методов определения этанола метод ГЖХ в высшей степени точен, специфичен и чувствителен. Для анализа достаточно 1–2 мл крови, мочи, слюны. Сущность газохроматографического определения спиртов заключается в 324 Глава 7. Летучие токсиканты переведении данных веществ в алкилнитриты (более летучие соединения), которые затем разделяются на хроматографической колонке. Объекты исследования – кровь, моча (этанола больше там, где больше воды). Кровь берут из бедренной и плечевой вен во флаконы из стеклодрота, закрывают резиновой пробкой, обвязывают пергаментной бумагой, опечатывают, хранят в холодильнике. При хранении при комнатной температуре возможно консервирование хинозолом (3–5 капель насыщенного раствора на 10 мл). Газохроматографическое обнаружение и количественное определение этанола в биологических жидкостях. С целью получения более летучего соединения этанол переводят в этилнитрит (Т кип = 17 0 С). Этилнитрит, находящийся в газообразном состоянии над жидкостью, вводят в газовый хроматограф и производят хроматографирование. На рис. 7.17 показана хроматограмма смеси, содержащей алкилнитриты. При ГЖХ- определении алкилнитриты выходят в порядке увеличения молекулярных масс независимо от полярности неподвижных жидких фаз. Если используются полярные жидкие фазы, то время удерживания увеличивается по сравнению с неполярными жидкими фазами. Рис. 7.17. Хроматограмма смеси алкилнитритов 1 – оксиды азота; 2 – метилнитрит; 3 – этилнитрит; 4 – изопропилнитрит; 5 – пропилнитрит. 325 Глава 7. Летучие токсиканты Методика обнаружения этанола в крови и моче. В пенициллиновый флакон вносят 0,5 мл 50%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и 0,5 мл водного раствора эталонного вещества (96% этанол разбавляют до концентрации 3–4‰). Флакон закрывают резиновой пробкой и помещают в специальный цилиндр (фиксирующий патрон)(рис. 7.18). Пробку можно фиксировать также алюминиевым колпачком с помощью прибора для обкатки флаконов или используют специальное прижимное устройство. Содержимое флакона перемешивают. С помощью шприца во флакон вводят 0,25 мл 30%- го раствора нитрита натрия и смесь взбалтывают в течение 1 минуты. Шприцем отбирают 0,5 мл парообразной фазы, находящейся над жидкостью, и вводят в газовый хроматограф. Регистрируют хроматограмму. Аналогично производят такой же опыт с исследуемым раствором. Сравнивают полученные хроматограммы. Совпадение времени удерживания вещества в первом и во втором опыте свидетельствует о наличие этанола в исследуемом растворе. Флаконы с кровью и мочой до передачи на лабораторное исследование хранятся в холодильнике при температуре не выше 4 о С не более 5 суток. В качестве внутреннего стандарта при количественном определении этанола необходимо брать стандартный раствор пропанола-1, так как изопропиловый спирт образуется в биоматериале в результате гнилостных процессов. Рис.7.18. Цилиндр для фиксации пробки к флакону 1 – цилиндр с резьбой; 2 – навинчивающаяся крышка; 3 – отверстие для ввода иглы шприца. Количественное определение этанола 1. Построение градуировочного графика Готовят стандартные растворы, содержащие 1, 2, 3, 4, 5%-го этанола и 4% пропанола-1. Затем в несколько флаконов вносят по 2 мл раствора, содержащего 4% пропанола-1, и в каждый флакон 326 Глава 7. Летучие токсиканты прибавляют по 2 мл стандартного раствора этанола различной концентрации. Содержимое флаконов перемешивают. Из каждого флакона берут по 1 мл смеси и переносят в другие флаконы, в которые затем прибавляют по 0,5 мл 50%-го раствора трихлоруксусной кислоты. Флаконы закрывают резиновыми пробками, которые затем фиксируют к флаконам. С помощью шприца в каждый флакон вносят по 0,25 мл 30%-го раствора нитрита натрия, взбалтывают, отбирают шприцем по 0,5 мл газообразной фазы, вводят в камеру испарителя и хроматографируют. На полученных хроматограммах измеряют площадь или высоту хроматографического пика, рассчитывают отношение площади или высоты пика этилнитрита к площади или высоте пика пропилнитрита и строят градуировочный график в координатах «концентрация этанола – площадь (высота) пика». 2. Количественное определение этанола в крови и моче. В пенициллиновый флакон вносят 2 мл внутреннего стандарта (пропанол-1 в концентрации 4‰), прибавляют 2 мл исследуемой крови или мочи. Взбалтывают содержимое флакона и переносят 1 мл жидкости в другой флакон, прибавляют 0,5 мл 50% раствора трихлоруксусной кислоты. Флакон закрывают резиновой пробкой и помещают в фиксирующий цилиндр. Шприцем вносят во флакон 0,25 мл 30%-го раствора нитрита натрия. Содержимое флакона взбалтывают. При помощи шприца отбирают 0,5 мл газообразной фазы, переносят в камеру испарителя хроматографа и хроматографируют. Определяют площадь или высоту пиков, рассчитывают отношение площади или высоты пиков этанола к площади или высоте пика пропилнитрита. По градуировочному графику рассчитывают содержание этанола в крови или в моче (в ‰). Примечание: Приготовление эталонных растворов этанола и пропанола-1. Сначала готовят исходный 1% раствор этанола (13,1 мл 96% (объемных) этанола помещают в мерную колбу на 1л и разбавляют водой до метки). Для приготовления эталонного раствора, содержащего 0,4‰ ˚ этанола помещают 2,00 мл 1% раствора в мерную колбу вместимостью 50,0 мл и разбавляют водой до метки. Для приготовления растворов, содержащих 1‰, 2‰ ˚ и 4‰ этанола берут соответственно 5,0, 10,0 и 20,0 мл исходного раствора и производят разбавление. Эталонные растворы хранят в склянках темного стекла с притертыми пробками при температуре 4–6 ˚С. При правильном хранении концентрация эталонных растворов не изменяется в течение 5 дней. 327 Глава 7. Летучие токсиканты Для приготовления раствора, содержащего 4‰ пропанола-1, в мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 0,20 мл пропанола-1 и разбавляют водой до метки. Подготовка колонки Подготовка твердого носителя В качестве твердого носителя используют различные вещества на основе кизельгура (цеолиты, хромосорб, хроматон, цветохром и т. п.) с размером частиц 0,20–0,25мм, предварительно модифицированные слоем металлического серебра. Модификация металлическим серебром проводится в следующем порядке: 0,2 г нитрата серебра растворяют в 0,5 мл воды и добавляют 25 мл этанола. Раствор переносят в круглодонную колбу со шлифом и к раствору добавляют 10 г твердого носителя. Колбу присоединяют к вакуумному насосу на 25–30 мин. Затем колбу помещают на водяную баню (80–90 ˚С) и отгоняют 10–15 мл спирта. Колбу снимают с бани и отсоединяют от вакуумного насоса. При постоянном перемешивании в колбу вносят 5 мл 10% раствора аммиака. Колбу присоединяют на 15–20 мин к вакуумному насосу. После отключения насоса в колбу вносят 3 мл 40% раствора формальдегида, перемешивают и помещают на 5 мин в водяную баню при постоянном перемешивании. Затем твердый носитель промывают декантацией горячей дистиллированной водой до нейтральной реакции, свежеприготовленным 1% раствором гидроксида калия, и раствору дают свободно стечь. После этого твердый носитель сушат при 90–95 ˚С досуха, а затем прокаливают 3 часа при 150±5 0 С. Приготовленный твердый носитель сохраняют в склянках с притертой пробкой. Нанесение неподвижной фазы В фарфоровой чашке для выпаривания растворяют 1 г полиэтиленгликоля-1500 в 20 мл перегнанного хлороформа и в раствор вносят 10 г подготовленного твердого носителя. Содержимое перемешивают покачиванием в течение 8–10 мин и чашку помещают на водяную баню с температурой 60–65 0 С при постоянном перемешивании до полного удаления растворителя и отсутствия запаха хлороформа. Подготовку твердого носителя и нанесение неподвижной фазы можно проводить с использованием ротационного испарителя. Заполнение и кондиционирование колонок Перед кондиционированием с помощью бюретки с дистиллированной водой измеряют объем колонки или рассчитывают его по формуле: 328 Глава 7. Летучие токсиканты V = D 2 L 4 π (7.115) где: V – объем колонки, D – диаметр колонки, L – длина колонки. Колонку снабжают биркой с указанием объема колонки, наименование твердого носителя, неподвижной фазы и даты заполнения. Незаполненные хроматографические колонки предварительно промывают раствором жидкого детергента, ополаскивают дистиллированной водой, промывают спиртом, эфиром и хлороформом перегнанным (соблюдать порядок промывки), продувают воздухом и прокаливают в сушильном шкафу при 200–250 0 С в токе инертного газа в течении 2 часов. Новые колонки необходимо после прокаливания установить в прибор, включить газ-носитель и проверить герметичность соединений. Заполняют колонку «под иглу» точно измеренным количеством наполнителя (твердый носитель с нанесенной неподвижной фазой). Заполненную колонку подсоединяют к блоку ввода пробы, оставляя свободным второй конец, устанавливают поток газа-носителя 24 мл/мин., проверяют герметичность и термостатируют, повышая температуру от 50 0 С до 95 0 С ступенчато – на 10 0 С после чего устанавливают температуру 90 0 С и кондиционируют 24 часа. Только после кондиционирования отключают термостат, охлаждают до комнатной температуры и подсоединяют колонку к детектору. Подготовленная по описанной выше методике («Методика газохроматографического определения этилового спирта в жидких биологических средах организма», БелГИМ, 2001, 21 с.) колонка работоспособна более одного года при условии соблюдения температурного режима (не выше 95 0 С) и чистоты газа-носителя. Необходимо также избегать перегрузки колонок большим количеством исследуемой пробы (не более 1 см 3 парогазовой фазы или 5 мкл жидкой пробы). Проверка эффективности колонки Проверка эффективности колонки производится с помощью контрольных растворов этилового спирта и пропанола-1. В качестве контрольных растворов (стандартов) используют 1˚∕ ˚˚ водный раствор этанола и 0,4% водный раствор пропанола-1. Во флакон, содержащий 0,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты, вносят 0,5 мл 0,4% раствора пропанола-1 и 0,5 мл 1˚∕ ˚˚ этанола, флакон закрывают стандартной пробкой, которую фиксируют приспособлением для обжима колпачков на флаконах. Содержимое 329 Глава 7. Летучие токсиканты флакона перемешивают, и во флакон шприцем вводят 0,3 мл раствора нитрита натрия. Флакон энергично встряхивают (30 маятникообразных движений) и оставляют на 1минуту. После чего из флакона шприцем путем прокола пробки отбирают 0,5 см 3 парогазовой фазы, которую вводят в прибор. На хроматограмме измеряют время выхода и ширину на половине высоты пиков и вычисляют критерий разделения по формуле: K = t 2 - t 1 b 1 - b 2 или (7.116) R = K 0,849 (7.117) где: t – время удерживания пика, b – ширина пика на половине высоты; индексы 1 и 2 относятся к пикам этил- и пропилнитрита соответственно. Значение R должно быть не менее 1,06 (К не менее 0,9 соответственно). Если это условие не выполняется, то необходимо вариацией температуры термостата колонок и скорости потока газа- носителя повысить эффективность. Эффективность колонок оценивают величинами «число теоретических тарелок» (ЧТТ - N) или «высота, эквивалентная теоретической тарелке» (ВЭТТ - H) для пика этилнитрита: 2 b t 5,545 N = (7.118) N L H = (7.119) где L – длина колонки. Величина ЧТТ для колонок ПЭГ-1500 длиной 2м должна быть не менее 250 (ВЭТТ не более 8 мм соответственно). В процессе работы необходимо периодически один раза в неделю проверять эффективность колонок по приведенной выше методике. При определении этанола в крови количество этанола, найденное по градуировочному графику, умножают на 0,95, а при анализе мочи - 1,05. В этом методе не требуется строить отдельно калибровочные графики для крови и мочи. По полученным результатам определения этанола в крови и моче рассчитывают коэффициент элиминации: К el =C (в моче) /С (в крови) (7.120) 330 Глава 7. Летучие токсиканты Для экспертизы важно то обстоятельство, что соотношение концентрации этанола в моче и крови в стадии резорбции никогда не превышает единицу, а в стадии элиминации всегда выше единицы. Это имеет большое значение для диагностики стадий алкогольного опьянения и для установления времени, которое прошло с момента поступления алкоголя в организм до момента исследования. Более 90% пациентов поступают в стационар в стадии элиминации алкоголя, когда средний коэффициент отношений концентрации этанола в моче и крови составляет 1,2. Количественное содержание этанола в крови и моче выражают в 0 / 00 , т.е. тысячная доля (г/л). При оценке результатов количественного определения этанола в крови следует иметь в виду, что этанол образуется при гнилостном разложении трупов (в крови образуется при этом до 2,4 0 / 00 этанола). Следует отметить усовершенствованный газохроматографи- ческий (парофазный) способ определения этанола в моче. Этилнитритный газохроматографический метод определения этанола имеет недостатки: загрязнение воздуха оксидами азота. Со временем уменьшается чувствительность детектора (катарометр) в результате его взаимодействия с оксидами азота. Были исследованы разные колонки и выбрана колонка с полисорбом-А, модифицированным апиезоном (5%) , при этом на хроматограммах устраняются «хвосты» при анализе спиртов. К моче в пенициллиновом флаконе добавляют фосфорно- вольфрамовую кислоту (разрушение комплекса этанола с сопутствующими веществами), внутренний стандарт, например – пропанол-1, закрывают, герметизируют металлическим колпачком, нагревают на водяной бане 5 мин. Берут 1 мл парогазовой фазы и вводят в испаритель. Парофазный метод не уступает этилнитритному по точности и воспроизводимости. Биохимические методы определения этанола 1. Ферментативный (энзимный): алкогольдегидрогеназа (АДГ) катализирует окисление этанола, акцептором водорода является дифосфопиридиннуклеотид, который в восстановленной форме поглощает при 366 нм. На использовании биохимической реакции окисления спиртов алкогольдегидрогеназой основан иммуноферментный метод определения этанола, отличающийся низким пределом обнаружения и высокой специфичностью. 2. Ферментативное определение этанола на основе флуоресценции, характерной для алкогольдегидрогеназы: - измеряют интенсивность флуоресценции в процессе ферментативного превращения этанола. Можно определять этанол 331 Глава 7. Летучие токсиканты непосредственно в природных образцах без предварительной обработки пробы. Другие методы обнаружения и количественного определения этанола в биологических объектах. Фотометрический (этилнитритный) метод определения этанола в настоящее время не применяется, т.к. он не специфичен. С помощью этого метода определяется суммарное содержание спиртов в крови. Электрохимический метод определения этанола основан на использовании электрохимической ячейки, в которой происходит окисление этанола до ацетальдегида. Для электрохимического определения этанола в выдыхаемом воздухе используют приборы, оснащенные электрохимическим детектором. Применение ИК-спектрометров для количественного определения этанола в анализируемых образцах основано на измерении аналитического сигнала при 3400, 3480, 3800 нм и других длинах волн. Выбор рабочей длины волны определяется типом применяемого анализатора. Для экспресс-обнаружения этанола в выдыхаемом воздухе предложена проба Рапопорта: в две пробирки берут по 2 мл воды и в одну вводят трубку, через которую делают 20–30 выдохов. Затем в обе пробирки прибавляют по 25 капель конц. H 2 SO 4 , 1– 2 капли 0,5% раствора KMnO 4 . При наличии алкоголя – раствор обесцвечивается. Если вместо KMnO 4 взять K 2 Cr 2 O 7 (1– 3 капли 2%) – в присутствии этанола окраска изменяется от желтой к зеленой (проба Рапопорта- Архангеловой). Проба Мохова-Шинкаренко (см. с.98) имеет отрицательное значение, так как неспецифична. Алкотестовые полоски «Алкоскрин» и «Алкосенсор» представляют собой полоски, содержащие чувствительный реагент на этанол: после погружения полосок на 8–10 с в слюну и последующего выдерживания в течение 2 мин сравнивают окраску полосок со шкалой. Предложен алкотест в виде жевательной резины, позволяющей измерять количество выпитых алкогольных напитков. Жевательная резина содержит пигментный краситель, который не растворяется в слюне и воде, но хорошо растворяется в спирте. При жевании в течении нескольких минут изменяется окраска жевательной резины в результате взаимодействия пигмента с этанолом, содержащемся в слюне. Сравнивают окраску со шкалой на обертке жевательной резины и определяют количество этанола. 332 Глава 7. Летучие токсиканты Характерные аналитические реакции для обнаружения этанола 1. Реакция образования йодоформа. C 2 H 5 OH + 4I 2 + 6 NaOH → HCOONa + CHI 3 + 5NaI + 5H 2 O (7.121) В качестве реактивов применяют раствор гидроксида натрия, раствор иода и реакцию проводят при нагревании. При наличии этанола ощущается запах иодоформа, а при больших количествах этанола образуется желтый осадок. Предел обнаружения – 0,04 мг/мл. Методика выполнения реакции образования иодоформа: в пробирку вносят 1 мл исследуемого раствора и 2 мл 5%-го раствора гидроксида натрия или карбоната натрия. К этой смеси по каплям прибавляют 1%-й раствор иода в 2%-м растворе иодида калия до слабо- желтой окраски. Затем смесь несколько минут нагревают на водяной бане (50 °С). При наличии этилового спирта ощущается запах йодоформа. 2. Реакция этерификации. Для получения этиловых эфиров, имеющих характерный запах, применяют бензоилхлорид и ацетат натрия. Методика выполнения реакции образования этилацетата:в пробирку вносят 1 мл исследуемого раствора и 0,1 г высушенного ацетата натрия, затем осторожно по каплям прибавляют 2 мл концентрированной серной кислоты. Смесь нагревают на пламени горелки (лучше нагревать пробирку на парафиновой или глицериновой бане) до выделения пузырьков газа. Появление специфического запаха уксусно-этилового эфира указывает на наличие этилового спирта в исследуемом растворе. Предел обнаружения – 20 мг/мл. CH 3 COONa + C 2 H 5 OH + H 2 SO 4 → CH 3 COOC 2 H 5 + NaHSO 4 + H 2 O (7.122) Методика выполнения реакции образования этилбензоата: к 1 мл исследуемого раствора прибавляют 1–2 капли бензоилхлорида. При взбалтывании смеси к ней прибавляют по каплям 10%-й раствор гидроксида натрия до исчезновения удушливого запаха бензоилхлорида. Появление запаха этилбензоата указывает на наличие этилового спирта в пробе. COCl + C 2 H 5 OH COOC 2 H 5 + HCl (7.123) 333 Глава 7. Летучие токсиканты 3.Реакция образования ацетальдегида. Методика выполнения реакции образования ацетальдегида: к 1 мл исследуемого раствора прибавляют 1 мл 10%-ного раствора серной кислоты до получения кислой среды (по лакмусу). К этой смеси по каплям прибавляют 10%-й раствор дихромата калия до тех пор, пока жидкость не станет оранжево-красной. Смесь оставляют на несколько минут при комнатной температуре. При наличии этилового спирта в исследуемом растворе появляется запах ацетальдегида. Предел обнаружения – 3 мг/мл. 3 С 2 H 5 OH + K 2 Cr 2 O 7 + 4H 2 SO 4 → 3CH 3 COH + Cr 2 (SO 4 ) 3 + K 2 SO 4 + 7H 2 O (7.124) 7.7.6.3. Изоамиловый спирт. Свойства и токсикологическое значение. Изоамиловый спирт ( 3-метил-бутанол-1, изобутилкарбинол) – желтая жидкость с раздражающим «сивушным» запахом (температура кипения 132 0 С, плотность 0,814). 3-метил-бутанол-1 – главная составная часть сивушного масла, в которое входят также оптически активный 2-метилбутанол-1, пропанол, бутанол, изобутанол, другие амиловые спирты и их изомеры. Сивушное масло – побочный продукт спиртового брожения, содержит около 60% изоамилового спирта. Изоамиловый спирт относится к амиловым спиртам, имеющим общую формулу С 5 Н 11 ОН. Изоамиловый спирт применяется как растворитель лаков, при синтезе амилацетата, амилнитрита, для изготовления эссенций, имеющих фруктовый запах. Тормозная жидкость «АСК» содержит 50% изоамилового спирта. Изоамиловый спирт обладает наркотическими свойствами, значительно токсичнее, чем этанол. При приеме внутрь изоамилового спирта появляется головная боль, тошнота, рвота. Смертельная доза – 10–15 г изоамилового спирта. Изоамиловый спирт окисляется в организме медленнее, чем этанол. Основной метаболит изоамилового спирта – альдегид изовалериановой кислоты, который превращается затем в изовалериановую кислоту. Выделяются метаболиты и некоторое количество неизмененного изоамилового спирта с мочой и выдыхаемым воздухом. Если объектом исследования является спиртосодержащая жидкость, то ее разбавляют водой до 10–15% содержания этанола и экстрагируют изоамиловый спирт хлороформом. При исследовании биоматериала из дистиллята экстрагируют изоамиловый спирт эфиром или хлороформом. Экстракт делят на четыре части и выпаривают при 334 Глава 7. Летучие токсиканты комнатной температуре. При такой пробоподготовке вода не мешает проведению реакции обнаружения изоамилового спирта. Обнаружение изоамилового спирта 1. Метод газовой хроматографии. 2 . Реакция с салициловым альдегидом (реакция Комаровского). Перед выполнением аналитических реакций на изоамиловый спирт необходимо провести экстракцию изоамилового спирта диэтиловым эфиром и удалить эфир испарением. Изоамиловый спирт с салициловым альдегидом в присутствии концентрированной серной кислотой образует соединение красного цвета. Сведения о химизме этой реакции разные. Серная кислота как водоотнимающее средство отнимает воду от изоамилового спирта с образованием изоамилена, который взаимодействует с салициловым альдегидом. По другим данным концентрированная серная кислота окисляет изоамиловый спирт до изовалерианового альдегида, который также вступает в реакцию конденсации с салициловым альдегидом. Такую же реакцию дают спирты, содержащие более 3-х атомов углерода в молекуле. Методика выполнения реакции с салициловым альдегидом : в фарфоровую чашку к остатку после выпаривания диэтилового эфира прибавляют 1 мл 1%-го спиртового раствора салицилового альдегида и 3 мл концентрированной серной кислоты. После охлаждения содержимого фарфоровой чашки ее помещают на 3 мин на кипящую водяную баню. Появление розово-красной окраски указывает на наличие изоамилового спирта в пробе. Предел обнаружения – 1,5 мг. При больших количествах изоамилового спирта окраска жидкости появляется без нагревания. 3 . Реакция с п- диметиламинобензальдегидом. В присутствии концентрированной серной кислоты – появляется красная окраска. Методика выполнения реакции с n- диметиламино- бензальдегидом: в фарфоровую чашку к остатку после испарения эфира вносят 5–10 капель 5%-го раствора n-диметиламино- бензальдегида в концентрированной серной кислоте. Появление темно- красной окраски указывает на наличие изоамилового спирта в пробе. При разбавлении жидкости водой окраска переходит в фиолетовую. 4 . Реакция образования изоамилацетата. Ацетат натрия с изоамиловым спиртом в присутствии концентрированной серной кислоты образует изоамилацетат (запах грушевой эссенции). 2CH 3 COONa + H 2 SO 4 → 2CH 3 COOH + Na 2 SO 4 (7.125) 335 Глава 7. Летучие токсиканты (CH 3 ) 2 CHCH 2 CH 2 OH + CH 3 COOH → (CH 3 ) 2 CHCH 2 CH 2 COOCH 3 + H 2 O (7.126) Методика выполнения реакции образования изоамилацетата: к остатку, находящемуся в фарфоровой чашке после испарения эфира, прибавляют 2 капли концентрированной серной кислоты и около 0,03 г высушенного ацетата натрия. При слабом нагревании фарфоровой чашки ощущается запах изоамилацетата (запах грушевой эссенции). Этот запах становится более выраженным, если под конец реакции к смеси реагирующих веществ прибавить 20–25-кратный объем воды. 5 . Реакция окисления изоамилового спирта. При окислении изоамилового спирта перманганатом калия в присутствии концентрированной серной кислоты при нагревании появляется характерный запах альдегида изовалериановой кислоты. 5(CH 3 ) 2 CHCH 2 CH 2 OH + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 → 5(CH 3 ) 2 CHCH 2 CHO + 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 8H 2 O (7.127) Методика выполнения реакции окисления изоамилового спирта: остаток, находящийся в фарфоровой чашке, смывают в пробирку с помощью диэтилового эфира, который затем выпаривают досуха. К остатку в пробирке прибавляют 3–5 капель 10%-го раствора перманганата калия и такой же объем концентрированной серной кислоты. Пробирку нагревают на кипящей водяной бане в течение 1–2 мин. После этого появляется слабый запах альдегида изовалериановой кислоты, а затем – запах изовалериановой кислоты. Количественное определение изоамилового спирта проводят методом газовой хроматографии. 7.7.7. Двухатомные спирты (гликоли). Этиленгликоль Свойства, токсикологическое значение. Этиленгликоль – бесцветная маслянистая жидкость сладковатого вкуса, без запаха, плотность 1,115, температура кипения 197,4 0 С. Смешивается с водой, хорошо растворяется в ацетоне, спирте, глицерине. Плохо растворяется в эфире, хлороформе, бензоле. Этиленгликоль широко применяется в фармацевтической, косметической, парфюмерной промышленности. Входит в состав антифриза – смесь жидкостей, способная понижать температуру замерзания воды. В качестве антифриза применяются 50–60% водные растворы этиленгликоля, смеси его с глицерином, а также смеси, состоящие из метанола и глицерина, этанола и глицерина. 336 Глава 7. Летучие токсиканты Острые отравления этиленгликолем возможны при приеме внутрь, а также при поступлении через кожу. Этиленгликоль – мало летуч и отравления в производственных условиях редко наблюдаются. Клиническая картина отравления этиленгликолем состоит из трех стадий: 1) рефлекторная – легкое опьянение; 2) мозговая – наркотическое действие сменяется коматозным; 3) почечная (нефротоксическая) – развиваются симптомы поражения печени и почек. В метаболизме этиленгликоля выделяют два пути: основной - окисление до альдегида гликолевой кислоты, далее до гликолевой кислоты HOCH 2 COOH , диоксида углерода и муравьиной кислоты. Побочный путь – образование щавелевой кислоты, которая с солями кальция образует оксалаты в почечных канальцах, что может быть причиной повреждения почек. Образующийся диоксид углерода выделяется с выдыхаемым воздухом, другие метаболиты выделяются с мочой. HO-CH 2 -CH 2 -OH → HO-CH 2 -COH → HO-CH 2 -COOH → этиленгликоль гликолевый альдегид гликолевая кислота HOC-COOH →HOOC-COOН (7.128) глиоксалевая щавелевая кислота кислота Изолирование этиленгликоля из печени или желудка с содержимым проводят перегонкой с водяным паром. В колбу с биоматериалом прибавляют бензол, который является переносчиком этиленгликоля из объектов в дистиллят. Аппарат имеет специальную насадку, в которую собирают этиленгликоль (рис. 7.19). Бензол вместе с парами этиленгликоля и небольшим количеством водяного пара переносится в дистиллят. На исследование берут 10 г печени или содержимого желудка, прибавляют 5 г щавелевой кислоты. Смесь растирают до получения тонкой кашицы, переносят в круглодонную колбу 1 вместимостью 100 мл и прибавляют 50 мл бензола. Закрывают колбу вертикально поставленным холодильником 3, снабженным приспособлением (насадкой 2) для улавливания воды. Устанавливают колбу на водяную баню и нагревают. Пары бензола и увлекаемые им вода и этиленгликоль конденсируются в холодильнике и попадают в специальное приспособление (2). Бензол (плотность 0,879) находится сверху воды и стекает в колбу. Вода и этиленгликоль остаются остаются в насадке. После окончания отгонки пипеткой из насадки отбирают необходимое для анализа количество жидкости. 337 Глава 7. Летучие токсиканты Рис. 7.19. Прибор для изолирования этиленгликоля 1 – круглодонная колба с биоматериалом и бензолом; 2 – приспособление для улавливания воды и этиленгликоля; 3 – холодильник. При определении этиленгликоля в крови и моче используется методика извлечения этиленгликоля ацетоном. Очистку извлечения проводят с помощью активированного угля. Ацетон затем испаряют в токе горячего воздуха до исчезновения запаха. Водное извлечение разбавляют водой до определенного объема и исследуют методом газовой хроматографии и известными химическими реактивами. Такой способ позволяет извлечь из крови и мочи 60–80% этиленгликоля. Потери этиленгликоля частично связаны с упариванием извлечения, но в большей степени связаны сорбцией этиленгликоля белками крови ввиду высокой полярности его молекулы. Обнаружение этиленгликоля 1. В дистилляте этиленгликоль обнаруживают по реакциям окисления его до формальдегида или щавелевой кислоты. Если в качестве окислителя применяют периодат калия в сернокислой среде, то образуется формальдегид. С 2 H 4 (OH) 2 + IO 4 + H + → 2HCOH + IO 3 + H 2 O (7.129) 338 Глава 7. Летучие токсиканты Методика выполнения реакции окисления этиленгликоля периодатом и обнаружение образовавшегося формальдегида: к 3–5 мл дистиллята прибавляют 5 капель 12%-го раствора серной кислоты, 5 капель 5%-го раствора периодата калия в 5%-м растворе серной кислоты и взбалтывают. Через 5 мин прибавляют 3–5 капель раствора сернистой кислоты, а затем 4 капли раствора фуксинсернистой кислоты − появляется сине-фиолетовое окрашивание. При окислении этиленгликоля азотной кислотой образуется щавелевая кислота, которая с хлоридом кальция дает характерные кристаллы оксалата кальция. При исследовании технических жидкостей на содержание этиленгликоля применяют реакцию образования синего этиленгликолята меди. (7.130) Методика выполнения реакции с сульфатом меди: к 2–3 мл исследуемого раствора прибавляют 1–2 мл 10%-го раствора гидроксида натрия и несколько капель 10%-го раствора сульфата меди. В присутствии этиленгликоля раствор окрашивается в синий цвет. 2. Для обнаружения этиленгликоля используют также методы газожидкостной, газоадсорбционной и реакционной газовой хроматографии. Допускается использование как капиллярных, так и насадочных колонок. Определение методом реакционной газовой хроматографии основано на реакции этиленгликоля с фенилборной или бутилборной кислотой с образованием устойчивого и более летучего эфира, который идентифицируется на хроматографе с пламенно-ионизационным детектором. Условия: колонка насадочная стеклянная с внутренним диаметром 2–3 мм, длина 1,5–2,5 м заполненная хроматоном N-AW- DMCS или хроматоном N-AW-HMDS с неподвижной жидкой фазой 100% полидиметилсилоксан (OV-1, SE-30), или 50% фенил- полидиметилсилоксан (OV-17) в количестве 3–5% от массы носителя, или колонка кварцевая капиллярная с неподвижной жидкой фазой 100% полидиметилсилоксан (CPSil5CB, DB-1, Rtx-1, SPB-1, HP-1) или фенил-полидиметилсилоксан с содержанием фенильных групп от 5% до 50%. Внутренний стандарт – бутандиол. Обнаружение этиленгликоля методом газожидкостной хроматографии: колонка кварцевая капиллярная с неподвижной C 2 H 4 (OH) 2 + Cu(OH) 2 CH 2 O CH 2 O Cu + 2H 2 O 339 Глава 7. Летучие токсиканты жидкой фазой высокой полярности − высокомолекулярный полиэтиленгликоль (CP-Wax 52 CB, DB-Wax, Stabilwax, Supelcowax, HP- INNOWax, SolGel WAX). Внутренний стандарт – бутандиол. Обнаружение этиленгликоля методом газоадсорбционной хроматографии: колонка насадочная стеклянная, заполненная адсорбционным носителем полисорб 1 (сепарон SDA-1, порапак Q). Внутренний стандарт – 1,3-пропандиол. Количественное определение этиленгликоля проводится методом реакционной или газожидкостной хроматографии. Зависимость отношения площадей пиков определяемого вещества и внутреннего стандарта S i / st от отношения их концентрации в растворе C i /C st выражают линейным градуировочным графиком вида y= bx . Установление углового коэффициента линейной зависимости (b) выполняется после установки, настройки и ремонта хроматографа, замены колонки или длительного перерыва в измерениях. Установление углового коэффициента линейной зависимости выполняется по методу наименьших квадратов, используя для расчета отношение площадей пика определяемого вещества к пику внутреннего стандарта, которые получают при измерении градуировочных растворов с заданными концентрациями. Для определения углового коэффициента линейной зависимости используют пять или шесть градуировочных растворов этиленгликоля с концентрацией 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 3,0 и 5,0 г/дм 3 и раствор соответствующего внутреннего стандарта с концентрацией 5,0 г/дм 3 Построение градуировочной зависимости, расчет коэффициента аппроксимации R 2 (проверка точности построения градуировочной зависимости) и расчет концентрации определяемого вещества обычно проводится с помощью программного обеспечения, поставляемого с хроматографом. Спектрофотометрический метод количественного определения этиленгликоля основан на окислении его до формальдегида и последующим определением формальдегида по реакции образования окрашенного соединения с хромотроповой кислотой. 340 |