1 Жебентяев Александр Ильич
 Скачать 5.46 Mb.
|
|
10.1.1. Методы обнаружения монооксида углерода Обнаружение СО в крови проводят непосредственно, без предварительного изолирования. Используют спектроскопические, спектрофотометрические, газохроматографические, химические и другие методы. Спектроскопический метод обнаружения монооксида углеродаоснован на способности оксигемоглобина под действием дитионита натрия восстанавливаться до дезоксигемоглобина, для которого характерна одна широкая полоса поглощения. Кровь предварительно разбавляют водой и наблюдают с помощью микроспектроскопа (спектроскоп, соединенный с окуляром) две полосы поглощения в желтой и зеленой частях спектра между линиями Фраунгофера D и E. После добавления дитионита натрия (Na 2 S 2 O 4 ) к исследуемой крови оксигемоглобин превращается в дезоксигемоглобин (видна одна широкая полоса поглощения). Для крови, содержащей карбоксигемоглобин, также характерны две полосы, однако при добавлении восстановителей эти полосы поглощения не исчезают. Спектрофотометрический метод обнаружения монооксида углерода в крови. В крови лиц, отравленных СО, имеются как оксигемоглобин, так и карбоксигемоглобин. Кровь разбавляют до тех пор, пока раствор приобретет светло-розовую окраску. Спектр оксигемоглобина имеет две полосы поглощения: 577–589 и 536–556 нм; карбоксигемоглобина – при 564–579 и 523–546 нм. При добавлении (NH 4 ) 2 S или Na 2 S 2 O 4 (дитионит) оксигемоглобин превращается в дезоксигемоглобин, который имеет одну полосу – 546– 596 нм. Карбоксигемоглобин (COHb) не восстанавливается при добавлении сульфида аммония или дитионита и полосы поглощения карбоксигемоглобина не исчезают. Для обнаружения COHb в крови спектофотометрическим методом снимают спектр поглощения крови, разбавленной и обработанной дитионитом. При наличии COHb в крови – в спектре поглощения наблюдаются 2 максимума, при отсутствии COHb – один максимум. Метод малочувствителен, применяется при содержании 10–30% COHb. 366 Глава 10. Вещества, определяемые непосредственно в биологическом материале Химические методы обнаружения монооксида углерода Эти методы основаны на том, что кровь, содержащая COHb, не изменяет или незначительно изменяет свою окраску от прибавления определенных реактивов, а не содержащая COHb – значительно изменяет окраску. 1 . Проба Гоппе-Зейлера (после прибавления равного объема 30%- го раствора NaOН кровь с COHb остается красной, а не содержащая COHb – буреет). 2 . Проба Бюркера (5 мл крови разбавляют водой до 500 мл. К 5– 10 мл полученного раствора прибавляют 5 капель 1%-го раствора гексацианоферрата (III) калия K 3 [Fe(CN) 6 ]). Кровь, не содержащая COHb , становится желтоватой. 3. Проба Сальковского-Катаяма. К 10 мл дистиллированной воды прибавляют 5 капель исследуемой крови и 5 капель свежеприготовленного раствора сульфида аммония и взбалтывают. Затем прибавляют 30%-й раствор уксусной кислоты и взбалтывают – кровь, не содержащая карбоксигемоглобин, становится серо-зеленой. 4. Проба Сидорова. 1 мл крови разбавляют дистиллированной водой до 10 мл. К 2 мл полученного раствора прибавляют по 3–5 капель 20%-го раствора гексацианоферрата (III) калия и 0,01% раствора дихромата калия. Кровь, не содержащая карбоксигемоглобин, приобретает коричневато- зеленоватую окраску. 5. Проба Либмана. К 5 мл крови прибавляют 5 мл формалина и взбалтывают. Кровь, не содержащая карбоксигемоглобин, приобретает коричневато-черную окраску. 6. Проба Рубнера. К 5 мл крови прибавляют 20 мл 5%-го раствора основного ацетата свинца и взбалтывают в течение 1 мин. Кровь, не содержащая карбоксигемоглобин, становится коричневатой. 7. Проба Залесского. 1 мл крови разбавляют дистиллированной водой до 100 мл и взбалтывают. К 5 мл полученного раствора прибавляют 5 капель 10%- го раствора сульфата меди и взбалтывают. Кровь, не содержащая карбоксигемоглобин, приобретает зеленоватую окраску. 8. Проба Кинкеля-Венцеля. К 5 мл раствора крови, разбавленной дистиллированной водой в 5 раз, прибавляют 15 мл 3%-го раствора таннина и взбалтывают. Из крови, не содержащей карбоксигемоглобин, выпадает серовато- коричневый осадок. 367 Глава 10. Вещества, определяемые непосредственно в биологическом материале Обнаружение монооксида углерода методом микродиффузии Во внешнюю камеру прибора для микродиффузии помещают 1 мл крови и 1 мл 10%-го раствора серной кислоты. Во внутреннюю камеру вносят 2 мл 0,1%-го раствора хлорида палладия в 0,1 М растворе хлороводородной кислоты. Прибор закрывают крышкой и через 1 час при наличии монооксида углерода в крови во внутренней камере появляется серебристая пленка металлического палладия: PdCl 2 + CO + H 2 O → Pd + 2HCl + CO 2 (10.2) 10.1.2. Методы количественного определения монооксида углерода Количественное определение монооксида углерода проводят спектрофотометрическим и газохроматографическим методами. Спектрофотометрический метод определения монооксида углерода Определение содержания монооксида углерода в крови проводят по количеству карбоксигемоглобина. Монооксид углерода в крови связывается с окси- и дезоксигемоглобином с образованием карбоксигемоглобина. Метгемоглобин с монооксидом углерода не взаимодействует, но в лабораторных условиях метгемоглобин при помощи восстановителей (дитионит натрия) можно перевести в дезоксигемоглобин. Дитионит натрия (Na 2 S 2 O 4 ·2H 2 O) – один из самых сильных восстановителей, в некоторых литературных источниках этот реактив встречается под названием «дитионат», хотя дитионат натрия (Na 2 S 2 O 6 ) не обладает восстановительными свойствами. Спектральные характеристики оксигемоглобина и карбоксигемоглобина трудно использовать для количественного определения, так как спектры поглощения оксигемоглобина и карбоксигемоглобина незначительно различаются. Значительно отличаются друг от друга спектры поглощения карбоксигемоглобина и дезоксигемоглобина. Предложено несколько вариантов спектрофотометрического определения карбоксигемоглобина в крови. Сущность спектрофотометрического метода определения карбоксигемоглобина в крови, описанного в методических указаниях (МУ «Определение карбоксигемоглобина в крови», ГС МСЭ, Минск, 2008 г) состоит в том, что с помощью спектрофотометра регистрируют максимумы поглощения тех форм гемоглобина, которые в больших количествах находятся в растворе. 368 Глава 10. Вещества, определяемые непосредственно в биологическом материале 100 A A A A % HbCO, 583 B 531 B 583 A 531 A ⋅ − − = Выполнение определения карбоксигемоглобина в крови. Исследуемую кровь разбавляют 0,1% раствором аммиака (к 0,5 мл крови в колбе вместимостью 100 мл прибавляют 0,1% раствор аммиака до метки) – в этом растворе могут быть оксигемоглобин, дезоксигемоглобин и карбоксигемоглобин. К части этого раствора прибавляют дитионит натрия (3,5 мг) – в этом растворе может содержаться карбоксигемоглобин и дезоксигемоглобин (раствор А). Измеряют оптическую плотность этого раствора при 531 нм и 583 нм. Затем 10–30 мл этого раствора насыщают монооксидом углерода в приборе для получения монооксида углерода (рис. 10.1) в течение 10 мин, добавляют 3–5 мг дитионита натрия и снова насыщают монооксидом углерода в течение 5 мин (раствор В). Измеряют оптическую плотность раствора В при 531 нм и 583 нм и рассчитывают содержание карбоксигемоглобина в крови по формуле: (10.3) где А 531 A 531 и A 583 A – оптические плотности раствора А при длинах волн 531 нм и 583 нм; А 531 B и А 583 B – оптические плотности раствора В. Рис.10.1. Аппарат для насыщения крови монооксидом углерода. 369 Глава 10. Вещества, определяемые непосредственно в биологическом материале 1 – колба, содержащая концентрированную серную кислоту; 2 – делительная воронка, содержащая муравьиную кислоту; 3 – 6 − склянки Дрекселя: склянка 3 содержит раствор гидроксида натрия; склянка 5 – анализируемый раствор; склянки 4, 6 – дистиллированную воду, 7 – отводная трубка. Методика определения карбоксигемоглобина в крови, описанная в учебнике «Токсикологическая химия» (Крамаренко В.Ф., 1989г, с.419–423) отличается длинами волн, при которых проводят измерение оптической плотности растворов крови до насыщения и после насыщения монооксидом углерода. Выполнение определения карбоксигемоглобина (по В.Ф. Крамаренко). Для приготовления раствора А 1 мл исследуемой крови вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и разбавляют фосфатным буферным раствором (рН = 7,38). Часть этого раствора вносят в кювету с толщиной слоя 1 см, прибавляют 3–4 мг дитионита натрия и содержимое кюветы перемешивают стеклянной палочкой (карбоксигемоглобин с дитионитом не реагирует, а оксигемоглобин и метгемоглобин восстанавливаются до дезоксигемоглобина). Измеряют оптическую плотность при 538 и 550 нм. Раствор В готовят в приборе для получения монооксида углерода и насыщения крови монооксидом углерода. В реакционную колбу 1 вносят 50 мл концентрированной серной кислоты, а в капельную воронку 2–10 мл муравьиной кислоты. В склянках Дрекселя находятся 10%-й раствор гидроксида натрия, дистиллированная вода, раствор А, в таких количествах, чтобы трубки были погружены на 2 см в жидкость. Для увеличения скорости выделения СО колбу в начале опыта осторожно нагревают на небольшом пламени газовой горелки. Муравьиную кислоту по каплям приливают в подогретую колбу. Получение СО и насыщение крови монооксидом углерода должно проводиться в вытяжном шкафу. После пропускания СО в течение 15 мин через склянки Дрекселя отсоединяют склянку 5, в которую добавляют 5–7 г дитионита натрия (жидкость хорошо взбалтывают) и еще 5 мин пропускают монооксид углерода. Такая методика обусловлена тем, что в течение 15 мин оксигемоглобин полностью превращается в карбоксигемоглобин, но остается некоторое количество метгемоглобина, который с помощью дитионита натрия переводят в дезоксигемоглобин, а затем в карбоксигемоглобин. 370 Глава 10. Вещества, определяемые непосредственно в биологическом материале Измерение оптической плотности приготовленного раствора В проводят в кювете спектрометра с толщиной слоя жидкости 1 см при длине волны 538 нм. Аналитические длины волн 538 и 550 нм выбраны в соответствии со спектрами поглощения карбоксигемоглобина и дезоксигемоглобина (рис. 10.2). При длинах волн 550, 565 и 580 нм наблюдаются три изобестические точки (оптические плотности одинаковые). Длина волны 538 нм соответствует наибольшей разнице значений оптических плотностей растворов карбоксигемоглобина и дезоксигемоглобина. Расчет содержания карбоксигемоглобина в исследуемой крови в процентах проводят по формуле: К А 100 ) А (А 100 % HbCO, 2 1 3 ⋅ ⋅ − − = (10.4) где А 3 – оптическая плотность раствора В крови при 538 нм; А 2 – оптическая плотность раствора А крови при 550 нм; А 1 – оптическая плотность раствора А крови при 538 нм; К – коэффициент 0,372. Коэффициент (К) может иметь другие значения, если максимумы спектров поглощения дезокси- и карбоксипроизводных гемоглобина не будут совпадать с максимумами спектров поглощения карбоксигемоглобина (541, 571 нм) и дезоксигемоглобина (557 нм). В этом случае расчет коэффициента (К) проводят по формуле: (10.5) где А HbCO – оптическая плотность раствора крови, дополнительно насыщенного монооксидом углерода; А Hb И – оптическая плотность раствора крови в изобестической точке; А Hb – оптическая плотность раствора крови, обработанного дитионитом натрия, содержащего дезоксигемоглобин. Для определения коэффициента К берут донорскую кровь, которая не подвергалась воздействию монооксида углерода. HbИ Hb HbCO А А А К − = 371 Глава 10. Вещества, определяемые непосредственно в биологическом материале Рис. 10.2.Спектры поглощения карбоксигемоглобина (1) и дезоксигемоглобина (2). Известны и другие методики спектрофотометрического определения карбоксигемоглобина в крови. Например, методика спектрофотометрического определения карбоксигемоглобина в крови, основанная на измерении оптической плотности трех растворов (А, В и С) исследуемой крови (второй и третий растворы насыщают монооксидом углерода и кислородом до 100% содержания карбоксигемоглобина и оксигемоглобина соответственно). Затем растворы обрабатывают дитионитом натрия и измеряют оптические плотности при 540 и 579 нм (изобестическая точка). Рассчитывают отношение А 540 и А 579 для трех растворов и полученные значения подставляют в формулу для расчета содержания карбоксигемоглобина в крови: 100 R R R R % HbCO, C B С A ⋅ − − = (10.6) где R A , R B , R C – отношение оптических плотностей при 540 и 579 нм для растворов А, В и С. 372 Глава 10. Вещества, определяемые непосредственно в биологическом материале Газохроматографическое определение монооксида углерода Сущность газохроматографического определения монооксида углерода состоит в том, что содержащийся в крови карбоксигемоглобин разрушается под воздействием серной кислоты, и монооксид углерода переходит в парогазовую фазу, которую вводят в хроматографическую колонку. В хроматографической колонке разделенные компоненты смеси поступают в детектор по теплопроводности. Хроматографические пики идентифицируют путем сравнения параметров удерживания с табличными параметрами, полученными при анализе модельных смесей. Условия газохроматографического анализа: температура термостата колонки – 80 ºС, температура инжектора – 100 ºС, температура детектора по теплопроводности – 140 ºС, объем вводимой пробы – 0,2–1,0 см 3 (в зависимости от модели хроматографа), расход гелия через колонку – 30–40 см 3 /мин, ориентировочное время удерживания кислорода – 83 с, азота – 114 с, монооксида углерода – 240 с. Газохроматографическое исследование крови проводится в том случае, если по результатам спектрофометрического определения монооксида углерода в крови получено 20% и более, а результаты химических реакций сомнительные или отрицательные. Предложены и другие методики хроматографического определения монооксида углерода (Сотников Е.Е., 1971): кровь, содержащую монооксид углерода, нагревают, парогазовую фазу вводят в хроматограф. Монооксид углерода в присутствии катализатора (никель) восстанавливается до метана, который регистрирует пламенно-ионизационный детектор. Разработана методика газохроматографического определения СО в крови, основанная на адсорбции ее серебряными формами цеолита. При нагревании цеолита сорбированный СО десорбируется и определяется методом газовой хроматографии (детектор по теплопроводности). Сравнение со спектрофотометрическим методом дало хорошее совпадение результатов. Судебно-медицинская оценка результатов количественного определения карбоксигемоглобина. Наиболее надежным диагностическим признаком отравления СО являются результаты судебно-химического исследования. Физиологическая норма содержания СOHb в крови – 1,5–3%, верхняя граница нормы – 10%. 10–20% – легкая головная боль, расширение кожных кровеносных сосудов; 20–30% – головная боль, ощущение пульса в висках; 373 Глава 10. Вещества, определяемые непосредственно в биологическом материале 30–40% – сильная головная боль, слабость, головокружение, туман перед глазами, тошнота, рвота; 40–50% – те же симптомы, учащение дыхания и пульса; 50–60% – учащение дыхания, пульса, судороги, может наступить смерть; 60–70% – то же, ослабление дыхания и сердечной деятельности; 70–80% – слабый пульс, замедление дыхания, остановка дыхания и смерть. Такое соответствие между концентрацией HbCО и тяжестью отравления имеется не всегда. Эти данные приблизительны. Тяжесть отравления зависит от внешних условий (давление, влажность воздуха, температура) и особенностей организма (возраст, пол). Тяжесть отравления усиливается при низком барометрическом давлении, повышенной влажности воздуха, высокой или низкой температуре воздуха, при усиленной мышечной работе. Острое отравление проходит тяжелее у лиц, страдающих заболеваниями сердца, легких, с нарушениями кровообращения, перенесших черепно-мозговую травму, во время инфекционных заболеваний. Известны атипичные формы отравления, протекающие с быстрой потерей сознания и тяжелыми расстройствами дыхания и сердечной деятельности. Оказание первой помощи: вынести на свежий воздух, искусственное дыхание. 374 ГЛОССАРИЙ Анамнез – совокупность сведений о больном и его заболевании, полученных путем опроса самого больного и (или) знающих его лиц и используемых для установки диагноза, выбора оптимальных методов лечения болезни. Анамнез является одним из основных методов клинического обследования больного. Аналитический сигнал − появление или изменение окраски, выпадение осадка, появление линии в спектре и т.д. В количественном анализе аналитическим сигналом служит среднее из измерений физической величины (сила тока, потенциал, оптическая плотность, интенсивность излучения и т.д.). Абсорбент – твердый или жидкий сорбент, растворяющий в своем объеме газы, пары или компоненты жидких смесей. Адсорбент – твёрдый сорбент, концентрирующий на своей поверхности растворённые вещества. Антагонист – агент, снимающий или ослабляющий фармакологическое действие другого агента. Антидетонатор – вещество, (например, тетраэтилсвинец), применяемое для предупреждения возгорания (детонации) в двигателях внутреннего сгорания. |