Методы аналитической биохимии. 1. Правила проведения работ в лаборатории при проведении биохимического анализа с использованием лабораторных животных
 Скачать 1.66 Mb.
|
37. Качественный и количественный хроматографический анализ.Задачей качественного хроматографического анализа является расшифровка хроматограмм или, иначе говоря, идентификация пиков на хроматограмме. Для этого используют следующие методы. Метод стандартных соединений. Этот метод основан на введении в анализируемую смесь стандартных веществ, присутствие которых в ней предполагается. Совпадение времен удерживания является основанием для отождествления пика анализируемой смеси со стандартным соединением. Однако это условие является только необходимым, но не достаточным для идентификации: одно и то же (или очень близкое) время удерживания могут иметь несколько веществ, а не одно. Для увеличения достоверности анализа подобные исследования проводят, используя колонки с различными по природе неподвижными фазами. Метод сравнения с табличными данными. Качественный состав анализируемой смеси в этом методе устанавливают, сопоставляя экспериментально определенные относительные объемы удерживания веществ (при стандартных условиях анализа) с аналогичными табличными значениями. Для повышения надежности хроматографической идентификации анализ проводят, используя данные, полученные с фазами, различными по своей природе. Расчетные методы и корреляционные соотношения. В тех случаях, когда в таблицах времен удерживания отсутствуют данные для отдельных соединений, используют корреляционные соотношения между логарифмом величин удерживания и свойствами анализируемых соединений (например, числом углеродных атомов, температурой кипения и т. п.). Важный этап - количественная интерпретация хроматограмм, в результате проведения которой определяют содержание компонентов в анализируемой смеси. Точность анализа определяется факторами: выбранным методом анализа, характеристиками используемого детектора, методом калибровки и расчета, а также природой анализируемых компонентов. Количество вещества в хроматографической зоне пропорционально площади хроматографического пика на хроматограмме. Существует несколько методов определения площади хроматографических пиков, основанных на предположении, что форма пика отвечает кривой Гаусса. Чаще всего ее определяют как произведение высоты пика h на его ширину на половине высоты dQ5:  Имеется и более общее уравнение, позволяющее рассчитать площади лишь частично разделенных пиков. Следует проводить калибровку детектора в выбранных условиях анализа. Обычно применяют следующие методы калибровки: Метод абсолютной калибровки. В этом методе экспериментально определяют для каждого компонента анализируемой смеси зависимость площади хроматографического пика от абсолютного его количества в пробе. Эту зависимость обычно представляют в виде графика или эмпирического уравнения. Необходимо отметить, что абсолютная калибровка должна периодически проверяться и корректироваться. При повторных калибровках можно ограничиться проверкой нескольких точек на градуировочной кривой. Метод внутреннего стандарта. В этом методе в анализируемую смесь вводят вещество (внутренний стандарт) с известной концентрацией Сс. Предварительно для каждого вещества смеси получают калибровочный график (или уравнение), связывающие SB/SC с Св/Сс, где SB и Sc — площади пиков анализируемого вещества и внутреннего стандарта, Св — концентрация анализируемого вещества в калибровочной смеси. При проведении анализа на хроматограмме определяют площади пиков анализируемых веществ и внутреннего стандарта, вычисляют их отношение и по калибровочному графику находят Св/Сс. Далее по известной Сс рассчитывают неизвестные концентрации веществ Св. Использование метода внутреннего стандарта позволяет существенно увеличить точность измерений и делает ненужной периодическую коррекцию калибровочного графика. Действительно, изменение условий эксперимента в одинаковой степени сказывается на изменении параметров хроматограммы стандартного вещества и компонентов пробы. Другое преимущество метода состоит в том, что соблюдение точного объема анализируемой пробы уже не является необходимым. Для повышения точности анализа желательно, чтобы вещество, используемое в качестве стандарта, было близко к определяемым компонентам по величине удерживания и содержанию в анализируемой смеси. |