ответы микра. Экзаменационные вопросы по дисциплине микробиология, вирусология
 Скачать 0.55 Mb.
|
Основы систематики вирусовВирусы классифицируют по типу нуклеиновой кислоты, размеру и форме вириона, наличию или отсутствию суперкапсида, антигенным различиям. В систематике вирусов используют такие таксономические категории, как семейство, подсемейство. Зрелая вирусная частица называется вирионом. Размеры вирионов варьируют от 20 нм (вирус полиомиелита) до 350 нм (вирус натуральной оспы). Форма вирионов может быть различной (рисунок 1): палочковидной (вирус табачной мозаики), в виде пули (вирус бешенства), сферической (вирусы гриппа, полиомиелита, ВИЧ), в форме многогранника (аденовирусы). Молекулярно-генетическая организация вирусов. Вирус (вирион) устроен следующим образом: в центре ДНК или РНК, вокруг нее белковая оболочка – капсид (от лат. capsa – футляр), состоящая из отдельных субъединиц (капсомеров). Нуклеиновая кислота вируса, заключенная в капсид, называется нуклеокапсидом. Формы вирусных частиц зависят от того, как сгруппированы капсомеры вокруг нуклеиновой кислоты. Только нуклеокапсид имеют просто устроенные вирусы (вирус полиомиелита, аденовирусы). Сложно устроенные вирусы имеют вторую, суперкапсидную оболочку – пеплос, состоящую из пепломеров (вирус гриппа, бешенства). Суперкапсидная оболочка состоит из 2-х слоев липидов и заключенных в них белков, которые выступают на поверхности вирусов в виде шипов и выполняют роль рецепторов для адсорбции на поверхности клеток хозяина. Наличие в суперкапсиде липидов определяет чувствительность вирусов к эфиру. 30. Репродукция вирусов. Особенности репродукции ДНК- и РНК-содержащих вирусов. Репродукция (размножение) вирусов. Особенности репродукции ДНК- и РНК-содержащих вирусов. Вирусы могут размножаться в цитоплазме или ядре клетки-хозяина и отличаются разобщенным способом репродукции: в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и вирусные белки, а затем происходит их сборка (композиция) в зрелые вирусные частицы. Фазы взаимодействия вируса с клеткойАдсорбция вируса на клетке. В основе этого процесса лежит взаимодействие вирусных рецепторов со специфическими рецепторами клеток макроорганизма. Проникновение вируса в клетку: через слияние суперкапсида вируса с мембраной клетки. В результате этого слияния в цитоплазму клетки попадает только нуклеокапсид, а суперкапсидная оболочка остается на поверхности клетки; путем эндоцитоза (пиноцитоза) с последующим освобождением вируса от суперкапсида в цитоплазме клетки. Депротеинизация вируса – освобождение нуклеиновой кислоты от капсидной оболочки. Синтез нуклеиновой кислоты и вирусных белков: для РНК-содержащих вирусов: на РНК вируса, как на матрице, с помощью фермента «РНК-зависимая РНК-полимераза» происходит многократная репликация вирусной РНК для новых вирусных частиц. Так как вирусная РНК аналогична клеточной м-РНК, она транслируется (перемещается) на рибосомы хозяина, в результате чего синтезируются структурные белки оболочек вируса (рисунок 2); для ДНК-содержащих вирусов: на ДНК вируса, как на матрице, с помощью фермента «ДНК-зависимая ДНК-полимераза» происходит многократная репликация вирусной ДНК для новых вирусных частиц. Кроме того, на ДНК вируса под действием фермента «ДНК-зависимая РНК-полимераза» запускается синтез м-РНК, которая транслируется на рибосомы клеткихозяина для синтеза структурных белков оболочек вируса (рисунок 3). Композиция вирусных частиц. Формируются зрелые вирусы. Выход вирусов из клетки. 31. Типы вирусной инфекции на уровне клетки. Продуктивная: взрывной механизм: после репродукции вируса из погибающей клетки одновременно выходит большое количество вирионов. Такой тип инфекции характерен для простых вирусов; почкование: после репродукции вирусного нуклеокапсида происходит его контакт с определенным участком клеточной мембраны, выпячивание и отпочковывание вириона, покрытого мембраной, от клетки. Такой тип инфекции характерен для сложных вирусов. При этом клетка способна длительно сохранять жизнеспособность. Она становится источником вирусной инфекции для здоровых клеток, постоянно продуцируя вирусные частицы почкованием. Абортивная: не завершается образованием вирусного потомства и гибелью клетки. Это обусловлено либо дефектностью самого вируса, либо генетической резистентностью клетки к данному вирусу. Интегративная: не приводит к гибели клеток. При этой форме инфекции вирусная ДНК встраивается в геном клетки-хозяина и в последующем при делении передается дочерним клеткам. В зависимости от типа вирусной нуклеиновой кислоты различают два варианта интегративной инфекции: для ДНК-содержащих вирусов: происходит интеграция ДНК вируса с ДНК клетки-хозяина; для РНК-содержащих вирусов: на вирусной РНК под действием фермента «РНК-зависимая ДНК-полимераза» (обратная транскриптаза или ревертаза) синтезируется ДНК. Затем образовавшаяся вирусная ДНК интегрируется с ДНК клетки-хозяина. В результате интегративной инфекции возможно превращение (трансформация) нормальных клеток в опухолевые. Интегративная инфекция характерна для онкогенных (опухолевых) вирусов и умеренных бактериофагов. 32. Интегративная вирусная инфекция. Вирусо-генетическая теория онкогенеза Л.А.Зильбера. Основные онкогенные вирусы. В 50-х годах XX столетия Л.А. Зильбер сформулировал вирусо-генетическую теорию, согласно которой вирусная ДНК интегрирует с ДНК клеткихозяина, что приводит к трансформации нормальных клеток в опухолевые. Механизм интегративной инфекции для РНК-содержащих онкогенных вирусов был выяснен намного позже, после открытия фермента «обратная транскриптаза» (см. выше). Последующие исследования выявили новые данные о роли ДНК- и РНК-содержащих вирусов в онкогенезе. В геноме нормальных клеток существуют клеточные онкогены (протоонкогены). Они находятся в неактивном состоянии и кодируют белки, стимулирующие размножение клеток во время эмбрионального развития, а также контролирующие рост и размножение клеток во взрослом состоянии, когда в этом есть необходимость. Онкогенез для ДНК-содержащих вирусов Некоторые ДНК-содержащие вирусы имеют онкогены, сходные с человеческими. Функции вирусных онкогенов разнообразны и при интеграции ДНК вируса в геном клетки человека они могут нарушать синтез нормальных факторов размножения клетки на разных этапах. Итогом таких взаимодействий является избыточное размножение клетки и деление ее в незрелом состоянии. Так формируется опухоль. Онкогенез для РНК-содержащих вирусов РНК-содержащие вирусы, способны индуцировать онкогенез, выступая в роли канцерогенных факторов. На вирусной РНК с помощью собственного фермента «РНК-зависимая ДНК-полимераза» (обратная транскриптаза) синтезируются ДНК. Затем вирус встраивает в геном клетки свою ДНК-копию рядом с клеточным онкогеном и вызывает повышение его активности. Это приводит к злокачественной трансформации клетки. Основные онкогенные вирусы, вызывающие опухоли у человека. ДНК-содержащие: семейство Papillomaviridae: вирусы папилломы человека – вызывают рак кожи, рак шейки матки; семейство Herpesviridae: вирус простого герпеса II типа – вызывает рак шейки матки, рак простаты; вирус Эпштейна-Барр – вызывает рак носоглотки (назофарингеальный рак) и лимфому Беркитта (лимфоидную опухоль верхней челюсти); герпесвирус 8 типа – вызывает саркому Капоши; семейство Hepadnaviridae: вирус гепатита В – вызывает первичный рак печени. РНК-содержащие: семейство Retroviridae: лимфотропные вирусы – вызывают Т-клеточные лимфомы, Т-клеточный лейкоз и др.; вирус гепатита С – вызывает рак печени. 3  3. Методы культивирования вирусов.Индикацию вирусов, культивируемых в культуре клеток, можно проводить по их цитопатогенному действию (ЦПД) на клетки (рисунок 5). Это действие выражается в повреждении монослоя зараженной культуры клеток и изменении их морфологии: клетки округляются, темнеют, теряют отростки, в них появляется зернистость. Эти изменения обозначают термином «дегенерация клеток». В дальнейшем происходит отслойка клеток от стекла – нарушение монослоя. Используют для индикации аденовирусов. Индикацию вирусов, культивируемых в организме лабораторных животных, проводят по факту гибели животного. Используют для индикации вируса бешенства. 34. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Молекулярно-биологический: обнаружение специфических участков вирусной нуклеиновой кислоты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Теоретически данный метод позволяет обнаружить участок одной молекулы вирусной ДНК или РНК в любом образце биологического материала. Принцип ПЦР: многократное образование (гибридизация) копий специфического участка нуклеиновой кислоты вируса с последующей их идентификацией методом электрофореза. Определение вирусных антигенов (экспресс-диагностика): вирусные антигены определяют в крови и других биологических жидкостях с помощью серологических реакций, чаще это РИФ и ИФА (см. учебно-методическое пособие «Учение об инфекции и иммунитете. Основы иммунологии»). Вирусологический: заражение исследуемым материалом биологической модели (куриный эмбрион, культура клеток, организм животного) с последующей индикацией, а затем идентификацией обнаруженных вирусов. Для размножения вирусов в курином эмбрионе исследуемый материал вводят в аллантоисную или амниотическую полость (культивируют вирусы гриппа, эпидемического паротита и др.). Для размножения вирусов в культуре клеток исследуемым материалом заражают живые клетки различного происхождения: эмбриональные, нормальных тканей, опухолевые (культивируют вирусы полиомиелита, аденовирусы и др.). Для размножения вирусов в организме лабораторных животных используют белых мышей (культивируют вирусы бешенства, клещевого энцефалита). Помимо диагностики вирусных инфекций, культивирование вирусов проводят с целью получения вакцинных и диагностических препаратов. Вирусоскопический: обнаружение в исследуемом материале включений, образующихся в пораженных клетках при вирусной инфекции. Включения представляют собой скопления вирусов и продуктов реакции клетки на вирусную инфекцию. Включения могут располагаться в цитоплазме или в ядре клетки-хозяина. Чаще внутрицитоплазматические включения образуют РНКсодержащие вирусы (например, включения Бабеша-Негри при бешенстве). Внутриядерная локализация включений в большей степени характерна для ДНК-содержащих вирусов (например, включения при цитомегаловирусной инфекции). В мазках видны гигантские клетки с внутриядерными включениями вирусов, напоминающие «совиный глаз» (рисунок 4). Серологический: определение противовирусных антител в сыворотке крови больного. Особенностью серологического метода диагностики вирусных инфекций является исследование парных проб сыворотки. Первую пробу сыворотки берут у больного в начале заболевания, а вторую – через 10-14 дней. О вирусной инфекции свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра антител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностически значимой является сероконверсия для взрослых в 4 раза, а для детей – в 2 раза. 35. Вирусологический метод диагностики. Методы индикации и идентификации вирусов. Индикацию (обнаружение) вирусов в материале от больного проводят различными способами. Они зависят от метода культивирования вируса: Если вирус способен размножаться в курином эмбрионе, то для его обнаружения используют реакцию гемагглютинации (РГА). Она основана на способности таких вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты с помощью фермента «гемагглютинина», расположенного в суперкапсиде вируса. В результате реакции in vitro наблюдается осадок эритроцитов в виде «перевернутого зонтика» – это положительный результат РГА. При отрицательной реакции – выпадает осадок эритроцитов с ровными краями. Используют для индикации вирусов гриппа. Индикацию вирусов, культивируемых в культуре клеток, можно проводить по их цитопатогенному действию (ЦПД) на клетки (рисунок 5). Это действие выражается в повреждении монослоя зараженной культуры клеток и изменении их морфологии: клетки округляются, темнеют, теряют отростки, в них появляется зернистость. Эти изменения обозначают термином «дегенерация клеток». В дальнейшем происходит отслойка клеток от стекла – нарушение монослоя. Используют для индикации аденовирусов. Индикацию вирусов, культивируемых в организме лабораторных животных, проводят по факту гибели животного. Используют для индикации вируса бешенства. Методы идентификации вирусов Идентификацию вирусов проводят по антигенным свойствам с помощью серологических реакций со специфическими диагностическими противовирусными сыворотками. Основными реакциями являются: реакция торможения гемагглютинации, реакция нейтрализации в культуре клеток или в организме животного, реакция иммунофлюоресценции (РИФ) и иммуноферментный анализ (ИФА). Реакция торможения гемагглютинации (РТГА): 2-компонентная, сложная серологическая реакция. Компоненты реакции: исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг), типовые противовирусные диагностические сыворотки (Ат). Индикатор реакции: 1% взвесь эритроцитов. Постановка реакции: готовят разведения диагностических сывороток в лунках полистироловой пластины. К ним добавляют вируссодержащую жидкость и оставляют на 30-40 минут при комнатной температуре. Затем в лунки вносят взвесь эритроцитов. Учет реакции проводят через 1-2 часа. Положительная реакция: тип вируса соответствует типу сыворотки. Вирусный гемагглютинин блокируется антителами сыворотки, поэтому агглютинация эритроцитов отсутствует. Визуально в лунках определяется осадок эритроцитов с ровными краями, в виде «пуговицы». Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки. Вирусный гемагглютинин склеивает эритроциты. Визуально в лунках определяется осадок эритроцитов с неровными краями в виде «перевернутого зонтика». РТГА применяют для идентификации вирусов гриппа и других вирусов, имеющих в суперкапсидной оболочке фермент гемагглютинин. Реакция нейтрализации (РН) в культуре клеток: 2-компонентная, сложная серологическая реакция. Компоненты реакции: исследуемая вируссодержащая жидкость (Аг), типовые противовирусные диагностические сыворотки (Ат). Индикатор реакции: культура клеток. Постановка реакции: вируссодержащую жидкость смешивают в пробирках со специфическими диагностическими сыворотками. Оставляют на 1 час при комнатной температуре. Затем содержимым пробирок заражают культуры клеток во флаконах. Положительная реакция: тип вируса соответствует типу сыворотки. Происходит нейтрализация вируса антителами сыворотки и культура клеток остается нормальной, без изменений. Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки. Вирус оказывает цитопатогенное действие, что приводит к дегенерации культуры клеток. РН в культуре клеток применяют для идентификации вирусов полиомиелита, аденовирусов и др. РН можно также использовать для идентификации вирусов, культивируемых в организме лабораторных животных. Компоненты и постановка реакции такие же, как в РН в культуре клеток. Индикатор реакции: лабораторное животное (в частности, белые мыши). Положительная реакция: тип вируса соответствует типу диагностической сыворотки, происходит его нейтрализация антителами сыворотки и животное остается здоровым. Отрицательная реакция: тип вируса не соответствует типу сыворотки, животное погибает. РН в организме животного используется для идентификации вирусов бешенства. В таблице 2 представлены обобщенные данные о методах культивирования, индикации и идентификации вирусов. 36. Особенности противовирусного иммунитета. Интерфероны (гликопротеины) продуцируются клетками при вирусной инфекции. Являются первой, наиболее ранней линией защиты (через несколько часов после начала размножения вируса). Основными клетками, осуществляющими в организме противовирусный иммунологический надзор, являются ЦТЛ и NK-клетки. Они разрушают инфицированные вирусом клетки с помощью перфоринов и гранзимов. Т-лимфоциты и интерфероны приводят организм к выздоровлению, но не формируют приобретенного иммунитета. Противовирусные антитела (секреторные IgA и сывороточные IgM и G) защищают только при внеклеточном расположении вирусов. Окружая вирионы, они препятствуют их адсорбции на клетке. Гуморальное звено защиты формирует приобретенный (постинфекционный) иммунитет за счет клонов клеток памяти из В-лимфоцитов. Развитие вирусной инфекции всегда подавляет некоторые защитные механизмы (незавершенность фагоцитоза, подавление синтеза молекул MHC I класса на поверхности зараженных клеток, подавление активации комплемента по классическому и альтернативному пути и т.д.). 37. Интерфероны. Классификация. Механизм действия. Практическое применение. Интерфероны – гликопротеины, которые вырабатываются многими клетками организма. Однако эта способность наиболее выражена у лейкоцитов, фибробластов и лимфоцитов. Интерфероны (ИФ) являются цитокинами, подавляющими размножение вирусов, определенных бактерий и некоторых раковых клеток. По природе клеток, вырабатывающих ИФ, их делят на три группы: α-ИФ (лейкоцитарный): обладает выраженным противовирусным действием; β-ИФ (фибробластный): обладает противовирусным действием, а также регулирует работу лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (иммуномодулирующее действие); γ-ИФ (иммунный): продуцируется всеми Т-лимфоцитами, стимулирует активность Т- и В-лимфоцитов, фагоцитов, усиливает синтез молекул MHCI и MHCII и др. Таким образом, γ-ИФ усиливает активность всех звеньев иммунной системы. Механизм противовирусного действия интерферонов. Интерфероны ингибируют внутриклеточную репликацию широкого спектра ДНК- и РНК-содержащих вирусов. В инфицированной клетке синтезируется ИФ, выходит из нее, связывается с поверхностью здоровой клетки и индуцирует в ней синтез антивирусных белков. Если в эту клетку проникает вирус, то его репродукция подавляется этими белками. Один из них является ферментом рибонуклеазой, которая разрушает мРНК вируса. Второй фермент – протеинкиназа – блокирует синтез вирусных белков. Репродукция вируса становится невозможной. Практическое использование интерферона для лечения и профилактики вирусных инфекций связано с использованием препаратов на основе генноинженерного рекомбинантного α2-ИФ. Его получают в культуре бактерий после встраивания в их геном гена человеческого α-ИФ. Рекомбинантный α2-ИФ эффективен для лечения хронических гепатитов В и С, герпетической и папилломавирусной инфекции. 38. Вирусы бактерий (бактериофаги). Вирулентные и умеренные бактериофаги. Фазы взаимодействия фага с бактериальной клеткой. Бактериофаги (от греч. bacterion – бактерии, phagos – пожирающий) – вирусы бактерий, вызывающие их гибель. Бактериофаги были открыты в 1917 г. канадским ученым Ф. Д'Эррелем. Исследователь выделил из испражнений больных дизентерией фильтрующийся агент, способный разрушать, лизировать дизентерийные бактерии. Последующие наблюдения показали, что бактериофаги встречаются повсеместно, где есть бактерии: в почве, сточных водах, кишечном тракте человека и животных, гнойном отделяемом и других субстратах. Поэтому в широком смысле слова их часто называют просто фагами. В зависимости от формы и структурной организации фаги подразделяют на пять морфологических групп (классификация А.С. Тихоненко): I. Фаги I типа – нитевидной формы. Фаги II типа – имеют головку и рудимент отростка. Фаги III типа – имеют головку с коротким отростком. Фаги IV типа – имеют головку и длинный несокращающийся отросток. V. Фаги V типа – имеют головку и длинный сокращающийся отросток. Структура сложноустроенного фага: головка, в которой содержится нуклеиновая кислота; воротничковая часть; отросток, сверху покрытый сократительным чехлом. На конце отростка находятся базальная пластинка и нити прикрепления для адсорбции фага на бактериальной клетке. Оболочечные структуры фага имеют белковую природу. Вирулентные и умеренные бактериофаги. Фазы взаимодействия вирулентного бактериофага с клеткой. Практическое применение бактериофагов. В зависимости от характера взаимодействия с бактериальной клеткой, различают вирулентные и умеренные бактериофаги. Вирулентные фаги способны вызывать взрывную продуктивную инфекцию. Проникнув в бактериальные клетки, они размножаются и вызывают лизис бактерий. Умеренные фаги чаще вызывают интегративную вирусную инфекцию, которая может переходить в продуктивную. Фазы взаимодействия сложноустроенного вирулентного бактериофага с клеткой: Адсорбция (отростковой частью фага) на клеточной стенке бактерий. В эту фазу рецепторы базальной пластинки и нитей прикрепления специфически взаимодействуют с определенными рецепторами клеточной стенки бактерий. На бактериях, лишенных клеточной стенки (L-формы, микоплазмы), фаги не адсорбируются. Проникновение нуклеиновой кислоты фага в клетку: происходит сокращение чехла отростка и растворение с помощью фагового лизоцима небольшого участка клеточной стенки бактерии. Затем ДНК из головки бактериофага через канал отростка инъецируется (впрыскивается) в цитоплазму клетки, при этом оболочка фага остается на поверхности бактериальной клетки. Синтез фаговых частиц (подобно синтезу вирусов в эукариотической клетке): происходит репликация нуклеиновой кислоты бактериофага с образованием множества копий, а на рибосомах бактериальной клетки – синтез фаговых белков головки и отростка. Композиция фаговых частиц: происходит сборка белковых оболочек и нуклеиновых кислот и формируются зрелые бактериофаги. Выход фагов из бактериальной клетки путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется за счет свободного лизоцима, выделяемого множеством фагов, что приводит к гибели бактерий в результате ее осмотического лизиса. Репродукция вирулентного фага в популяции бактерий, выращенных в жидкой питательной среде (МПБ), сопровождается их лизисом и просветлением среды (рисунок 8а). В популяции чувствительных бактерий, выращенных сплошным газоном на плотной питательной среде (МПА), фаги образуют зоны очагового лизиса (рисунок 8б), которые называются «негативными колониями» или стерильными бляшками. Умеренные фаги чаще взаимодействуют с клеткой по типу интегративной вирусной инфекции: ДНК фага интегрируется с ДНК клетки и называется профагом. Став частью хромосомы бактерии, профаг, при ее размножении, передается бактериальному потомству. Клетка, несущая профаг, называется лизогенной. Под влиянием различных факторов (УФ-света, некоторых химических веществ) связь профага с ДНК бактериальной клетки нарушается и профаг переходит в цитоплазму клетки, где размножается и ведет себя как вирулентный. 39. Практическое применение бактериофагов. Для диагностики инфекционных заболеваний используют метод фаготипирования, когда с помощью известного набора фагов определяют фаговариант исследуемых бактерий. Метод основан на специфичности фагов, т.е. способности взаимодействовать только с бактериями, имеющими специфические рецепторы для адсорбции фага и лизиса этих бактерий. Фаготипирование используют для диагностики брюшного тифа, дизентерии, холеры, стафилококковых инфекций (рисунок 9). Метод фаготипирования имеет важное эпидемиологическое значение, т.к. позволяет установить связи между источником инфекции и отдельными случаями заболевания. Выделение бактерий одного фаговарианта от разных больных указывает на общий источник их заражения. Для лечения: стафилококковый бактериофаг (при гнойно-воспалительных заболеваниях, вызванных стафилококками); бактериофаг P.aeruginosa (при гнойно-воспалительных заболеваниях, вызванных синегнойной палочкой); клебсиеллезный бактериофаг (при заболеваниях, вызванных клебсиеллами). Комбинированные многокомпонентные препараты бактериофагов: коли-протейный бактериофаг (для лечения эшерихизов и дисбактериозов, вызванных бактериями рода Proteus); пиобактериофаг (для лечения стафилококковой, стрептококковой, клебсиеллезной, протейной, синегнойной инфекции и эшерихиозов); интести-бактериофаг (для лечения бактериальной дизентерии, сальмонеллезов, эшерихиозов, а также протейной, стафилококковой, энтерококковой и синегнойной инфекций). Бактериофаги применяют местно путем аппликации на раневую или ожоговую поверхность, введением в полости (брюшную, плевральную, мочевой пузырь), через рот, а также ректально. Соответственно способу применения препараты бактериофагов выпускают в различных лекарственных формах (жидкая форма, таблетки, мази, свечи, аэрозоли). Перед назначением бактериофага необходимо поставить пробу на чувствительность к нему выделенной культуры микроорганизмов. III. Для профилактики брюшного тифа и дизентерии у людей, контактировавших с больным, используют брюшнотифозный и поливалентный дизентерийный бактериофаги. 40. Организация генетического материала бактериальной клетки. Факторы внехромосомной наследственности (плазмиды, транспозоны, инсерционные элементы). Генетический материал бактериальной клетки представлен хромосомной ДНК с гаплоидным набором генов. Хромосомная ДНК находится в суперспирализованной форме в виде кольца. В бактериях могут присутствовать внехромосомные молекулы ДНК: плазмиды, транспозоны, вставочные последовательности. Хромосомный и внехромосомный генетический материал свободно располагается в цитоплазме. Факторы внехромосомной наследственности Факторы внехромосомной наследственности (плазмиды, транспозоны, вставочные последовательности) состоят из молекул ДНК, не являются жизненно важными для бактерий, но придают им новые свойства. Плазмиды – кольцевидные молекулы ДНК, способные к саморепликации и несущие от 40 до 50 генов. Они находятся в автономном состоянии в цитоплазме бактерий и способны к самопереносу из одной клетки в другую при конъюгации. Плазмиды кодируют свойства, дающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования. Плазмиды подразделяют на различные категории в зависимости от свойств, которые они кодируют у бактерий: Подвижные генетические элементы Транспозоны – подвижные участки ДНК, которые способны перемещаться внутри бактериальной хромосомы или между ДНК бактерий, плазмид и бактериофагов («прыгающие гены»). Помимо генов, кодирующих их перемещение по ДНК, транспозоны могут содержать структурные гены, обеспечивающие бактерию новыми свойствами (устойчивость к антибиотикам, токсинопродукция и др). Вставочные последовательности или инсерционные элементы – простейший тип генетических элементов, мигрирующих между хромосомами, внутри хромосомы, между хромосомой и плазмидами. Содержат гены, необходимые для их перемещения, новых свойств не кодируют. Подвижные генетические элементы могут: распространять новые гены в популяции бактерий; координировать взаимодействие плазмид с хромосомой; вызывать изменения генов (мутацию, инактивацию) в местах их внедрения в генетический материал. Таким образом, внехромосомные молекулы ДНК бактериальной клетки способствуют разнообразным изменениям бактериального генома, появлению новых свойств и эволюционным изменениям микробной популяции в целом. 41. Трансформация у бактерий. Трансформация у бактерий – форма генетической изменчивости, при которой бактерия-реципиент поглощает из внешней среды трофическим путем фрагменты ДНК погибшей бактерии-донора. Это приводит к образованию рекомбинантных бактерий, обладающих некоторыми свойствами донорских клеток Впервые феномен трансформации был установлен Ф. Гриффитсом в 1928 г. на модели бескапсульного и капсульного пневмококков (рисунок 11). Следует напомнить, что капсула пневмококков – мощный фактор патогенности, способствующий возникновению септического течения инфекции и гибели лабораторного животного. Для проведения опыта в качестве индикатора использовали 3 белые мыши. Первую мышь заражали живыми, бескапсульными невирулентными пневмококками. Второй мыши вводили убитую культуру капсульных вирулентных пневмококков; третьей мыши – смесь живых бескапсульных пневмококков и убитых капсульных пневмококков. В результате из всех мышей, взятых в опыт, погибала третья мышь, т.к. живые бескапсульные пневмококки поглощали фрагменты ДНК убитых капсульных, приобретали ген, кодирующий синтез капсулы, превращались в вирулентные пневмококки и убивали мышь. 42. Трансдукция и фаговая (лизогенная) конверсия. Трансдукция – перенос небольшого фрагмента хромосомной ДНК от клетки-донора к клетке-реципиенту с помощью умеренного бактериофага (рисунок 13). В результате трансдукции бактерия-реципиент приобретает новые фенотипические признаки (ферментативные свойства, устойчивость к антибиотикам и др.). При выходе бактериофага из клетки фрагмент донорской трансдуцированной ДНК остается в хромосоме клетки-реципиента, следовательно, сохраняются и новые фенотипические признаки. Таким образом, при трансдукции умеренный бактериофаг выполняет только транспортную функцию. Фаговая конверсия (от лат conversion – превращение) – получение бактерией новых свойств в результате использования генов профага, интегрированного с хромосомой клетки. Например, ДНК умеренного дифтерийного фага содержит ген tox, который кодирует синтез дифтерийного экзотоксина. Если ДНК такого умеренного фага интегрирует с ДНК дифтерийной палочки, то она превращается в токсигенную, т.е. продуцирующую дифтерийный экзотоксин. При выходе из клетки умеренного фага дифтерийные бактерии утрачивают ген tox и теряют способность к продукции экзотоксина. Лизогенная конверсия выявлена также у возбудителей ботулизма, холеры и др. 43. Конъюгация у бактерий. Конъюгация у бактерий – передача генетического (хромосомного и нехромосомного) материала от бактерии-донора к бактерии-реципиенту при их непосредственном контакте (рисунок 12). Необходимым условием для конъюгации является наличие у бактерии-донора F-плазмиды, которая контролирует синтез половых pili на поверхности клеток-доноров. Процесс конъюгации между бактерией-донором (F+) и бактериейреципиентом (F-) имеет следующие стадии: установление контакта между донором и реципиентом с помощью половых pili; прохождение генетического материала через канал половой pili от донора к реципиенту;  рекомбинация между донорской и реципиентной ДНК. 44. Практическое значение генетики и изменчивости микроорганизмов. Использование генной инженерии в медицине. Получение живых вакцин. В основе лежит принцип аттенуации, предложенный Л. Пастером. Аттенуация – ослабление вирулентности микробов под действием физических, химических или биологических факторов с сохранением их иммуногенных свойств. Например, вакцинный штамм туберкулезных бактерий (БЦЖ) был получен А.Ш. Кальметом и Ж-М.К. Жереном путем длительного (13 лет) выращивания возбудителя туберкулеза на питательной среде с желчью. Получение генно-инженерных вакцин (рекомбинантная дрожжевая вакцина против вирусного гепатита В из протективного HBs-антигена вируса). Разработка и внедрение в практику молекулярно-биологических методов диагностики инфекционных заболеваний, например, ПЦР. Получение штаммов бактерий и микроскопических грибов с высокой продукцией антибиотиков. Получение инсулина, гормонов, интерферона и других биологических веществ в бактериальных клетках с помощью генно-инженерных методов. 45. Антибиотики. Классификация антибиотиков по механизму антимикробного действия. Антибиотики – это химические вещества биологического происхождения, а также их полусинтетические и синтетические аналоги, обладающие бактериостатическим или бактерицидным действием. Антибиотики, обладающие бактериостатическим действием, подавляют рост и размножение микроорганизмов. Антибиотики, обладающие бактерицидным действием, вызывают гибель микроорганизмов. Антибиотики были открыты английским ученым А. Флемингом и американским ученым С. Ваксманом. В 1929 г. А. Флеминг установил, что фильтрат бульонной культуры плесневого гриба Penicillium notatum содержит вещество (пенициллин), угнетающее рост стафилококков. Однако, в чистом виде препарат был получен лишь в 1940 г., после чего было налажено его промышленное производство. С. Ваксман открыл в 1944 г. стрептомицин (его продуцентом является Actinomyces griseus) и предложил впервые термин «антибиотик» (от греч. anti, bios – против жизни). В настоящее время существует более 6 тысяч природных антибиотиков и созданы многие десятки тысяч полусинтетических и синтетических препаратов. Антибиотики могут вырабатывать клетки животного (лизоцим) и растительного происхождения (фитонциды чеснока и лука), однако широкого производственного применения в медицине они не имеют. Основными источниками получения природных и полусинтетических антибиотиков являются: плесневые грибы родов Penicillium и Cephalosporium – синтезируют беталактамные антибиотики (пенициллины и цефалоспорины); актиномицеты (ветвящиеся бактерии) – синтезируют большинство (80%) природных антибиотиков, в том числе стрептомицин, ванкомицин, нистатин и др.; бактерии (бациллы, псевдомонады и др.). Группы антибиотиков по химической структуре:  бета-лактамные (пенициллины, цефалоспорины, монобактамы, карбапенемы);  макролиды; производные диоксиаминофенилпропана (левомицетин); тетрациклины; аминогликозиды; спектиномицин; полимиксины; гликопептиды; липопептиды; ансамицины (рифампицин); полиеновые антибиотики; антибиотики других химических групп. Синтетические противомикробные химиотерапевтические препараты. Методами химического синтеза созданы вещества, которые не встречаются в живой природе, но похожи на антибиотики по механизму и спектру действия. К наиболее значимым группам относят: сульфаниламиды (производные сульфаниловой кислоты); хинолоны; нитрофураны; 8-оксихинолины; производные хиноксалина; 5-нитроимидазолы оксазолидиноны. В бактериальной клетке есть четыре основные области, которые отличаются от клеток человека и определяют клиническую эффективность действия антибактериальных препаратов: клеточная стенка, рибосомы, нуклеиновые кислоты и цитоплазматическая мембрана. По механизму действия антибиотики подразделяют: Бактерицидные: нарушают синтез клеточной стенки или ее компонентов (бетa-лактамы, фосфомицин, ристомицин); нарушают морфо-функциональную организацию цитоплазматической мембраны (полимиксины, полиены); нарушают репликацию ДНК (фторхинолоны). Бактериостатические: ингибируют синтез белка на уровне РНК-полимеразы (рифампицины); ингибируют синтез белка на уровне рибосом (тетрациклины, левомицетин, фузидин, макролиды и др.). Антибиотики могут быть узкого спектра (действуют только на грамотрицательные бактерии или на некоторые виды грамположительных бактерий), а также широкого спектра (действуют на грамположительные и грамотрицательные бактерии). Существуют специальные группы антибиотиков: противотуберкулезные, противогрибковые и др. Нерациональное применение антимикробных лекарственных средств для лечения инфекционных заболеваний нередко приводит к формированию лекарственной устойчивости – антибиотикорезистентности. Бактерии следует считать резистентными, если они не обезвреживаются оптимальными терапевтическими дозами препарата, вводимого в организм. Резистентность может быть природной и приобретенной. Приобретенная лекарственная резистентность связана с адаптацией микроорганизмов к условиям окружающей среды. Проблема формирования и распространения лекарственной резистентности микробов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых госпитальными микробами с множественной лекарственной устойчивостью к нескольким антибиотикам (так называемая полирезистентность). 46. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Осложнения и последствия антибиотикотерапии. Осложнения и последствия антибиотикотерапии. Метод серийных разведений. В пробирках готовят двукратные разведения антибиотиков, а затем к каждому разведению добавляют взвесь исследуемых бактерий. После термостатирования в течение суток при 370С определяют минимальную подавляющую концентрацию антибиотика (МПК), т.е самую низкую концентрацию препарата, которая полностью задерживает рост бактерий (рисунок 14). Диско-диффузионный метод. Производят посев выделенной от больного культуры бактерий сплошным газоном на пластинчатый МПА. Затем на посев помещают стандартные бумажные диски, пропитанные различными антибиотиками, и термостатируют при 370С 24 часа. Учет результатов проводят по диаметру зон отсутствия роста бактерий вокруг дисков (рисунок 15). Размеры зон подавления роста сравнивают со стандартами и определяют антибиотик, который необходим для лечения. Осложнения и последствия антибиотикотерапии Аллергические реакции (крапивница, анафилактический шок и др.). Могут вызывать большинство антибиотиков.  Иммунотоксическое действие на клеточный и гуморальный иммунитет, а также фагоцитоз (тетрациклины, левомицетин и др.). Токсические реакции в связи с органотропным действием антибиотиков при длительном лечении: поражение печени (тетрациклин, рифампицин), почек (стрептомицин, полимиксин), костного мозга (левомицетин) и др. Эндотоксический шок. Развивается в тех случаях, когда под влиянием антибиотика происходит массовое разрушение грамотрицательных бактерий и поступление в кровь их эндотоксинов. Дисбактериозы. Развиваются после длительного применения антибиотиков, подавляющих резидентную микрофлору организма. Формирование антибиотикоустойчивых микробов. |