Ганеева Л. А., Зайнуллин ли, Абрамова З. И
 Скачать 5.05 Mb.
|
|
УДК 577.11: 577.12 Рекомендовано к публикации учебно-методической комиссией ИФМиБ, протокол №3 от г. Авторы Ганеева Л. А, Зайнуллин ЛИ, Абрамова З.И. Тенишева Н. Х, . Рецензенты к.б.н. :Невзорова ТА, к.б.н. Свинтенок Г.Ю. Биохимия.Практикум:Учебное пособиепо курсу Медицинская биохимия Л. А.Ганеева,Л. И.Зайнуллин,З.И. Абрамова,Н. Х. Тенишева. — Казань : ИСБ, 2015. — 176 с. В пособие включены лабораторные работы, отражающие основные разделы классической биохимии биохимия белков, ферментов, витаминов, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот и гормонов. Каждый раздел включает практические работы, а также теоретическое обоснование, что способствует лучшему усвоению материала. Основой данного методического пособия послужил практикум по биохимии, который был написан Тенишевой Н. Хи долгие годы служил незаменимым руководством для студентов, изучающих биохимию. Данная редакция пособия включает в себя некоторые коррективы и дополнения. Настоящее учебное пособие составлено в соответствии с программой по биохимии и может быть рекомендовано для студентов медицинских, биологических и фармацевтических специальностей. УДК 577.11: 577.12 © Издательство Сергея Бузукина, 2015 Оглавление ГЛАВА 1. БЕЛКИ ............................................................................................... 7 АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ ....................................................... 7 Работа 1. Качественные реакции на аминокислоты и белки ............................ 9 Нингидриновая реакция ..................................................................... 10 Биуретовая реакция .......................................................................... 12 Ксантопротеиновая реакция ........................................................... 14 Реакция Миллона ................................................................................ 14 Реакция Фоля ...................................................................................... 15 Реакция Сакагучи ............................................................................... 16 Реакция Паули .................................................................................... 16 Реакция Адамкевича. .......................................................................... 17 Работа 2. Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге .................................................................. 19 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ........................................... 23 Работа 3. Количественное определение общего белка сыворотки крови по биуретовой реакции ..................................................................... 25 ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКА ............................................. 26 Работа 4. Диализ солевого раствора белка ....................................................... 29 Работа 5. Определение изоэлектрической точки казеина ............................... 30 Работа 6. Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания ........................................................................................... 31 Работа 7. Осаждение белков ............................................................................... 31 Осаждение белков при нагревании ................................................... 31 Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами ........................................................................................... 32 Осаждение белков органическими кислотами ................................ 32 Осаждение белков алкалоидными реактивами ............................... 33 Осаждение белков солями тяжелых металлов .............................. 33 Осаждение белков органическими растворителями ...................... 34 КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ .......................................................................... 35 ГЛИКОПРОТЕИНЫ .......................................................................... 36 Работа 8. Определение углеводного компонента в гликопротеинах .............. 38 Доказательство наличия углеводного компонента в яичном альбумине ............................................................................. 38 Выделение муцина из слюны и определение его углеводного компонента ........................................................................................ 38 3 ФОСФОПРОТЕИНЫ ......................................................................... 38 Работа 9. Выделение казеиногена из молока и гидролиз его, определение продуктов гидролиза .................................................... 39 ХРОМОПРОТЕИНЫ .......................................................................... 40 Работа 10. Качественное определение геминовой группировки гемоглобина ........................................................................................ 40 ОБМЕН БЕЛКОВ ................................................................................................. 42 ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ ......................................................................... 44 Работа 11. Гидролиз казеина при участии трипсина ....................................... 45 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ АЗОТИСТОГО ОБМЕНА ................................................................... 47 Работа 12. Определение общего азота мочи колориметрическим методом .. 48 ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТЫ ................................................................................... 52 НОМЕНКЛАТУРА И КЛАССИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ ............................ 52 СТРОЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ .................................................................................. 54 МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ ......................................................... 56 Работа 13. Изучение действия ферментов. 58 Действие амилазы (КФ 3.2.1.1). .................................................... 58 Действие пепсина (КФ 3.4.23.1) ....................................................... 60 Действие уреазы (КФ 3.5.1.5) ............................................................ 61 Действие каталазы (КФ 1.11.1.6) ..................................................... 61 Действие липазы (КФ 3.1.1.3). .......................................................... 62 Работа 14. Изучение влияния различных факторов на скорость ферментативных реакций ................................................................. 63 Влияние температуры на активность амилазы слюны ................. 63 Влияние pH на активность амилазы ................................................ 64 Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы .... 65 Работа 15. Специфичность действия ферментов .............................................. 65 Специфичность действия сахаразы и амилазы. 66 Специфичность действия уреазы ..................................................... 67 ГЛАВА 3. ВИТАМИНЫ ................................................................................... 71 Работа 16. Качественные реакции на витамины ............................................... 74 Реакции на витамин B 1 . ..................................................................... 74 Реакция на витамин В ...................................................................... 76 Реакции на витамин РР ..................................................................... 77 Реакции на витамин В ..................................................................... 79 Реакции на витамин Р ....................................................................... 80 Реакции на витамин С ....................................................................... 81 Реакции на витамин А ....................................................................... 84 Реакции на витамин D ....................................................................... 85 Реакции на витамин Е ....................................................................... 86 Реакции на витамин К ...................................................................... 87 4 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ ................................. 88 Работа 17. Определение витамина Св растительном материале .................... 89 Работа 18. Определение содержания витамина Св моче ................................ 90 Работа 19. Определение витамина Р в чае — черном и зеленом .................... 91 Работа 20. Количественное определение тиамина (В) в моче ....................... 91 ГЛАВА 4. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ ..................................................... 94 СОСТАВ, СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ............... 94 Работа 21. Выделение рибонуклеопротеинов (РНП) из дрожжей и качественное определение продуктов их гидролиза .................. 102 ОБМЕН НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ............................................................... 106 Работа 22. Определение активности рибонуклеазы спектрофотометрическим методом ................................................. 108 Работа 23. Определение содержания мочевой кислоты в моче .................... 108 ГЛАВА 5. УГЛЕВОДЫ ................................................................................... 111 СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА УГЛЕВОДОВ . .................................................... 111 МОНОСАХАРИДЫ ........................................................................... 111 ДИСАХАРИДЫ ................................................................................. 114 ПОЛИСАХАРИДЫ .......................................................................... 116 Работа 24. Качественные реакции на углеводы .............................................. 118 Восстанавливающие свойства моносахаридов ............................. 118 Реакция на основе дегидратации моносахаридов ......................... 119 Реакции на дисахариды .................................................................... 122 Реакции на полисахариды ............................................................... 123 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ ................................. 125 Работа 25. Определение содержания фруктозы в сыворотке крови фотоколориметрическим методом .................................................. 125 Работа 26. Определение глюкозы энзиматическим методом ........................ 126 ОБМЕН УГЛЕВОДОВ ....................................................................................... 128 Работа 27. Качественная проба на молочную кислоту .................................. 129 ГЛАВА 6. ЛИПИДЫ ....................................................................................... 132 ПРОСТЫЕ ЛИПИДЫ ....................................................................................... 133 Работа 28. Физико-химические свойства жиров ............................................ 134 Работа 29. Количественное определение свободных жирных кислот в сыворотке крови ............................................................................ 140 СЛОЖНЫЕ ЛИПИДЫ ....................................................................................... 142 Работа 30. Выделение лецитина из яичного желтка и изучение его растворимости ........................................................................... 144 Работа 31. Гидролиз лецитина и определение продуктов его гидролиза ..... 145 5 ПРОИЗВОДНЫЕ ЛИПИДОВ ........................................................................... 148 Работа 32. Выделение холестерина из мозга и качественные реакции на него ................................................................................ 149 ГЛАВА 7. ГОРМОНЫ .................................................................................... 151 Работа 33. Качественное определение гормонов ........................................... 153 Работа 34. Количественное определение адреналина .................................... 158 ГЛАВА 8. ВОДНО-СОЛЕВОЙ ОБМЕН ..................................................... 161 Работа 35. Качественное определение неорганических соединений костной ткани ................................................................................... 163 Работа 36. Количественное определение кальция в сыворотке крови ......... 164 Работа 37. Определение хлоридов в крови ..................................................... 165 ГЛАВА 9. ПИГМЕНТНЫЙ ОБМЕН ........................................................... 167 Работа 38. Определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом по Йендрашику — Клеггорну — Грофу) ...................................... 169 КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ЖЕЛЧНЫЕ ПИГМЕНТЫ В МОЧЕ ...... 171 Работа 39. Обнаружение желчных пигментов в моче с реактивом Фуше ... 172 Работа 40. Обнаружение желчных пигментов в моче пробой Гупперт — Сальковского ................................................... 172 Работа 41. Обнаружение желчных пигментов в моче по реакции со спиртовым раствором йода (проба Розина) ............................... 173 Работа 42. Обнаружение желчных пигментов в моче сконцентрированной азотной кислотой (проба Гмелина) ........... 173 Литература ......................................................................................................... 175 6 ГЛАВА 1. БЕЛКИ Белки — высокомолекулярные азотсодержащие органические соединения, молекулы которых построены из α, аминокислот (простые белки, а также содержащие еще и другие дополнительные компоненты ионы металлов, неорганические и органические простетические группы (сложные белки. Белки как основа всего живого были издавна в центре внимания исследователей. Более чем двухсотлетняя история химии белка наполнена непрерывным совершенствованием экспериментальных методов и богата различными теоретическими концепциями. Большой вклад в развитие химии белка внесли многие отечественные ученые А. Я. Данилевский, Н. Д. Зелинский, B. C. Садиков, Д. Я. Талмуд, АС. Спирин и др, а также зарубежные исследователи Э. Фишер, Т. Курциус, М. Бергман, Ф. Шорм, Ф. Сенгер и др. Химия белка — это особая область, которая соединила в себе идеи и методы биологии, химии, физики, медицины. Белки — материальная основа деятельности клетки. Функции белков в природе универсальны каталитические, транспортные, защитные, структурные, сократительные, дыхательные, запасные, регуляторные и др. Невозможно представить работу генетического аппарата клетки безучастия белков, осуществляющих репликацию, транскрипцию, трансляцию информации. Белки составляют основу структуры и функции живых организмов, подсчитано, что в природе встречается примерно 10 10 –10 12 различных белков, обеспечивающих существование около 10 6 живых организмов, от вирусов до человека. Каждый организм характеризуется уникальным набором белков. Фенотипические признаки и многообразие функций обусловлены особенностями пространственной структуры белков, зависящей от последовательности одних и тех же аминокислотных остатков, а также специфичностью объединения белков во многих случаях в виде надмолекулярных и мультимолекуляр-ных структур, в свою очередь определяющих ультраструктуру клеток и их органелл. АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ Все многообразие белков построено из аминокислот. Общее число α- аминокислот, входящих в их состав, близко к 70. Среди них выделяется группа из 20 наиболее важных аминокислот, постоянно встречающихся во всех белках. Аминокислоты — кристаллические вещества, растворимые вводе. В твердом состоянии аминокислоты существуют в виде биполярного иона. Аминокислоты — гетерофункциональные соединения, содержащие карбоксильную группу и аминогруппу у одного итого же углеродного атома. Принцип построения аминокислот, те. нахождения у одного итого же атома углерода двух различных функциональных групп, радикала и атома водорода, предопределяет хиральность асимметричность) углеродного атома исключение составляет глицин).Почти все природныеα-аминокислоты принадлежат кряду (расположение аминогруппы в проекционной формуле Фишера слева. Использование для построения белков живых организмов только энантиомеров ряда имеет важнейшее значение для формирования пространственной структуры белков и проявления ими биологической активности. Аминокислоты являются амфотерными соединениями, что обусловлено наличием в их молекулах функциональных групп кислотного и основного характера. Поэтому аминокислоты образуют соли как со щелочами, таки с кислотами Вводном растворе аминокислоты существуют в виде равновесной смеси биполярного иона, катионной и анионной форм молекул. Положение равновесия зависит от рН среды Ионное строение придает некоторые особенности аминокислотам высокую температуру плавления (выше 200 С, нелетучесть, растворимость вводе, что является важным фактором в обеспечении их биологического функционирования, их всасываемость, транспорт в организме и т. п. Положение равновесия, те. соотношение разных форм аминокислоты вводном растворе при определенных значениях рН, существенно зависит от строения радикала, главным образом от наличия в нем ионогенных групп, играющих роль дополнительных кислотных или основных групп. Общим для всех аминокислот является преобладание катионных форм в сильнокислых (рН 1–2) и анионных — в сильнощелочных (рН 13–14) средах. Значение рН, при котором концентрация биполярных ионов максимальна, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ, pI).ЗначениеpIопределяетсяпо уравнению pI = ½ (pK 1 + р. Величина рК (отрицательный десятичный логарифм константы диссоциации) характеризует кислотные и основные свойства карбоксильной и аминогрупп. 8 В изоэлектрической точке суммарный заряд ионной формы молекулы α- аминокислоты равен нулю, биполярные ионы не перемещаются в электрическом поле. При изменениях рН среды ниже, чем pI, катион аминокислоты движется к катоду, при рН выше р анион аминокислоты движется к аноду. У нейтральных аминокислот значение pI неравно, а лежит несколько ниже (5,5–6,3) вследствие большой способности к диссоциации карбоксильной группы (л 6,02, рI гли 5,97, фен 5,48 и т. д. Изоэлектрическая точка аминокислот, содержащих дополнительные кислотные или основные группы, зависит от кислотности или основности радикалов этих аминокислот. У кислых аминокислот, имеющих в радикале дополнительную карбоксильную группу, изоэлектрическая точка вычисляется как среднее арифметическое значение величин рК α-СООН и СООН-радикала, pI кислых аминокислот находится в сильнокислой среде (рI асп 2,74, рI глу 3,24). У основных аминокислот, имеющих в радикале дополнительные аминогруппы вычисляется из полусуммы значений рК для α-NH 2 и группы радикала. Изоэлектрическая точка основных аминокислот находится в области рН выше 7 (рI гис 7,59, pI лиз 9,82, рI арг 10,76). В организме при физиологических значениях рН 6,9–7,4 преимущественно все аминокислоты (исключение составляет гистидин) находятся в катионной или анионной форме, а не в форме биполярного иона. Гистидин обладает значительными буферными свойствами при физиологическом рН. Содержащийся в эритроцитах гемоглобин характеризуется высоким содержанием остатков гистидина, что придает ему значительную буферную емкость. На различиях в кислотно-основных свойствах аминокислот, те. на различиях в знаке и величине суммарного электрического заряда приданном значении рН, разработаны эффективные и чувствительные методы (электрофорез и ионно-обменная хроматография) идентификации и количественного определения каждой из 20 аминокислот. Работа 1. Качественные реакции на аминокислоты и белки Особенность химии аминокислот и белков заключается в наличии многочисленных качественных (цветных) реакций, составляющих в свое время химическую основу анализа аминокислот и белков. В настоящее время, когда исследование аминокислот и белков проводится физико- химическими методами, многие качественные реакции сохраняют свое значение и применяются для обнаружения аминокислот, пептидов и белков в электрофорезе и хроматографическом анализе. Общая качественная реакция аминокислот — это реакция с нингидрином, а для белков — биуретовая реакция. Существует также ряд частных реакций, позволяющих обнаружить отдельные аминокислоты или группы родственных аминокислот. 9 Реактивы и оборудование Гидроксид натрия (10 % и 20 %); азотная кислота (конц серная кислота конц соляная кислота (5 %); сульфаниловая кислота (1 %); ледяная уксусная кислота сульфат меди (1 %); ацетат свинца (1 %); гипобромид натрия (0,2 %); нитрит калия (0,5 %); карбонат натрия (10 %); фенол (0,1 %); нин-гидрин (1 % в 95 % ацетоне мочевина (крист, мочевина (40 %); нафтол (0,2 % спиртовой раствор желатин (1 %); 0,01 % растворы аминокислот глицина, пролина, тирозина, цистеина, аргинина, гистидина, триптофана. Реактив Миллона: в 60 мл конц. HNO 3 (ρ 1,40 г/мл) растворяют 40 г ртути при комн. температуре, помещают в теплую водяную баню до прекращения выделения бурых паров и перемешивают . Затем добавляют 120 мл НО и полученный раствор разбавляют водой 1:1. Яичный белок белок от 1 куриного яйца растворяют в 250 мл воды, фильтруют через слой марли и хранят в холодильнике. Штатив, пробирки, мерные пипетки (1 и 5 мл, термостат. Нингидриновая реакция Нингидриновая реакция характерна для аминогрупп находящихся в положении и входящих в состав белков,пептидов и свободных аминокислот. α-Аминокислоты, пептиды, белки при нагревании с раствором нингидри-на дают синее или сине-фиолетовое окрашивание. Нингидриновая реакция со спиртовым или ацетоновым растворами широко используется в электрофорезе, хроматографических методах для открытия отдельных аминокислот и определения их количества. В результате взаимодействия аминокислот с нингидрином образуется шиффово основание, которое перегруппировывается, декарбоксилируется и расщепляется на альдегид и аминодикетогидринден. Аминодикетогидринден конденсируется еще с одной молекулой нингидрина. Образовавшееся соединение, енолизируясь, переходит в окрашенную форму, получившую название «сине-фиолетовый комплекс Руэмана». 10 В присутствии органических растворителей (ацетона, этанола, на которых готовят раствор нингидрина, возможно протекание побочной реакции с образованием соединения, содержащего в своем составе радикал аминокислоты. Наличие радикала аминокислоты в составе этого соединения обуславливает различную окраску соединений (красную, желтую, голубую, возникающих при реакции аминокислот с нингидрином. В реакции глицина с нингидрином образуется соединение, имеющее сине-фиолетовую окраску, ас пролином — желтую. 11 Ход работы А В пробирку вносят мл раствора глицина и5капель1 % раствора нингидрина в 95 % растворе ацетона. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и помещают на пять минут в термостат при температуре 70 С. Б В пробирку приливают мл раствора пролина и5капель1 раствора нингидрина в ацетоне. Содержимое пробирки перемешивают и нагревают в термостате при температуре 70 Св течение 5 минут. В. К мл раствора белка добавляют5капель0,5 водного раствора нингидрина, перемешивают и помещают в термостат на 5 минут при температуре СВ пробирке появляется розово-фиолетовое окрашивание, стечением времени раствор синеет. Биуретовая реакция В щелочной среде раствор белка при взаимодействии с ионами меди приобретает сине-фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание. Биуретовую реакцию способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей, например три, тетрапептид и т. д. Впервые реакция образования комплексных соединений меди была проведена для биурета, отсюда и название реакции — биуретовая. Биурет образуется при нагревании сухой мочевины СО 180 СВ щелочной среде биурет переходит в енольную форму Две молекулы биурета взаимодействуют с гидроксидом меди с образованием биуретового комплекса Биуретовая реакция обусловлена образованием биуретового комплекса в результате соединения ионов меди с пептидной связью белка. Окраска биуре- тового комплекса зависит от количества ионов меди, от длины полипептидной цепи, концентрации белка и может варьировать от розового до сине-фиолетового цвета. 12 Гидроксид меди (II) для проведения биуретовой реакции получают взаимодействием гидроксида натрия и сульфата меди 2NaOH + CuSO 4 = О + Cu(OH) 2 ↓ В щелочной среде пептидные связи белка из кетоформы переходят в енольную форму,которая взаимодействует с гидроксидом меди Аминокислоты не дают положительную биуретовую реакцию за исключением гистидина, серина, треонина при условии больших концентраций их в растворе Биуретовый комплекс гистидина Ход работы А К мл раствора яичного белка прибавляют мл раствора гидроксида натрия, 2 капли 1 % раствора сульфата меди и все перемешивают. Содержимое пробирки приобретает фиолетовое окрашивание. Нельзя добавлять избыток сульфата меди, так как синий осадок гидроксида меди маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка. Б Нагревают в пробирке несколько кристаллов мочевины до расплавления. Затем после охлаждения пробирки добавляют 2–4 капли воды и по 1 капле гидроксида натрия и сульфата меди. Содержимое пробирки приобретает розовую окраску. 13 Ксантопротеиновая реакция Реакция получила название ксантопротеиновой от греческого xanthos — желтый. Реакция обеспечивает появление желтого окрашивания при попадании концентрированной азотной кислоты на кожу, ногти и т. д. Ксантопротеиновая реакция доказывает наличие в белке ароматических аминокислот фенилаланина, тирозина, триптофана. Белки:желатин,сальмин,клупеин— дают отрицательную реакцию на азотную кислоту, что свидетельствует об отсутствии в составе этих белков ароматических аминокислот. Тирозин и триптофан нитруются легко, а фенилаланин — с трудом. Тирозин Динитротирозин Натриевая соль динитротирозина Ход работы Берут три пробирки и наливают:в первую 1 мл раствора тирозина, во вторую — 1 % раствора яичного белка, в третью — 1 % раствора желатина. Затем вовсе пробирки добавляют по 0,5 мл концентрированной азотной кислоты и осторожно нагревают. Наблюдают появление впервой пробирке желтой окраски, во второй — осадка желтого цвета, в третьей — очень слабое окрашивание, так как желатин почти не содержит ароматических аминокислот. В щелочной среде нитропроизводные ароматических аминокислот образуют соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет. После охлаждения впервые две пробирки добавляют 10–15 капель 20 % раствора щелочи до появления оранжевого окрашивания. Реакция Миллона Реакция Миллона является качественной на аминокислоту тирозин. Следовательно, ее используют для открытия в белках тирозина. При добавлении к раствору белка реактива Миллона белок выпадает в осадок, который при нагревании приобретает красный цвет. Реакция доказывает наличие в радикале тирозина фенольного кольца, способного образовывать ртутную соль динитро-тирозина. К раствору белка не следует добавлять избыток реактива Миллона, так как он содержит азотную кислоту, которая при взаимодействии с белком может дать желтое окрашивание, маскируя реакцию Миллона. 14 Ртутная соль динитротирозина Ход работы А К мл раствора тирозина добавляют мл реактива Миллона, тщательно перемешивают. Через 10 минут раствор окрашивается в красный цвет. Б К мл раствора яичного белка добавляют мл реактива Миллона, тщательно перемешивают реакционную смесь. Через 10 минут выпавший белый осадок осторожно нагревают и наблюдают его окрашивание в красный цвет. Реакция Фоля Реакция Фоля позволяет открыть в белке или пептиде цистеин, содержащий слабосвязанную сульфгидрильную группу. Метионин хотя и является серосодержащей аминокислотой, нов отличие от цистеина этой реакции не дает, так как сера в нем связана прочно. При кипячении цистеина в щелочной среде сера отщепляется в виде сероводорода, который в щелочной среде легко образует сульфид натрия. Образование сульфида натрия можно обнаружить с помощью ионов свинца, образующих с ионами серы нерастворимый сульфид свинца черного цвета. Для выявления сульфида натрия можно использовать ацетат свинца, взаимодействующий с гидроксидом натрия с образованием плюмбита натрия, который, реагируя с сульфидом натрия, приводит к образованию сульфида свинца. Na 2 S + Na 2 PbO 2 + 2H 2 O → PbS↓ + 4NaOH Ход работы А К мл водного раствора цистеина добавляют мл концентрированного раствора гидроксида натрия и 1 мл реактива Фоля (10 % раствор ацетата свинца с 10 % раствором щелочи. Смесь тщательно перемешивают и кипятят 2 минуты. Через 5 минут выпадает бурый или черный осадок. 15 Б. К мл раствора яичного белка добавляют мл реактива Фоля,пе ремешивают и кипятят 2 минуты. После охлаждения наблюдают образование бурого осадка, свидетельствующего о наличии в молекуле белка остатков цистеина. Реакция Сакагучи Качественной реакцией на аргинин является реакция Сакагучи. Аргинин, имеющий гуанидиновую группировку, в присутствии нафтола окисляется ги-побромидом в щелочной среде с образованием продукта конденсации розово-красного цвета. Ход работы А В пробирку наливают мл раствора аргинина, 1 мл % раствора гидроксида натрия, 3 капли 0,2 % спиртового раствора нафтола, тщательно перемешивают и добавляют 3 капли 0,2 % раствора гипобромида натрия, вновь перемешивают. Для стабилизации быстроразвивающегося красного окрашивания немедленно вливают 1 мл 40 % раствора мочевины. Б К мл яичного белка добавляют мл раствора щелочи, капли раствора нафтола, тщательно перемешивают и добавляют 3 капли раствора гипобромида натрия, перемешивают, затем быстро добавляют 1 мл 40 % раствора мочевины. Реакция Паули Реакция Паули открывает в белковых растворах и гидролизатах аминокислоты гистидин и тирозин. При взаимодействии кислого раствора сульфаниловой кислоты с нитритом калия происходит реакция диазотирования и образуется диазобензолсульфоно-вая кислота. 16 При реакции диазобензолсульфоновой кислоты с гистидином (или тирозином) образуется комплексное соединение вишнево-красного цвета. 2, 5-бис-II-сульфобензолгистидин Ход работы В две пробирки наливают по мл раствора сульфаниловой кислоты в 5 % растворе соляной кислоты и по 2 мл 0,5 % раствора нитрита калия и сильно встряхивают пробирки. Затем быстро в первую пробирку наливают мл 0,01 % раствора гистидина, во вторую — 2 мл 1 % раствора яичного белка, пробирки тщательно перемешивают и добавляют в обе пробирки по 6 мл 10 % раствора карбоната натрия. Развивается интенсивная вишнево- красная окраска. Реакция Адамкевича Реакция Адамкевича является специфической реакцией на триптофан и используется для обнаружения его в белках. Триптофан в кислой среде вступает в реакцию с глиоксиловой кислотой (альдегидами, образуя окрашенные в красно-фиолетовый цвет продукты конденсации. 17 Ход работы А К мл раствора триптофана добавляют мл ледяной уксусной кислоты, которая содержит небольшое количество глиоксило-вой кислоты. Полученную смесь вначале нагревают, а затем охлаждают и осторожно по стенке по каплям, чтобы жидкости не смешивались, добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты. Через 10 минут на границе раздела двух слоев наблюдается образование красно-фиолетового кольца. Б Проделать реакцию Адамкевича с мл раствора яичного белка. Отчет поданной работе рекомендуется выполнить в виде таблицы Таблица 1. Качественные реакции на белки и аминокислоты № п / п Название реакции Реактивы Что открывает Химизм реакции Вопросы и задания для самопроверки 1. Какова химическая природа белка Назовите структурные единицы белковой молекулы. 2. Напишите структурные формулы протеиногенных аминокислот, имеющих в радикале а) гетероциклическое кольцо, б) серу, в) гидроксогруппы, г) амидные группы. 3. Напишите структурные формулы незаменимых аминокислот. Почему они называются незаменимыми 4. Почему аминокислоты обладают амфотерными свойствами Приведите уравнения реакций на примере аланина. 5. Чем объяснить основные свойства лизина и кислые аспарагиновой кислоты. В какой области значений pH и почему находится изоэлектрическая точка а) кислой, б) основной, в) нейтральной аминокислот 7. Каким образом связаны в молекуле белка аминокислоты Напишите формулы ди-, три- и тетрапептидов из следующих аминокислота) лизина и глутамина, б) глицина, глутаминовой кислоты, аланина, в) серина, цистеина, пролина, треонина. 8. Напишите формулы пептидов и осуществите их гидролиза) ала–три– гли– арг, близ валиле, в) мет–тир–фен–асп–гли. 9. На чем основаны цветные реакции на белки и каково их практическое значение 10. Чем объяснить розово-фиолетовое окрашивание щелочного раствора белка в присутствии катионов меди Напишите уравнение биуретовой реакции с пептидом ала–иле–гли–вал–фен. 11. Какие аминокислоты в белке обуславливают ксантопротеиновую реакцию Напишите уравнение ксантопротеиновой реакции с одной из них. 12. На чем основана реакция обнаружения серосодержащих аминокислот в белковой молекуле Приведите уравнение реакции. 18 13. Какой качественной реакцией можно определить аминокислотный состав белка Приведите химизм этого процесса. Почему пролин в отличие от других аминокислот дает желтое окрашивание Напишите уравнение этой реакции с пролином. 14. Какими реакциями можно открыть в пептиде вал–тир–цис–гис–глу аминокислоты тирозин и гистидин Напишите уравнения этих реакций. 15. Какую аминокислоту открывают реакцией Сакагучи? Напишите уравнение реакции. Работа 2. Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге Для определения аминокислот разработано множество методов ферментативные, изотопные, электрофоретические, хроматографические.Аминокис лотный анализ существенно способствовал бурному развитию химии белка. Главными областями применения аминокислотного анализа являются установление аминокислотного состава белковых гидролизатов, определение первичной структуры белков, аналитический контроль пептидного синтеза, а также клиническая диагностика. Определение свободных аминокислот важно для изучения обмена белков в организме. В норме в плазме крови содержится около 21,42 ммоль / л аминокислот, с мочой выделяется 0,5 г аминокислот. При нарушении функций отдельных органов или физиологических систем крови, мочи наблюдаются изменения в содержании аминокислот. Не меньший интерес представляет также изучение аминокислотного состава пищевых белков и белковых смесей, определяющего в значительной мере характер влияния пищи на организм и пищевой ценности белка и белковых смесей. При хроматографическом разделении смесь веществ в подвижной фазе транспортируется через неподвижную фазу. При этом компоненты смеси из‑за различий в строении, растворимости, полярности, заряде вступают в специфическое взаимодействие с неподвижной фазой, которое обуславливает различные скорости транспорта компонентов смеси. В соответствии с агрегатным состоянием подвижной фазы различают жидкостную и газовую хроматографии. В зависимости от типа физико-химического взаимодействия между активным адсорбентом и находящимся в растворе веществом различают три вида хроматографии адсорбционную распределительную ионную Адсорбционная хроматография основана на сорбции растворенного вещества поверхностью твердой фазы. В распределительной хроматографии вещество распределяется между жидкими фазами, одна из которых неподвижна. Ионообменная хроматография основана на образовании ионных соединений между растворенными веществами и заряженными группами сорбента. На практике эти процессы 19 чаще протекают совместно. По методическим особенностям, по технике выполнения различают хроматографию тонкослойную бумажную колоночную. Различаютвиды хроматографии и по направлению движения подвижнойфазы: восходящая нисходящая радиальная одномерная двумерная. Бумажная хроматография, впервые примененная в 1944 г. Консденом, Гор доном, Мартином, представляет собой распределительную хроматографию, при которой адсорбционно связанная с целлюлозой вода образует стационарную неподвижную, а смесь органических растворителей — подвижную фазу. Непрерывная диффузия растворенных компонентов из одной фазы в другую приводит к их распределению между фазами. Более гидрофобные аминокислоты лучше растворяются в органических растворителях и движутся с большей скоростью, чем гидрофильные аминокислоты. В результате этого аминокислоты по окончании хроматографического разделения оказываются на разном расстоянии от линии старта. Аминокислоты определяют с помощью нингидрина. Положение определенных пятен на хроматограмме характеризуется коэффициентом удерживания R f : аминокислоты R f = l ———— растворителя Существует определенная связь между строением аминокислот и значением. Аминокислоты с заряженными или полярными радикалами имеют более низкие значения R f , с повышением гидрофобности радикала повышается значение Реактивы и оборудование 0,1 М растворы аминокислот бутанол ледяная уксусная кислота 1 % нингидрин в 95 % ацетоне. Сушильный шкаф, хроматографические камеры цилиндры, хроматографическая бумага, стеклянные пластинки, пинцеты, микропипетки, простые карандаши, линейки, держалки для сушки хроматограмм, ножницы, пульверизаторы. Ход работы 1. Вырезают полоску хроматографической бумаги в зависимости от величины хроматографической камеры, в которой проводят хроматографирование. В качестве хроматографической камеры можно использовать большие пробирки, цилиндры. Хроматографическую бумагу брать только пинцетом, чтобы не оставлять отпечатки пальцев. 2. На полоске бумаги (3 см × 15 см) наносят простым карандашом линию на расстоянии 3 см от края хроматограммы. Делят линию старта на 4 точки и обозначают цифрами 1, 2, 3, 4. Конец полоски бумаги заостряют со стороны линии старта, отрезав кусочки бумаги. 3. Помещают этот край бумаги на две стеклянные пластинки, расположенные параллельно друг другу с зазором 1 см. Бумагу прижимают к нижним пластинкам двумя такими же верхними пластинками. 20 Рис. 1. Схема разметки и расположения хроматографической бумаги 4. Капиллярными пипетками наносят в точки 1, 2, 3 стандартные аминокислоты (например, лизин, аланин и фенилаланин соответственно, в точку 4 смесь этих аминокислот. Можно использовать следующие сочетания аминокислот (растворы концентрацией 0,1 М а) лизин, аланин, фенилаланин б) глутаминовая кислота, аланин, лейцин в) цистеин, треонин, метионин. 5. После подсыхания пятен помещают полоску бумаги в хроматографический сосуд. На дно сосуда наливают смесь бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1:1). Помещают хроматограмму так, чтобы заостренный конец был погружен в растворитель. 6. Сосуд плотно закрывают крышкой и оставляют на 2 часа. 7. Через 2 часа хроматограмму вынимают из сосуда, отмечают границу фронта растворителя, делая небольшие надрезы ножницами слева и справа, и высушивают хроматограмму в вытяжном шкафу. Рис. 2. Установка для бумажной хроматографии 21 8. На высушенную хроматограмму наносят при помощи пульверизатора 0,5 % раствор нингидрина в ацетоне так, чтобы хроматограмма была равномерно смочена раствором, и оставляют на 5 минут в вытяжном шкафу. 9. Помещают хроматограмму в сушильный шкаф при температуре 70 Сна минут. 10. Проводят идентификацию аминокислот по значению R f . Для этого измеряют с точностью до миллиметра расстояние, пройденное растворителем от линии старта до границы фронта растворителя. С такой же точностью измеряют расстояние от точки нанесения каждой аминокислоты до центра цветного пятна, образовавшегося в результате нингидриновой реакции. R f — величина постоянная для каждой аминокислоты при одинаковых условиях опыта температура, сорт бумаги, растворитель. Сравнивают R f известных стандартных аминокислот с R f аминокислот исследуемой смеси. Указания к составлению отчета приклеить полученную хроматограмму в тетрадь, привести все измерения и вычисления для каждой аминокислоты. Вопросы и задания для самопроверки 1. На чем основан метод хроматографического разделения смеси веществ 2. Какие хроматографические методы применяют в белковой химии для разделения аминокислот, пептидов, белков 3. На чем основан метод ионообменной хроматографии, используемой для разделения смеси аминокислот 4. Какая из нижеприведенных аминокислот будет сходить с ионообменной хроматографической колонны первой, если через колонку пропускают буфер с а) pH 3, б) pH 7: а) асп и лиз, б) арг и мет, в) глу и вал, г) глу и лей. 5. На каких свойствах аминокислот основана распределительная хроматография Какие виды распределительной хроматографии чаще всего используют в лабораторной практике 6. Каков суммарный заряд пептидов а) гли–ала–асп–про, б) глу–тре–про– вал, в) цис–тре–вал–про–фен, г) вал–арг–лиз–гис в кислой, нейтральной, щелочной средах Напишите формулы указанных пептидов. 7. В каком направлении (катод, анод) будут перемещаться или оставаться на старте в процессе электрофореза в кислой, нейтральной и щелочной средах следующие пептиды а) сер–вал–арг, близ глиасн, в) гли–лей–три, г) арг–вал–лиз–цис. Напишите формулы указанных пептидов. 8. В какой среде (кислой, нейтральной, щелочной) лежат изоэлектрические точки следующих пептидов а) глу–вал–ала–цис, б) мет–гли–мет–асн, в) цис–гли–лей–тир, г) арг–глу–фен–тре–три–гис–цис–лиз? 9. Какие аминокислоты (кислые, основные или нейтральные) преобладают в составе пептида, если изоэлектрическая точка его лежит в слабощелочной среде. Приведите формулу такого пептида. 22 10. Смесь глицина, лизина, глутаминовой кислоты разделяли методом электрофореза на бумаге при pH 6,8. Какая из аминокислота) перемещалась к аноду, б) перемещалась к катоду, в) оставалась на старте Изоэлектрическая точка глицина находится при pH 5,97; лизина — при pH 9,74: глутаминовой кислоты при pH 3,22. 11. Укажите направление движения пептида лиз–гли–глн–глу–арг в процессе электрофореза на бумаге при pH а) 3,0; б) 6,5; в) 10,0. 12. ИЭТ белка равна 6,8. Фракционирование ведется при pH 7,0. Как изменится его электрофоретическая подвижность, если в его молекуле изменить а) глу навал, близ на глу, вала на асп? 13. В форме каких ионов находится аланин, гистидин, аргинин при значениях и 7,4, характерных для плазмы крови и межклеточной жидкости, соответственно, если pK 1 =2,1; р рK 3 (гис)=6,0; рК 3 (арг)=12,5? КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ Для количественного определения белков применяют физические, химические и биологические методы. Из физических методов наибольшее распространение получили три рефрактометрический по показателю преломления белковых растворов спектрофотометрический по поглощению в ультрафиолетовой области спектра, полярографический — по кривым, показывающим зависимость между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок. Для экспрессивного установления содержания белка широко используется прямая спектрофотометрия образцов при определенных длинах волн. Наибольшей известностью пользуется метод, основанный на измерении оптической плотности образца при 280 и 260 нм, предложенный Варбургом и Христианом. Однако этим методом можно лишь ориентировочно определить концентрацию белков, потому что они между собой могут сильно отличаться содержанием ароматических аминокислот, обуславливающих экстинцию при 280 нм. Химические методы определения белков разнообразны. Наиболее простым химическим методом является количественное определение общего или белкового азота. Умножая величину процентного содержания общего азота на коэффициент (среднее содержание азота в белках 16 %, отсюда 100 :16 = 6,25), получают данные о содержании сырого белка. Однако способ условен, так как не дает абсолютных результатов. Самым распространенным химическим методом количественного определения белка является фотоколориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности цветных реакций,развивающихся при взаимодействии белков стем или иным специфическим реагентом. Для определения концентрации белка часто применяют метод Лоури. Однако, несмотря на высокую чувствительность, он имеет определенные недостатки, так как используемый в этом методе реактив Фолина — Чокольтеу дает сильную реакцию и на некоторые другие вещества. 23 Биологические методы применимы только к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Измеряя степень биологической активности препарата, можно составить представление о содержании в нем белка. Этот метод не дает абсолютных результатов. Реактивы и оборудование Смесь спирта и эфира (1:1), сыворотка крови. Рефрактометр, фильтровальная бумага, микропипетки. Ход работы:Раскрывают камеру,тщательно промывают призмы водой, промокают фильтровальной бумагой, затем протирают призмы смесью спирта и эфира (1:1). На нижнюю призму наносят две капли дистиллированной воды и закрывают камеру. Устанавливают рефрактометр так, чтобы призмы его были ярко освещены. Поворотом призм или окуляра подводят границу темного поляк перекрестку нитей окуляра. Делают отсчет по шкале. При температуре 20 С отсчет должен быть 1,333 (показатель преломления воды при 20 С. После того как прибор установлен поводе, призмы сушат спиртоэфирной смесью. Затем наносят на нижнюю призму каплю сыворотки крови и проводят измерения три раза по методике, описанной выше. Из трех значений показателя преломления сыворотки крови находят среднее арифметическое и, пользуясь таблицей 2, находят процентное содержание белка в сыворотке крови. Таблица 2. Зависимость между показателем преломления и концентрацией белка Показатель преломления Белок в сыворотке Показатель преломления Белок в сыворотке сыворотки крови крови (%) сыворотки крови крови (%) 1 2 3 4 1,33705 0,63 1,34575 3,68 1,33743 0,86 1,34612 5,90 1,33781 1,08 1,34650 6,12 1,33820 1,30 1,34687 6,14 1,33858 1,52 1,34724 6,55 1,33896 1,74 1,34761 6,77 1,33934 1,96 1,34798 6,98 1,33972 2,18 1,34836 7,20 1,34000 2,40 1,34873 7,42 1,34048 2,62 1,34910 7,63 1,34086 2,84 1,34947 7,85 1,34124 3,06 1,34984 8,06 1,34162 3,28 1,35021 8,28 1,34199 3,50 1,35058 8,49 1,34237 3,72 1,35095 8,71 24 Показатель преломления Белок в сыворотке Показатель преломления Белок в сыворотке сыворотки крови крови (%) сыворотки крови крови (%) 1 2 3 4 1,34275 3,94 1,35132 8,92 1,34313 4 16 1,35169 9,14 1,34350 4,38 1,35205 9,35 1,34388 4,60 1,35242 9,57 1,34426 4,81 1,35279 9,78 1,34463 5,03 1,35316 9,99 1,34500 5,25 1,35352 10,20 1,34537 5,47 1,35388 10,41 Чувствительность метода невелика (0,5–1 %). Ошибка метода в пределах 10 %. Работа 3. Количественное определение общего белка сыворотки крови по биуретовой реакции Белки сыворотки крови при взаимодействии с сернокислой медью в щелочной среде образуют за счет своих пептидных связей комплексные соединения с ионами меди фиолетового цвета. Интенсивность окрашивания раствора находится в прямой зависимости от концентрации в нем белка. Реактивы и оборудование Сыворотка крови биуретовый реактив, рабочий раствор, приготовленный из основного раствора хлористый натрий, 0,9 % раствор, стандартный раствор альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки, 10 % в 0,9 % растворе хлористого натрия. 1 мл раствора содержит 0,1 г белка. Микро пипетки, пипетки емкостью 1 мл с делениями и 5 мл, фотоэлектроколори- метр, штатив с пробирками. Ход работы К мл сыворотки крови прибавляют мл рабочего раствора биуретового реактива, смешивают, избегая образования пены. Через 30 минут (и не позднее, чем через час) измеряют оптическую плотность раствора на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волн 540–560 нм зеленый светофильтр) против контроля. Одновременно ставят контроль. К 0,1 мл 0,9 % раствора хлористого натрия прибавляют 5 мл рабочего биуретового реактива. Далее обрабатывают как опыт. Контроль производят в двух пробирках. Перед фотометрированием жидкость из обеих пробирок смешивают и разливают на две кюветы. Расчет ведут по калибровочному графику. Для его построения из стандартного 10 % раствора альбумина готовят рабочие стандартные растворы, как указано в таблице 3. 25 Таблица 3. Состав смесей для построения калибровочного графика №№ Стандартный раствор 0,9 % раствор Содержание Концентрация белка п/п белка (мл) хлористого натрия (мл) белка в пробег Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и прибавляют по 5 мл рабочего биуретового реактива через 30–60 минут измеряют оптическую плотность на ФЭКе, как в опыте, против контроля. По полученным данным строят калибровочный график. Норма — 6,5–8,5 % белка. Примечание.Содержание белка в стандартном растворе должно быть не меньше 7 %. При содержании белка в сыворотке больше 10 % сыворотку разводят физиологическим раствором, а результаты умножают на коэффициент разведения. |