Ганеева Л. А., Зайнуллин ли, Абрамова З. И
 Скачать 5.05 Mb.
|
|
(С 6 Н 5 СООNа), 12,5 г кристаллического уксуснокислого натрия (СН 3 СОONа) растворяют в 90 мл теплой дистиллированной воды, нагревают содержимое колбы до 50–60 Си тщательно перемешивают. После охлаждения доводят объем дистиллированной водой до 500 мл. Раствор годен в течение 3–4 недель при 5–10 С. Диазосмесь: а) диазореактив I. 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при подогревании в 300–400 мл дистиллированной воды, прибавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты (плотность 1,19 кг / л. Если часть сульфаниловой кислоты остается в осадке, колбу помещают в теплую воду и ее содержимое помешивают. Только после полного растворения сульфаниловой кислоты и охлаждения раствора объем колбы доводят дистиллированной водой дол. Реактив стойкий, хранят в посуде из темного стекла б) диазореактив II. Раствор азотистокислого натрия (NaNO 2 , 0,5 г / дл). Реактив нестойкий, содержится в склянке из темного стекла около 2–3 недели, 169 в холодильнике при 4 С. Первым признаком его непригодности служит появление желтого оттенка. Непосредственно перед выполнением исследований смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II. Физиологический раствор (раствор С, 9 гл. Ход работы В три пробирки(для определения уровня общего билирубина,связанного билирубина и постановки контрольной пробы на цвет сыворотки) вводят реактивы согласно схеме (табл. 18). При определении уровня общего билирубина пробу оставляют при комнатной температуре на 20 минут для развития окраски. В дальнейшем окраска пробы не изменяется. Для установления содержания конъюгированного (связанного) билирубина колориметрирование осуществляют спустя 5–10 минут после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии пробыв реакцию вступает свободный билирубин. Контроль на оптическую плотность раствора сыворотки ставят для каждой опытной пробы. Таблица 18. Данные для определения уровня билирубина в сыворотке крови Общий Конъюгированный Контрольная Реактив связанный) билирубин (мл) проба (мл) билирубин (мл) Сыворотка 0,25 0,25 0,25 Кофеиновый реактив 1,75 — 1,75 Физиологический раствор — 1,75 0,25 Диазосмесь 0,25 0,25 — Примечание. Допускается уменьшение объемов реагентов в2раза при использовании кювет объемом 1 мл с шириной слоя 10 мм. Колориметрируют пробы при зеленом светофильтре (500–560 нм. В случае использования фотометра применяют кювету с шириной слоя 5 мм. Оценку результатов производят по калибровочному графику, построенному в соответствии с инструкцией к наборам реагентов «Билирубин-эталон» фирмы «Лахема» или другим аналогичным. При их отсутствии можно воспользоваться способом Шеллонга и Венде. Весьма хорошие результаты получены при использовании параллельно проводимого через все этапы метода калибратора фирмы «Хоффманн — Ла Рош» (с концентрацией билирубина 89,8 мкмоль / лили близкой к этой точно известной величине. Находят содержание общего и связанного билирубина в мкмоль / л. Для определения уровня несвязанного (свободного) билирубина из цифры общего его содержания вычитают показатель конъюгированного (связанного) билирубина. 170 В норме концентрация общего билирубина в плазме (сыворотке) крови составляет мкмоль / л. 75% его количества приходится на долю свободного билирубина. Средние величины содержания в плазме общего, конъюгированного (связанного) и свободного билирубина составляют соответственно 11,12; 2,57 и 8,56 мкмоль / л. Примечания 1. Некоторые авторы рекомендуют после развития окраски (перед этапом фотометрирования) добавлять в пробы по 3 капли раствора NаОН концентрации 300 гл цвет раствора при этом изменяется на зеленый при большой концентрации щелочи — на синий, часто наблюдается исчезновение мутности. Пробы с полученной окраской следует фотометрировать при красном светофильтре. 2. В случае большой концентрации билирубина сыворотку нужно развести изотоническим раствором в два раза. 3. Интенсивность окраски не меняется в течение 30 минут. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ЖЕЛЧНЫЕ ПИГМЕНТЫ В МОЧЕ Билирубин обычными методами в нормальной моче не открывается, хотя и может находиться в виде следов. Выделение билирубина с мочой повышается билирубинемия) при некоторых формах желтух вследствие гипербилирубине- мии. В этих случаях обычные качественные пробы на билирубин становятся положительными. Билирубинурия встречается главным образом при механическом препятствии оттоку желчи из печени в кишечник (механическая желтуха) или при поражении паренхимы печени (паренхиматозные желтухи, например, болезнь Боткина и др. В мочу переходит только прямой билирубин (моно-и диглюкорониды билирубина. Билирубин непрямой при гемолитической желтухе не переходит в мочу, так как, будучи связанным с белками, он обычно не проникает через почечный фильтр. Присутствие желчных пигментов окрашивает мочу в желто-зеленый или темно-бурый цвет (цвет темного пива. Пена желтушной мочи имеет желтую окраску, что служит для ориентировки. Реакции на желчные пигменты основаны на получении окрашенных продуктов окисления билирубина биливердина (зеленый, билицианина (синий, холетелина (желтый) и др. Из них наименее окисленным является биливердин, наиболее окисленным — холетелин. Наличие двух карбоксильных групп в боковых цепях обусловливает кислотные свойства билирубина и способность его образовывать соли. Соли щелочных металлов растворимы, соли щелочноземельных металлов нерастворимы. При некоторых пробах (с реактивом Фуше, Гупперт — Сальковского) билирубин сначала осаждают в виде бариевой или кальциевой соли, затем переводят его в свободное состояние и обнаруживают по образованию окрашенных продуктов окисления. 171 Работа 39. Обнаружение желчных пигментов в моче с реактивом Фуше Метод основан на окислении билирубина хлорным железом, входящим в состав реактива Фуше, после осаждения его хлоридом бария. При этом образуются окрашенные продукты окисления. Одна из наиболее чувствительных проб для открытия билирубина в моче. Реактивы и оборудование Моча, содержащая желчные пигменты моча нормальная хлористый барий, 15 % раствор реактив Фуше (содержит трихлоруксусную кислоту и хлорное железо. Штатив с пробирками, пипетки емкостью 5 и 10 мл, воронки с бумажными фильтрами, фильтровальная бумага или кусок стекла, капельницы. Ход работы К мл мочи прибавляют мл раствора хлористого бария, смешивают и полученный осадок фильтруют. Фильтр развертывают, раскладывают на сухой фильтровальной бумаге и на осадок наносят 1–2 капли реактива Фуше. При положительной пробе на фильтре появляются сине-зеленые или голубоватые пятна, обусловленные продуктами окисления билирубина. Примечание. Щелочную мочу необходимо подкислять несколькими каплями концентрированной уксусной кислоты. Работа 40. Обнаружение желчных пигментов в моче пробой Гупперт — Сальковского Реактивы и оборудование Моча, содержащая желчные пигменты моча нормальная углекислый натрий, 10 % раствор хлористый кальций, 3 % раствор соляная кислота конц этиловый спирт. Штатив с пробирками, пипетки, воронки с бумажными фильтрами, водяная баня, кипящая. Ход работы 2–3 мл мочи подщелачивают мл раствора соды.При- бавляют 1–2 мл 3 % раствора хлористого кальция. Выпадает желтый осадок, состоящий из углекислого кальция и адсорбированной на нем кальциевой соли билирубина. Осадок отфильтровывают. Подставляют под воронку с фильтром чистую пробирку и осторожно растворяют осадок на фильтре несколькими каплями концентрированной соляной кислоты. Углекислый кальций при этом полностью растворяется, а билирубин переходит под воздействием соляной кислоты в свободное состояние и остается на фильтре. Наливают на фильтр 3– 4 мл спирта. Билирубин при этом растворяется и фильтруется со спиртом и кислотой в пробирку. Кипятят содержимое пробирки в кипящей водяной бане. При наличии билирубина появляется зеленое или синее окрашивание, обусловленное продуктами его окисления. Можно кипятить осадок вместе с фильтром со спиртом, подкисленным 1–2 каплями концентрированной соляной кислоты. 172 Эта проба применима ив тех случаях, когда в моче присутствует кровь, большое количество уробилина и других пигментов. Она открывает 1 часть желчных пигментов в 500 000–1 000 000 частях мочи. Работа 41. Обнаружение желчных пигментов в моче по реакции со спиртовым раствором йода проба Розина) Реакция основана на окислении билирубина мочи в биливердин под действием йода как окислителя. Восстанавливаясь, йод переходит из молекулярного (электронейтрального) в ионное состояние І → Реактивы и оборудование Моча, содержащая желчные пигменты моча нормальная йод, 1 % спиртовой раствор уксусная кислота, 10 % раствор. Штатив с пробирками, пипетки емкостью 5 мл с делениями. Ход работы В пробирку наливают мл мочи(если нужно,подкислен- ной 10 % уксусной кислотой) и осторожно наслаивают 1 % спиртовой раствор йода. При наличии билирубина на границе между обеими жидкостями образуется зеленое кольцо, обусловленное образованием билирубина. Примечания 1. После приема антипирина и при наличии в моче крови проба тоже положительна. 2. Во избежание ошибок во всех сомнительных случаях необходимо ставить пробу с реактивом Фуше. Работа 42. Обнаружение желчных пигментов в моче сконцентрированной азотной кислотой проба Гмелина) Реакция основана на окислении билирубина мочи под влиянием азотной кислоты с примесью азотистой вряд окрашенных в разные цвета продуктов окисления. Реактивы и оборудование Моча, содержащая желчные пигменты моча нормальная азотная кислота (конц, содержащая следы азотистой кислоты (азотистая кислота образуется под воздействием света на азотную кислоту при стоянии ее на свету. Штатив с пробирками, капельницы, пипетки. Ход работы В пробирку вносят20капель концентрированной азотной кислоты и осторожно из пипетки наслаивают мочу так, чтобы обе жидкости не смешивались. При наличии желчных пигментов на границе двух жидкостей появляются зеленое, синее, фиолетовое, красное и желтое кольца в указанной последовательности, что соответствует разным степеням окисления билирубина. Дальше всего от азотной кислоты располагается зеленое кольцо биливердина 173 наименее окисленный продукт, ближе всего к азотной кислоте — желтое кольцо холетелина (наиболее окисленный продукт. При стоянии все кольца окисляются до желтого. Характерным для желчных пигментов является образование верхнего зеленого кольца и одновременно с ним синего или фиолетового. Одно зеленое кольцо без сопровождения синего или фиолетового может получиться с мочой, не содержащей желчные пигменты, после принятия внутрь антипирина. Вопросы и задания для самопроверки 1. Можно ли обнаружить желчные пигменты в нормальной моче обычными реакциями 2. Что такое билирубинурия и каковы причины ее возникновения 3. Какой билирубин (прямой или непрямой) выделяется с мочой 4. В какой цвет окрашивается моча и пена мочи при наличии в ней желчных пигментов 5. На каких свойствах желчных пигментов основаны реакции для их открытия в моче 6. Какое клиническое значение определения желчных пигментов в моче 174 ЛИТЕРАТУРА 1. Бохински Р. Современные воззрения в биохимии. — М. : Мир, 1987. 2. Ленинджер А. Основы биохимии. — М Мирт. Основы биохимии / Под редакцией Анисимова А. А. — М. : Высшая школа, 1996. 4. Березов Т. Т, Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — М. : Медицина, 1990. 5. Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. — М. : Высшая школа, 1993. 6. Биохимия человека / Марри Р, Греннер Д, Мейес П, Родуэлл В. — М. : Мир, 1993. — Т. 1–2. 7. Основы биохимии / Уайт А, Хендлер Ф, Смит Э. и др — М. : Мир, 1981. — Т. 1–3. 8. Досон Р, Эллиот У, Джонс К. Справочник биохимика. — М. : Мир, 1997. 9. Овчинников Ю. А. Биоорганическая химия. — М. : Просвещение, 1987. 10. Тюкавкина НА, Бауков Ю. И. Биоорганическая химия. — М. : Медицина. Ноздрюхина Л. Р. Биологическая роль микроэлементов в организме человека и животных. — М. : Наука, 1977. 12. Кольман Я, Рем КГ. Наглядная биохимия. — М. : Мир, 2000. 13. Гринстейн Б, Гринстейн А. Наглядная биохимия. — М. : Медицина, 2000. 14. Якубке X., Ешкайте X. Аминокислоты, пептиды, белки. — М. : Мир, 1985. 15. Овчинников Ю. А, Шанин АН. Строение и функции белков. — М. : Педагогика, 1983. 16. Кретович В. Л. Введение в энзимологию. — М. : Наука, 1986. 17. Ренненберг Р. Эликсиры жизни. — М. : Мир, 1987 18. Шерстнев М. П, Комаров ОС. Химия и биология нуклеиновых кислот М. : Просвещение, 1990. 19. Филиппович Ю. Б, Егорова ТА, Севастьянова ТА. Практикум по общей биохимии. — М. : Просвещение, 1982. 20. Сиянова НС, Хисамутдинова В. И, Неустроева С. Н. Методическое руководство для практикума по биохимии. — Казань : КГУ, 1988. 21. Кушманова ОД, Ивченко ГМ. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. — М. : Медицина, 1983. 22. Биохимия : практикум / Под ред. НЕ. Кучеренко. — К. : Высшая школа. Биохимия : сборник задачи упражнений / Под ред. НЕ. Кучеренко. — К. : Высшая школа, 1988. 175 24. Филиппович Ю. Б, Севастьянова ГА, Щеголева ЛИ. Упражнения и задачи по биологической химии. — М. : Просвещение, 1976. 25. Сводные вопросы для подготовки студентов к безмашинному самоконтролю по курсу биохимии / Под ред. Ю. Б. Филипповича. — М. : МГПУ, 1990. 26. Чиркин А. А, Данченко Е. О. Биохимия. — Витебск. : Медицинская литература, 2010. 27. Кольман Я, Рем КГ. Наглядная биохимия / Перс нем. — е изд. — М. : Мир, 2012. 28. Биохимия : учебник для вузов / Под ред. Е. С. Северина. — е изд, испр. и доп. — М. : ГЭОТАР-Медиа, 2013. 176 |