Ганеева Л. А., Зайнуллин ли, Абрамова З. И
 Скачать 5.05 Mb.
|
|
ѕ•суточный диурез / 1 мл, где С — концентрация азота, найденная по калибровочному графику В — разведение мочи враз мл — количество минерализата, взятого для анализа 10 3 — коэффициент перевода миллиграммов в граммы. Суточное выделение мочи в среднем 1 500 мл. По количеству азота, выделенного с мочой за сутки, можно определить количество распавшегося в организме белка. Для этого полученную в результате расчета величину умножают на 6,25, исходя из того, что в белке в среднем содержится азота (100:16 = 6,25). Вопросы и задания для самопроверки 1. Каковы пути превращения аминокислот в организме млекопитающих 2. Каковы метаболические пути новообразования аминокислот Приведите уравнения реакций. Какие аминокислоты не могут синтезироваться в организме человека и должны поступать с пищей 3. Какие аминокислоты синтезируются в организме млекопитающих реакцией восстановительного аминирования Напишите уравнение реакции восстановительного аминирования для одной из них, укажите фермент, катализирующий данный процесс. 4. Каковы метаболические пути деструкции аминокислот Приведите уравнения реакций, назовите ферменты. 5. Какая реакция распада аминокислот по аминогруппе преимущественно протекает в организме млекопитающих Приведите уравнение реакции для глутаминовой кислоты, назовите фермент. 6. Напишите уравнение реакции декарбоксилирования для триптофана, назовите фермент. Каковы физиологические функции образующихся в результате декарбоксилирования аминокислот, биогенных аминов 7. Какие основные метаболиты, включающиеся в цикл ди- и трикарбоновых кислот, образуются при деструкции радикалов аминокислот Напишите структурные формулы этих веществ. 8. Каковы пути обезвреживания аммиака в организме, образующегося при дезаминировании аминокислот Какие аминокислоты являются акцепторами аммиака в момент его образования в клетке Напишите уравнение реакции образования глутамина, назовите фермент. 50 9. Каковы основные этапы цикла мочевины Где он локализован Почему его называют орнитиновым циклом Приведите уравнения реакций цикла мочевины, назовите ферменты. Какое количество молекул АТФ затрачивается на синтез мочевины в орнитиновом цикле 10. Какие метаболиты цикла мочевины связаны с циклом лимонной кислоты Покажите эту взаимосвязь при помощи уравнений реакций. 11. Какие типы азотистого обмена выработали живые организмы в процессе эволюции Какое соединение является конечным продуктом азотистого обмена у млекопитающих У птиц У костистых рыб Почему 12. Под действием трансаминазы мышц крысы в реакции между α-кето глутаратом и аланином за один час образовалось 110 мг глутамата. Какое количество глутамата образуется за два часа под действием трансаминазы печени, активность которой к аланину в пять раз выше, чему трансами назы мышц Напишите уравнение реакции трансаминирования между α- кетоглутаратом и аланином. Каков механизм данной реакции Каким образом влияет на трансаминирование недостаток и отсутствие витамина В 13. Человек весом 70 кг ежедневно получает с пищей 3 000 ккал и выделяет 27,0 г мочевины. Какая доля его ежедневной потребности в энергии (%) компенсируется выделением 0,16 г азота в форме мочевины 51 ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТЫ Ферменты — катализаторы белковой природы, образующиеся и функционирующие во всех живых организмах. Ферменты являются необычайно мощными биокатализаторами, как правило, намного превосходящими по своей эффективности синтетические катализаторы. Они высоко специфичны по отношению к своим субстратами ускоряют строго определенные химические реакции без образования побочных продуктов. Ферменты обеспечивают осуществление важнейших процессов жизнедеятельности реализацию наследственной информации, биоэнергетику, синтез и распад биомолекул. Организованная последовательность процессов обмена возможна при условии, что каждая клетка обеспечена собственным генетически заданным набором ферментов. Только при этом условии осуществляется упорядоченная последовательность химических реакций, проходящих с высокой продуктивностью. НОМЕНКЛАТУРА И КЛАССИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ К настоящему времени идентифицировано свыше 2 000 различных ферментов, каждый из которых катализирует какую‑то определенную химическую реакцию. Первоначально ферментам давали названия, образуемые путем добавления окончания -аза к названию субстрата. Так, ферменты, гидролизующие крахмал (амилон), были названы амилазами, ферменты, гидролизующие жиры (липос), липазами и т. д. Позднее ферментам, катализирующим сходные по типу реакции, стали давать названия, указывающие тип соответствующей реакции. Номенклатура, введенная Международным биохимическим союзом (IUB), состоит в том, что ферменты называют и классифицируют в соответствии с типом катализируемой химической реакции. Все известные на сегодняшний день ферменты включены в Каталог ферментов под своим классификационным номером (КФ), состоящим из четырех цифр. Первая цифра указывает на принадлежность к одному из шести классов. Следующие две цифры определяют подкласс и подподкласс, а последняя — номер фермента в данном подподклассе. Например, лактатдегидрогеназа имеет КФ: 1.1.1.27 (класс 1 оксидоредуктаза, подкласс 1 донор электрона СН—ОН, подподкласс акцептор НАД. Кроме научных систематических названий в ферментологии используются и тривиальные названия, например пепсин, трипсин, папаин, цитохромы и др. Классификация ферментов строго научная и основана на типе реакции, подвергающейся каталитическому воздействию. Поэтому принципу все ферменты делятся на шесть классов. В каждом из шести классов объединены ферменты, обладающие одинаковой реакционной специфичностью. Оксидо- редуктазы (класс1)катализируют окислительно-восстановительные реакции. Трансферазы (класс2)переносят ту или иную функциональную группу от одного субстрата на другой. Гидролазы (класс 3) также участвуют в переносе групп, однако акцептором являются молекулы воды. Лиазы (класс 4) катализируют расщепление или образование химических соединений, при этом образуются или исчезают двойные связи. Поскольку ферменты го класса участвуют в реакциях образования химических соединений, их также называют синта-зами. Изомеразы (класс5)перемещают группы в пределах одной молекулыбез изменения общей формулы субстрата. Лигазы, или синтетазы, (класс 6) катализируют энергозависимые реакции синтеза (чаще всего за счет расщепления АТФ. Таблица 7. Классы ферментов Класс Тип реакции Важнейшие подклассы 1. Оксидоредукторы Окислительно-восстановительная Дегидрогеназы S окисл. + S' восст. = S' окисл. + S восст. Оксидазы Пероксидазы Редуктазы Монооксигеназы Диоксигеназы 2. Трансферазы Трансферазная — перенос функциональных С трансферазы групп Гликозилтрансферазы S –A + S' = S'–A + S Аминотрансферазы Фосфаттрансферазы Ацилтрансферазы 3. Гидролазы Гидролиз связей Эстеразы АВ-субстрат АВ + НА Н + ВОН Гликозидазы Пептидазы Амидазы 4. Лиазы (синтазы) Негидролитическое расщепление связей С–С-Лиазы ABC- субстрат АВС = АВ + С С–О-Лиазы С – С, Н, NH 3 C –N-Лиазы С–S-Лиазы 5. Изомеразы Взаимопревращения структурных, геометриче- Эпимеразы ских, оптических изомеров Цис, транс-изомеразы S = изо Стереоизомеразы 6. Лигазы (синтетазы) Реакции присоединения двух молекул сопря- С–С-Лигазы женные разрывом фосфатных связей АТФ С–О-Лигазы S + S' + АТФ = SS' + АДФ + Н 3 РО 4 С–N-Лигазы S + S' + АТФ = SS' + АМФ + Н 4 Р 2 О 7 С–S-Лигазы 53 СТРОЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ Построению ферменты могут быть однокомпонентными — простые белки и двухкомпонентными — сложные белки. Во втором случаев составе ферментов обнаруживается добавочная группа небелковой природы. Белковую часть двухкомпонентных ферментов называют апоферментом, а небелковую часть — кофактором. Кофактор условно разделяют на кофермент легко диссоциирующий, и простeтическую группу, труднодиссоциирующую.Ко- фермент легко присоединяется к различным апоферментам, а простетическая группа соединяется с одними тем же апоферментом. Функции и свойства апофермента и кофактора следующие апофермент термолабилен, определяет специфичность фермента, участвует в соединении фермента с субстратом активирует кофактор; кофактор термостабилен, стабилизирует апофермент, участвует в катализе. Кофермент можно рассматривать как второй субстрат, или косубстрат, по двум причинам. Во-первых, входе реакции кофермент претерпевает химические изменения, в точности противоположные изменениям, которые происходят в субстрате. Например, в окислительно-восстановительных дегидрогеназных реакциях молекула субстрата окисляется, а молекула кофермента восстанавливается. Вторая причина, по которой кофермент можно считать равноправным участником реакции, заключается в том, что именно его участие может иметь фундаментальное физиологическое значение. Например, работа мышцы в анаэробных условиях сопровождается превращением пирувата в лактат. Нов этом случае важны совсем не лактат и не пируват: предназначением реакции является превращение НАДН в НАД. В отсутствии НАД гликолиз продолжаться не может и анаэробный синтез АТФ (а следовательно, и работа мышцы) прекращается. Восстановление пирувата до лактата в анаэробных условиях обеспечивает окисление НАДН в НАД, необходимый для синтеза АТФ. Химическая природа коферментов достаточно хорошо изучена. Оказалось, что роль коферментов играет большинство витаминов (Е, КВ, В, В, В, В, PP, Ни др, многочисленная группа нуклеотидов и их производных, фосфорные эфиры моносахаридов, глутатион и ряд других веществ. Нуклеозидфосфаты являются не только исходными соединениями в биосинтезе нуклеиновых кислотно и служат для запасания энергии, а также обладают функциями коферментов. Метаболические интермедиаты часто становятся реакционноспособными (активированными) при присоединении фосфатсодержащих остатков. Так, например, аминоспирт холин активируется в результате образования ЦДФ-холина (синтез фосфолипидов, глюкоза активируется в результате образования УДФ-глюкозы (синтез полисахаридов) и т. д. Остатки жирных кислот активируются путем переноса на кофермент А. Тиоэфир, каким является ацил-КоА, представляет собой активированную форму карбоновой кислоты, так как образующий ее ацильный остаток может легко 54 переноситься на другую молекулу. Тиаминпирофосфат активирует альдегиды, кетоны и переносит их в виде гидроксильных групп на другую молекулу. Таблица 8. Некоторые коферменты и их биохимическая роль Кофермент Переносимые группы Ферменты Символ Название АТФ Аденозинтрифосфат Фосфат-анионы Фосфаттрансферазы УДФ Уридиндифосфат Гликозильные — остатки Гликозилтрансферазы глюкоза и др) ЦДФ Цитидиндифосфат Глицеролфосфаты, ЦДФ-диглицерид- холин и др) синтаза Холинтрансфераза НАД Никотинамидадениндинуклеотид Гидрид-ионы (Н) Дегидрогеназа ФАД Флавинадениндинуклеотид Атомы водорода Дегидрогеназа HS-KoA Кофермент А Ацильные группы Ацилтрансфераза ТПФ Тиаминпирофосфат Альдегидные группы Декарбоксилаза Гидроксиалкильные Дегидрогеназа остатки Транскетолаза ПФ Пиридоксальфосфат Аминогруппы Трансаминазы Карбоксисинтетазы Н Биотин СО Транскарбоксилазы Т Тетрагидрофолат С группы формил, С трансферазы метилен, метил Пиридоксальфосфат является важнейшим коферментом в метаболизме белков, участвуя в реакциях трансаминирования, декарбоксилирования, дегидратирования аминокислот. Все дегидрогеназы нуждаются в коферменте для переноса восстановительных эквивалентов (НАД, НАДФ, ФАД, ФМН и др. Характерной особенностью двухкомпонентных ферментов является то, что ни белковая часть, ни добавочная группа в отдельности не обладают заметной каталитической активностью. Только их комплекс проявляет ферментативные свойства. При этом белок резко повышает каталитическуто активность кофактора. Таким образом, хотя активным центром двухкомпонентных ферментов являются простетические группы — коферменты, их действия невозможны безучастия апофермента. Однокомпонентные ферменты формируют каталитический центр аминокислотными остатками, имеющими в радикалах функциональные группы. Чаще всего в активных центрах однокомпонентных ферментов встречаются остатки сер, гис, тир, арг, цис, асп, глу, тре. Радикалы перечисленных аминокислот выполняют туже функцию, что и кофакторы в составе двухкомпонентного фермента. Аминокислотные остатки, образующие активный центр однокомпонентного фермента, расположены в различных точках единой полипептидной цепи, следовательно, каталитический центр возникает в тот момент, когда белковая молекула фермента приобретает присущую ей третичную структуру. Так, например, в активный центр химотрипсина входят гис-57, асп-102, сер-195,всего фермент состоит из246аминокислотных остатков. Химотрипсин, как и другие протеолитические ферменты, синтезируется в неактивной форме, в форме профермента — химотрипсиногена. При активации химотрипсиногена трипсином и π-химотрипсином гидролизуются четыре пептидные связи, в результате чего происходит удаление дипептидных фрагментов и формирование активного центра, сближение й, й, й аминокислот, участвующих непосредственно в акте катализа. Аллостерический центр фермента представляет собой участок белковой молекулы, в результате присоединения к которому низкомолекулярного (редко высокомолекулярного) соединения изменяется третичная структура, вследствие этого либо увеличивается, либо снижается каталитическая активность фермента. Молекулярные массы ферментов колеблются в широких пределах от нескольких тысяч до нескольких миллионов. Большинство ферментов имеют высокую молекулярную массу и построены из субъединиц. Например, каталаза, РНК-полимераза, глутаматдегидрогеназа построены из шести субъединиц. Мультимер проявляет максимальную каталитическую активность, диссоциация на субъединицы (протомеры) резко снижает каталитическую активность фермента. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ Действие большинства ферментов высоко специфично. Понятие специфичности относится не только к типам каталитических реакций, но и к природе субстратов. Ферменты специфически связывают субстраты в активном центре. При этом субстраты ориентируются таким образом, что приобретают оптимальное положение для образования переходного состояния (фермент-суб- стратного комплекса. Сближение и необходимая ориентация реагентов значительно повышает вероятность образования продуктивного комплекса. Если обозначить фермент Е, субстрат S, активированный субстрат S', продукт реакции Р, то механизм действия ферментов можно выразить достаточно простой схемой Е + S ES → ES' → ЕРЕ+ Р Эта схема первоначально была разработана В. Генри (1903 г, затем Л. Ми-хаэлисом и М. Ментен (1913 г) и подтверждена прямым выделением ES-, ES'- и ЕР-комплексов. Связывание субстрата с активным центром фермента приводит к удалению гидратной оболочки субстрата. В результате удаления молекул воды в активном центре фермента вовремя катализа создаются совершенно другие условия, чем в растворе. Еще одним важным фактором является стабилизация переходного состояния вследствие взаимодействия между аминокислотными остатками фермента и субстратом. Таким образом, переходное состояние в случае ферментативной реакции требует меньшей энергии активации. Большинство ферментов вовремя катализа переносят специфические группировки с субстрата на субстрат. Особенно часто осуществляется перенос протонов кислотно-основный катализ. Этот ферментативный кислотно-основ-ный катализ значительно более эффективен, чем обмен протонов с кислотами и основаниями в растворе. Достаточно часто различные химические группировки ковалентно присоединяются к аминокислотным остаткам ферментов — ковалентный катализ. На основе общих закономерностей ферментативного катализа можно рассмотреть механизм действия лактатдегидрогеназы. Активной формой лак- татдегидрогеназы является тетраметр. Каждая из четырех субъединиц образована полипептидной цепью из 334 аминокислотных остатков, каждый мономер содержит активный центр. Коферментом лактатдегидрогеназы является никотинамидадениндинуклеотид (НАД. В окислительно-восстанови- тельных реакциях НАД-кофермента участвует только никотинамидное кольцо. На НАД переносится только гидрид-ион (Н, два электрона и один протон. Второй протон высвобождается в среду и, следовательно, правильное наименование восстановленной формы кофермента НАДН + Н + Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует передачу восстановительного эквивалента от лактата на НАД или от НАДН на пируват: лактат + НAД + пируват + НАДН + Н+ Равновесие реакции сдвинуто в сторону образования лактата. ЛДГ катализирует реакцию в обоих направлениях, но подобно всем ферментам не влияет на положение химического равновесия. В активном центре ЛДГ находятся арг-171, арг-109, гис-195. г, арг- 171 протонированы постоянно, а гис-195 меняет свой заряд вовремя катализа. Положительно заряженная гуанидиновая группировка арг-171 связывается за счет электростатического взаимодействия с карбонильной группой субстрата. Арг-109 стабилизирует переходное состояние. Имидозольная группа гис-195 принимает участие в кислотно-основном катализе. Кофермент НАДН связывается первым, за ним субстрат. Образование переходного состояния облегчается вследствие оптимального расположения карбонильной группы субстрата и никотинамидного кольца кофермента, а также сильно пониженной полярности активного центра фермента. В переходном состоянии гидрид-ион переносится с кофермента на карбонильный углерод субстрата. При этом временно образующийся энергетически невыгодный отрицательный заряд на кислороде стабилизируется электростатическим взаимодействием с арг-109. Одновременно осуществляется перенос протона с гис-195 на атом кислорода, приводя к образованию связанных с ферментом 57 лактата и НАД. Лактат диссоциирует с фермента и временно незаряженная имидозольная группа гис-195 снова присоединяет протон из окружающей воды. Затем освобождается окисленный кофермент НАД, и снова достигается исходное состояние фермента. При окислении лактата в пируват протекают те же стадии, нов противоположном направлении. Работа 13. Изучение действия ферментов Ферменты в отличие от органических или неорганических веществ присутствуют в клетках в чрезвычайно малых количествах, и определение их содержания в тканевых экстрактах или биологических жидкостях представляет особую проблему. Чтобы оценить количество фермента, измеряют скорость реакции, пропорциональной количеству присутствующего фермента. Поскольку трудно определить число молекул фермента, количественно определяют либо субстрат, либо продукт. Единицы активности фермента выражают в микромолях, наномолях, пикомолях израсходованного субстрата или образовавшегося продукта за единицу времени (в минуту. Чтобы качественно оценить действие фермента, проводят качественные реакции на субстраты или продукты реакции, кроме того, ферментативный катализ можно оценивать по изменению окраски индикаторов, вносимых в реакционную среду. Действие амилазы (КФ 3.2.1.1) Амилаза (класс гидролаза, подкласс гликозидаза) катализирует гидролитическое расщепление внутренних α(1-4)-гликозидных связей без какого-либо порядка с образованием вначале олигосахаридов и затем мальтозы. Ферментативный гидролиз крахмала происходит ступенчато через стадии образования декстринов. Наличие и динамику их образования легко установить, прослеживая изменение окраски с йодом нерасщепленный крахмал дает с йодом синее окрашивание, амилодекстрины — фиолетовое, эритродекстри- ны — красно-бурое, ахродекстрины и мальтоза — желтое. Крахмал + Н → амилодекстрины → эритродекстрины → ахродекстрины → мальтоза. В природе найдены различные амилазы амилазы, амилазы и γ- амилазы (глюкоамилазы), которые различаются по своим свойствам, распространению в природе и способу действия на крахмал. Амилаза содержится в слюне, соке поджелудочной железы, проросших семенах злаков, в плесневых грибах и бактериях, амилаза является эндоами-лазой, главным конечным продуктом является мальтоза. Амилаза содержится в непроросших семенах пшеницы, ржи, ячменя, β- амилаза ускоряет реакции гидролиза амилозы, амилопектина, гликогена с нередуцирующего конца, отщепляя остатки мальтозы. Конечным продуктом на 100 % является мальтоза. Амилаза содержится в плесневых грибах. Глюкоамилаза (амилаза) ускоряет гидролиз α(1-4)-гликозидных связей в молекуле крахмала, олигосахаридов и даже мальтозы с нередуцирующего конца с образованием глюкозы. Характерной особенностью амилаз является отсутствие абсолютной специфичности действия. При их участии гидролизуются различные соединения амилоза, амилопектин, гликоген, олигосахариды и родственные им вещества, построенные из остатков α-D-глюкопиранозы и содержащие α(1-4)- гликозидные связи. Активные центры амилаз образованы радикалами гистидина, тирозина и дикарбоновых аминокислот (асп, глу). В лабораторной практике удобно работать с амилазой, выделенной из слюны. Реактивы и оборудование Крахмал (1 %), йод (1 % раствор в 3 % растворе йодида калия, гидроксид натрия (10 %), сульфат меди (5 %), дистиллированная вода. Стаканы на |