Ганеева Л. А., Зайнуллин ли, Абрамова З. И
 Скачать 5.05 Mb.
|
|
100 мл, мерные цилиндры на 50 мл, стеклянные воронки, вата, пипетки на 1 и 2 мл, стеклянные пластинки и палочки, пробирки. Ход работы А Приготовление препарата амилазы.Рот ополаскивают2–3 раза водой. Отмеряют 50 мл дистиллированной воды и ополаскивают ею рот в течение 3–5 минут в несколько приемов. Собранную жидкость фильтруют через вату и фильтрат используют в качестве источника фермента. Б В две пробирки наливают по мл раствора крахмала.В первую пробирку добавляют 1 мл раствора слюны, во вторую — 1 мл дистиллированной воды (контроль. Содержимое пробирок перемешивают и помещают в термостат при 37 С. Через одну минуту из каждой пробирки отбирают по 1 капле жидкости и смешивают на стеклянной пластинке с каплей йода. Повторяют взятие 59 проб через каждые 2 минуты и по окраске йодных проб делают вывод о гидролизе крахмала. Присутствие в гидролизате мальтозы и глюкозы устанавливают с помощью реакции Троммера (или Фелинговым реактивом, в основе которой лежит окислительно-восстановительная реакция. В пробирку наливают 1–2 мл гидролизата и равный объем 10 % раствора гидроксида натрия. Затем по каплям при встряхивании прибавляют 5 % раствор сульфата меди до появления неисчезающей мути гидроксида меди (II). Осторожно нагревают верхнюю часть содержимого пробирки, появляется желтое окрашивание, переходящее в красное, что указывает на положительную реакцию Троммера. О действии фермента судят по исчезновению субстрата или появлению продуктов реакции. Действие пепсина (КФ 3.4.23.1) Пепсин (класс гидролаза, подкласс пептидаза) ускоряет гидролитическое расщепление пептидных связей, образованных карбоксильными группами фенилаланина, лейцина Пепсин — эндопептидаза, те. ускоряет гидролиз внутренних пептидных связей белка с образованием полипептидов. В активном центре фермента находятся радикалы дикарбоновых кислот. Пепсин содержится в желудочном соке животных и человека в неактивной форме (пепсиноген) и активируется в присутствии соляной кислоты по механизму аутокаталитического действия самого пепсина. Оптимальным условием действия пепсина является pH 0,9– 1. Если секреция HCl не обеспечивает такой кислотности, гидролиз белков резко ухудшается. Реактивы и оборудование Яичный белок, пепсин (или желудочный сок, 1 М соляная кислота. Стеклянные трубки диаметром 2–3 мм, водяная баня. Ход работы Две стеклянные трубки наполняют яичным белком и подогревают (около 85 С) до осаждения белка. Затем одну трубку опускают в раствор пепсина (желудочный сок, другую — в 1 М раствор соляной кислоты. Через некоторое время впервой трубке белок начинает растворяться, а в другой не изменяется. Отмечают по секундомеру время реакции гидролиза белка. 60 Действие уреазы (КФ 3.5.1.5) Уреаза (класс гидролаза, подкласс амидгидролаза) обладает абсолютной субстратной специфичностью действия и ускоряет расщепление амидной связи только мочевины с образованием углекислого газа и аммиака СО + НО → 2NH 3 + СО Уреаза (карбамидгидролаза) — один из первых ферментов, полученных в кристаллическом виде. Это однокомпонентный фермент, молекула его глобу- лярна, состоит из восьми равных субъединиц. О действии уреазы судят по смещению pH раствора в щелочную зону за счет образовавшегося аммиака. Реактивы и оборудование Соевая мука, 0,1 М соляная кислота, толуол, дистиллированная вода, мочевина, фенолфталеин (1 % спиртовой раствор. Пробирки, пипетки на 1 мл, стаканы, воронки, марля (фильтр. Ход работы А. Приготовление препарата уреазы.К8 г соевой муки прибавляют 46 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,1 М раствора соляной кислоты перемешивают, вносят несколько капель толуола и оставляют на ночь, после чего отфильтровывают. Б. В две пробирки наливают по мл раствора мочевины и п капель % спиртового раствора фенолфталеина. В одну из пробирок добавляют 5 мл препарата уреазы, в другую дистиллированную воду и перемешивают. Через некоторое время наблюдают водной из пробирок (с уреазой) окрашивание в розовый цвет. Действие каталазы (КФ 1.11.1.6) Каталаза (класс оксидоредуктаза, подкласс пероксидаза) ускоряет реакцию расщепления пероксида водорода НО → НО + О В этой реакции одна молекула пероксида водорода окисляется и служит донором электронов, а другая восстанавливается и является акцептором электронов. Процесс передачи электронов при окислении и восстановлении пероксида водорода осуществляется железом, входящим в геминовую группировку каталазы. Каталаза — фермент двухкомпонентный, содержащий четыре гемовых группы, близких к гему гемоглобина. Биологическая роль каталазы заключается в предохранении организма от токсического действия пероксида водорода, образующегося вследствие процессов окисления. Каталаза широко распространена в растительном и животном мире. Особенно много ее содержится в эритроцитах крови ив тканях печени. Реактивы и оборудование Кровь, 3 % свежеприготовленный раствор пероксида водорода, дистиллированная вода. Пробирки, секундомер. 61 Ход работы В две пробирки наливают по мл свежеприготовленного раствора пероксида водорода. В одну из пробирок добавляют 0,5 мл свежей крови и перемешивают, в другую — 0,5 мл НО (дистиллированной. В пробирке с кровью появляются пузырьки. В пробирке без каталазы пузырьки газа не образуются. По секундомеру отмечают время протекания реакции (по выделению пузырьков кислорода. Действие липазы (КФ 3.1.1.3) Триацилглицеринлипаза (класс гидролаза, подкласс эстераза) ускоряет гидролиз триглицеридов (жиров) ступенчато, вначале быстро гидролизуются внешние сложноэфирные связи, а затем медленно идет гидролиз 2- моноглицерида. Липазы широко распространены в растениях (семена, вегетативные органы, микроорганизмах, животных. В активном центре панкреатической липазы находятся аминокислотные остатки гис, сер иле асп, глу. Как ив случае других гидролаз гис служит для переноса протонов, а сер для ацептирования ацильной группы, иле взаимодействует с углеводородным радикалом остатка высшей жирной кислоты и способствует закреплению молекулы триглицерида в активном центре фермента. Активность липаз регулируется путем их фосфорилирования — дефос-форилирования. Реактивы и оборудование Препарат липазы (вытяжка из поджелудочной железы или 5–7 % раствор панкреатина, растительное масло, гидрокаробонат натрия (1 %), фенолфталеин (1 % спиртовой раствор. Пробирки, пипетки, термостат. Ход работы В две пробирки вливают по мл подсолнечного масла, 4 мл дистиллированной воды, 5 мл гидрокарбоната натрия и энергично встряхивают до образования эмульсии. Липаза ускоряет гидролиз только эмульгирован- ных жиров. После эмульгирования прибавляют 5 капель фенолфталеина, затем в одну из пробирок вливают 1 мл препарата липазы, перемешивают и помещают пробирки в термостат при 38 С. Через некоторое время, в зависимости от активности фермента, раствор в пробирке с липазой становится бесцветным, вследствие образования жирных кислота в пробирке без липазы розовая окраска не исчезает. 62 Работа 14. Изучение влияния различных факторов на скорость ферментативных реакций Скорость ферментативных реакций зависит от многих факторов концентрации субстрата, концентрации фермента, pH среды, температуры, наличия активаторов и ингибиторов. Влияние температуры на активность амилазы слюны Одним из характерных свойств ферментов является термолабильность, те. чувствительность фермента к температуре, при которой протекает ферментативная реакция. В некотором ограниченном интервале температуры скорость ферментативной реакции повышается с ростом температуры. Коэффициент, показывающий, во сколько раз повышается скорость реакции при повышении температуры на 10 С, называется температурным коэффициентом. Для многих биохимических реакций при повышении температуры на 10 С скорость удваивается и аналогично при понижении температуры на 10 С уменьшается вдвое. Для большинства ферментов максимальная ферментативная скорость наблюдается при 38–40 С. Эта температура называется температурным оптимумом. При дальнейшем повышении температуры происходит разрыв связей, поддерживающих вторичную и третичную структуру, те. происходит тепловая денатурация, сопровождающаяся потерей каталитической активности. Скорость расщепления крахмала под влиянием амилазы определяют по окрашиванию раствора крахмала и продуктов его гидролиза йодом. Реактивы и оборудование Крахмал (1 %), йод (7 % раствор в 3 % растворе йодида калия, препарат слюны, лед. Стеклянные пробирки, пластинки, палочки, пипетки на 1 и 5 мл, термостат, большие стаканы для льда, штативы для пробирок. Ход работы В четыре пробирки наливают по мл раствора крахмала. Первую пробирку помещают в термостат при 100 С, вторую — в термостат при 40 С, третью — в лед, четвертую оставляют при комнатной температуре. Через 10 минут вовсе пробирки (оставляя их в тех же условиях) прибавляют по 1 мл раствора слюны и перемешивают стеклянной палочкой. Через 1 минуту из всех пробирок отбирают по одной капле и проводят на стеклянных пластинах йодные пробы. Отбор проб проводят через каждые 2 минуты. По изменению окрашивания йодных проб судят о степени гидролиза в каждой пробирке. Результаты опыта заносят в таблицу 9, помечая буквой С (синяя окраска, буквой К (окраска красных тонов, буквой Ж (желтая окраска. На основании опытных данных делают вывод о величине температурного оптимума для амилазы слюны, полученные результаты выражают графически, откладывая на оси абсцисс температуру в градусах Цельсия, а на оси ординат скорость реакции в обратных минутах. 63 Таблица 9. Результаты наблюдений № пробирок Температура (С) Йодная проба (время указывается в минутах) 1 2 4 6 8 10 12 1 100 2 40 3 20 4 0 Влияние pH на активность амилазы Для разных ферментов существует свой оптимум pH, при котором фермент наиболее активен. Например, для ферментов желудочного сока оптимум pH 1–2, для ферментов двенадцатиперстной кишки pH 7,7, для ферментов печении т. д. Большинство ферментов имеют максимальную активность в зоне pH ближе к нейтральной. Зависимость активности фермента от pH определяется следующими факторами во‑первых, денатурацией фермента при очень высоких или низких значениях pH; во‑вторых, изменением величины заряда молекул субстрата или фермента в‑третьих, конформационными изменениями фермента. Для поддержания активной третичной структуры может оказаться необходимым присутствие заряда на определенной группе, если заряд этой группы изменится, то может произойти частичное развертывание белковой цепи или, наоборот, компактизация молекулы, или ее диссоциация на протамеры и во всех случаях с потерей активности. Оптимум pH для амилазы слюны можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях pH среды. Для амилазы слюны оптимума в кислой или щелочной среде активность амилазы снижается. Реактивы и оборудование Препарат слюны, 0,2 М раствор гидроортофосфата натрия, 0,2 М раствор дигидроортофосфата натрия, крахмал (1 %), 1 % раствор йода в 3 % растворе йодида калия. Штатив с набором стеклянных пробирок, пипетки на 1 и 5 мл, капельные пипетки, термостат. Ход работы А Пользуясь данными таблицы10,приготовить в шести пробирках буферные растворы с различными значениями pH. Таблица 10. Приготовление фосфатных буферных растворов pH 0,2 МОМ ОМОМ О мл) мл) мл) мл) 5,8 0,40 4,60 7,2 3,60 1,40 6,2 0,92 4,08 7,6 4,35 0,65 6,8 2,45 2,55 8,0 4,73 0,27 64 Б Затем приливают в каждую пробирку по мл раствора крахмалаи по 1 мл раствора слюны, тщательно перемешивают содержимое пробирок. Пробирки помещают в термостат при 38 Сна минут. После инкубации вовсе пробирки добавляют по 5 капель раствора йода, перемешивают, наблюдают окраску и отмечают активность. Для наглядности в каждую пробирку можно добавить немного дистиллированной воды и размешать. На основании опытных данных делают вывод о оптимуме амилазы слюны. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы Активаторы и ингибиторы влияют на активный центр фермента, способствуют образованию его или блокированию. Активаторы и ингибиторы могут взаимодействовать и с аллостерическим центром фермента и тем самым изменять его каталитическую активность. Например, сульфат меди оказывает тормозящее действие на активность амилазы, а хлорид натрия является ее активатором. О влиянии этих веществ на активность амилазы судят по степени гидролиза крахмала под влиянием фермента в присутствии хлорида натрия и сульфата меди. Реактивы и оборудование Хлорид натрия (1 %), сульфат меди (1 %), препарат слюны, крахмал (0,5 %), 1 % раствор йода в 3 % растворе йодида калия. Штатив с пробирками, пипетки на 1, 2, 5 мл, термостат. Ход работы Готовят три пробирки.В первую наливают мл воды,во вторую — 2 мл воды и 0,5 мл 1 % раствора хлорида натрия, в третью — 2 мл воды и 0,5 мл 1 % раствора сульфата меди. Вовсе пробирки вносят по 2,5 мл раствора слюны, перемешивают и добавляют по 2,5 мл 0,5 % раствора крахмала, перемешивают и помещают в термостат при 38 С. Через 5 минут вовсе пробирки прибавляют по 5 капель раствора йода, наблюдают окраску и определяют, каким образом изменяют активность амилазы хлорид натрия и сульфат меди. Работа 15. Специфичность действия ферментов Способность фермента катализировать одну и только одну специфическую реакцию является наиболее важным его свойством. Благодаря этому скорости метаболических процессов могут регулироваться путем изменения каталитической активности ферментов. Многие ферменты катализируют реакции одного типа (перенос фосфата, окислительно-восстановительные реакции и т. д, субстратами при этом являются структурно сходные соединения. Реакции с альтернативными субстратами происходят в тех случаях, когда эти субстраты присутствуют в высоких концентрациях. Таким образом, понятие специфичности относится и к типам каталитических реакций (реакционная специфичность, и к природе субстратов (субстратная специфичность. 65 В общем случае ферменты действуют на специфические химические группировки, например, гликозидазы катализируют гидролиз гликозидных связей, они высокоспецифичны как к сахарному фрагменту, таки к характеру глико- зидной связи (α или β). Протеолитические ферменты катализируют гидролиз пептидных связей. Действие этих ферментов распространяется на большое число субстратов, что позволяет организму обойтись небольшим числом пищеварительных ферментов. Однако отдельные пептидазы отличаются высокой групповой специфичностью, так, например, химотрипсин гидролизует преимущественно те пептидные связи, в которых карбоксильная группа принадлежит ароматическим аминокислотам (фен, три, тир. Некоторые ферменты обладают абсолютной реакционной и субстратной специфичностью, так, например, уреаза катализирует только гидролиз мочевины. Однако таких ферментов немного. Большая часть ферментов обладает абсолютной оптической специфичностью (кроме эпимераз). Так, например, ферменты гликолитического и прямого окислительного пути углеводов катализируют превращения только D-, ноне L-фосфосахаров, ферменты белкового обмена (в организме человека и животных) катализируют превращение только изомеров аминокислот. Реактивы и оборудование Дрожжевая сахароза сахароза (0,5 %); 0,1 М фосфатный буфер к 61,0 мл 0,2 М раствора О приливают 39 мл 0,2 М раствор О и доводят объем дистиллированной водой до 200 мл препарат слюны крахмал (0,5 %); 1 % раствор йода в 3 % растворе йодида калия, реактив Фелинга: готовят два раствора. А. 134,6 г медного купороса в 500 мл раствора. Б. 173 г сегнетовой соли и 70 г гидроксида натрия в 500 мл раствора. Растворы хранят отдельно. Перед употреблением смешивают равные объемы растворов Аи Б препарат уреазы см. работу 13); мочевина (5 %); тиомочевина 1 % спиртовой раствор фенолфталеина. Стеклянные стаканы, воронки, мерные цилиндры на 20 мл, штативы с пробирками, пипетки на 1 и 5 мл, бумажные фильтры, фарфоровые ступки с пестиком, кварцевый песок, термостат, спиртовки. Специфичность действия сахаразы и амилазы Сахараза и амилаза — ферменты, относящиеся к классу гидролаз, подклассу гликозидаз, те. ускоряют реакции гидролитического расщепления сахаров. Гликозидазы высокоспецифичны как к сахарному фрагменту, таки к характеру гликозидной связи α или β. Таким образом, гликозидазы обладают ярко выраженной пространственной специфичностью. Сахараза относится к гликозидазами способна ускорять разрыв β-гликозидных связей в олиго-- сахарах, амилаза — к гликозидазами расщепляет α-гликозидные связи в полисахаридах. 66 Ход работы А Приготовление препарата сахаразы. 2 г прессованныхили высушенных на воздухе дрожжей растирают в течение 20 минут с 4 г кварцевого песка и 5 мл фосфатного буфера (0,1 М, pH 7,0), затем добавляют 20 мл буфера, нагретого до 60 С. Через 30 минут фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Фильтрат должен быть прозрачным, для чего первые порции мутного фильтрата снова выливают в воронку для фильтрования. Б В две пробирки наливают по мл раствора крахмала и прибавляют в первую пробирку 1 мл раствора слюны (амилаза, во вторую — 1 мл препарата сахаразы, перемешивают и ставят в термостат при температуре 38 СВ две другие пробирки наливают по 3 мл 0,5 % раствора сахарозы ив первую пробирку 1 мл препарата сахаразы, во вторую — 1 мл раствора слюны и помещают в термостат при 38 С. Через 5 минут впервые две пробирки с крахмалом добавляют по 5 капель раствора йода. В пробирке с амилазой наблюдают красно- бурое или желтое окрашивание, в другой пробирке — синее окрашивание. В пробирке с раствором сахарозы действие фермента обнаруживают с помощью реактива Фелинга. В пробирки прибавляют по 1 мл реактива Фелинга и нагревают до кипения. Сахароза не обладает восстановительными свойствами, и поэтому в пробирке с амилазой изменения окраски не наблюдается. В пробирке с сахаразой (β-гликозидазой) произошло расщепление сахарозы и наблюдается красное окрашивание. По результатам опыта делают вывод о специфичности амилазы и сахаразы. Специфичность действия уреазы Уреаза — фермент, относящийся к классу гидролаз, подклассу амидаз, те. ускоряет гидролиз амидных связей. Уреаза обладает абсолютной специфичностью и способна гидролитически расщеплять амидные связи только в мочевине, незначительные изменения в структуре субстрата (NH 2 —CS—NH 2 ) приводят к тому, что фермент не оказывает действия на этот субстрат. Ход работы В две пробирки наливают по мл препарата уреазы и по капель раствора фенолфталеина. В одну из них добавляют 1 мл 5 % раствора мочевины, а в другую — 1 мл 5 % раствора тиомочевины. Обе пробирки оставляют на 20 минут при комнатной температуре. Содержимое пробирки с мочевиной окрашивается в розовый цвет вследствие образования аммиака при расщеплении мочевины. Тиомочевина под действием уреазы не расщепляется, поэтому раствор во второй пробирке не окрашивается. По результатам опыта делают вывод о специфичности действия уреазы. Метод основан на определении количества пероксида водорода, оставшегося последействия на него каталазы, титрованием раствора перманганата калия в кислой среде. Реакция протекает по уравнению 67 2KMnO 4 + 5H 2 O 2 + О → О + K 2 SO 4 + 8H 2 O + 5O 2 1 млн. раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода. Реактивы и оборудование Свежий растительный материал (морковь или картофель, перманганат калия (0,1 н, пероксид водорода (0,1 н, серная кислота (10 %), карбонат кальция. Бюретки для титрования на 50 мл, пипетки на 5, 20, 25 мл, мерные цилиндры на 10 и 25 мл, колбы мерные на 100 мл, колбы конические на 200 мл, фарфоровые ступки с пестиком, кварцевый песок. Ход работы 1. Приготовление препарата каталазы. 2 г сырого картофеля (или моркови) растирают с кварцевым песком в ступке, постепенно добавляя 2–3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции на кончике шпателя добавляют карбонат кальция до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до 100 мл. Смесь оставляют на 30 минут, после чего фильтруют. 2. Ферментативный катализ. В две конические колбы помещают по 25 млн. раствора пероксида водорода, затем в первую добавляют 20 мл вытяжки фермента (опыт, во вторую — 20 мл инактивированного ферментативного раствора (контроль. Для чего вытяжку каталазы кипятят в течение 5 минут. Обе колбы оставляют на 30 минут при комнатной температуре. 3. Титрование. По истечении времени инкубации приливают в обе колбы по 5 мл 10 % раствора серной кислоты и титруют содержимое колб 0,1 н. раствором перманганата калия до образования устойчивого в течение 1 минуты розового окрашивания. Отмечают количество перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося пероксида водорода в опытной и контрольной пробах. 4. Расчет. По результатам эксперимента проводят расчет. По разности между контрольным (V, мл) и опытным (V, мл) титрованием находят количество перманганата калия, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода. Количество разложенного пероксида водорода (С) находят умножением полученной цифры на 1,7 мг (см. уравнение. Далее по количеству разложившегося пероксида водорода определяют активность, рассуждая следующим образом. В 1 г картофеля (или моркови) содержится количество каталазы, способное за 30 минут разложить С / 20×2 пероксида водорода, где С — количество разложившегося пероксида водорода мг 100 мл — объем приготовленной вытяжки фермента, 20 мл — объем вытяжки фермента, взятой для реакции, 2 г — количество биоматериала. Затем полученную цифру делят на 30 и находят количество разложившегося пероксида водорода за 1 минуту (мг / мин. Поскольку активность фермента определяют, как правило, в мкмоль, то полученную величину делят на 0,034 мг и получают активность каталазы в мкмоль / мин. 68 Вопросы и задания для самопроверки 1. Дайте определение ферментам. Каковы отличия ферментов от небиологи- ческих катализаторов 2. Что следует понимать под терминами апофермент, простетическая группа, кофермент, холофермент? Приведите примеры однокомпонентных и двухкомпонентных ферментов. 3. Дайте понятие об активном центре фермента. Какие вещества, атомы формируют активный центр двухкомпонентных ферментов Напишите структурные формулы некоторых из них. Радикалы каких аминокислот формируют активный центр однокомпонентных ферментов 4. Что следует понимать под механизмом действия ферментов Рассмотрите механизм действия ацетилхолинэстеразы, амилазы, химотрипсина, лактат- дегидрогеназы. 5. Перечислите факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции. 6. Дайте определения понятиям оптимум температуры, оптимум pH, активаторы, ингибиторы. 7. Что понимают под специфичностью действия ферментов Приведите примеры. По каким признакам можно судить о действии фермента 9. На чем основаны методы количественного определения активности ферментов. Что принимают за единицу активности фермента 11. На чем основаны принципы классификации ферментов На основании каких критериев делят классы ферментов на подклассы 12. Какие принципы положены в основу номенклатуры ферментов Каков смысл четырех чисел, составляющих классификационный номер (шифр) каждого фермента 13. Какие процессы катализируют в организме ферменты класса оксидоредук- таз Приведите примеры. Напишите уравнения реакций. 14. Как называются ферменты, катализирующие реакцию дегидрирования Какова химическая природа этих ферментов Назовите их коферменты и напишите их структурные формулы. 15. Какова классификация и биологическая роль цитохромов В какой последовательности располагаются цитохромы в митохондриальной цепи 16. Какие подклассы входят в состав класса трансферам Перечислите важнейшие коферменты трансфераз и напишите уравнения реакций, катализируемых этими ферментами. 17. Каков механизм реакции переаминирования с участием пиридоксальфос- фата в качестве кофермента 69 18. Какие ферменты относятся к классу а) гидролаз, б) лиаз, в) изомераз, г) синтетаз? На основании каких критериев делят на подклассы каждый из указанных выше классов ферментов Приведите примеры, напишите уравнения реакции. 19. Какова классификация протеолитических ферментов в соответствии с механизмом их каталитического действия и строением активного центра 20. Какова специфичность действия на пептидные связи пепсина, трипсина, химотрипсина? 21. Напишите уравнения реакций с использованием структурных формул всех компонентов. Определите класс, подкласс, назовите ферменты, катализирующие нижеприведенные превращения а) крахмал + вода → мальтоза б) гликоген + фосфорная кислота → глюкоза-1‑фосфат + гликоген (п) в) сахарозавода глюкоза + фруктоза г) мальтоза + вода → 2 глюкоза д) УДФ-глюкоза + фруктоза → сахароза + УДФ е) лизин → кадаверин + СО ж) пируват + НАД+Н + лактат + НАД+ з) L-глутамат + оксалоацетат L- аспартат + α-кетоглутарат и) глутаминовая кислота + NH 3 + АТФ → глутамин + АДФ + Н 3 РО 4 22. Напишите уравнения реакций, катализируемых ферментами а) алкоголь НАД оксидоредуктаза б) лактат НАД + оксидоредуктаза в) оксалоацетат: С–С-лиаза г) ацетилхолин ацетилгидролаза д) D-глюкоза-6‑фосфат: фосфогидролаза 23. При определении активности кислой фосфатазы измеряют количество пара нитрофенола, образующегося при гидролизе пара-нитрофенилфосфата: NO 2 —C 6 H 4 — ОРО 3 Н 2 + H 2 O → NO 2 —C 6 H 4 —OH + Н 3 РO 4 Рассчитайте активность кислой фосфатазы в исходном экстракте, если известно, что в результате образовалось 214 мкмоль п-нитрофенола, а инкубацию вели с 1 мл разведенного враз экстракта фермента в течение 30 минут при температуре 37 С. 24. Рассчитайте активность каталитических центров каталазы, лактатдегидро- геназы и алкогольдегидрогеназы (молекулярная активность их, соответственно, равна 5 • 10 6 , 3,7 • 10 4 , 2,7 • 10 4 ), если известно, что число их упер- вых двух ферментов равно четырем, ау последнего — двум. 25. Рассчитайте концентрацию меди (%) в медьсодержащем ферменте аскорба- токсидазе (М 150 000), если каждая молекула содержит 6 атомов меди. 70 ГЛАВА 3. ВИТАМИНЫ Витамины — жизненно важные органические соединения, необходимые для человека и животных в ничтожных количествах, но имеющие огромное значение для нормального роста, развития и самой жизни. Витамины обычно поступают с растительной пищей и продуктами животного происхождения, поскольку они не синтезируются в организме человека и животных. Таблица 11. Содержание витаминов в некоторых продуктах (в мг / 100 г продукта) Фолиевая Продукты СВ В В РР А Е D кислота мкг) Шиповник 200 0,15 0,84 – 1,5 – – – – Черная смородина 200 0,02 0,02 0,13 0,3 – – – 5,0 Апельсины 60 0,04 0,03 0,06 0,20 – – – 5,0 Облепиха 200 0,10 0,05 0,11 0,60 – 10,30 – 9,0 Капуста белокочанная 50 0,06 0,05 0,14 0,40 – – – 10,0 Лук зеленый 30 0,02 0,10 0,15 0,30 – – – 18,0 Свекла 10 0,02 0,04 0,07 0,20 – – – 13,0 Соя 0 0,94 0,32 0,85 2,20 – 17,3 – 20,0 Горох 0 0,81 0,15 0,27 2,2 – 9,1 – 16,0 Пшено – 0,02 0,04 0,52 1,15 – – – 40,0 Крупа гречневая – 0,53 0,20 0,40 4,19 – – – 32,0 Хлеб пшеничный – 0,21 0,2 0,3 2,81 – – – 32,0 Печень говяжья 33 0,3 2,19 0,70 0,8 3,38 1,28 – 240 Куры – 0,07 0,15 0,61 3,60 – – – 5,8 Творог жирный 0,5 0,05 0,3 0,11 0,3 – – – 35 Сыры твердые 1,5 0,05 0,5 – 0,2 – – – 10 –45 Яйца куриные 0,35 – – – – – – 4,7 – Масло сливочное 0,50 – – – – – – – – Масло подсолнечное – – – – – – 67,0 – – рафинированное Дрожжи прессованные – 0,60 0,68 0,58 11,4 – – – 550 Чай черный 10 0,07 1,0 8,0 – – – – – Кофе растворимый – – 1,0 – 24 – – – – Суточная потребность в витаминах зависит от типа вещества, также от возраста, пола, состояния организма (период беременности, кормления ребенка, физические нагрузки. При нормальном питании суточная потребность организма в витаминах удовлетворяется полностью. Недостаточное и неполноценное питание (несбалансированная диета у пожилых людей, недостаточное 71 питание у неимущих людей, потребление полуфабрикатов) или нарушение процессов усвоения и использования витаминов могут быть причиной различных форм витаминной недостаточности, вплоть до авитаминозов. Важная роль в обеспечении организма рядом витаминов КВН) принадлежит микрофлоре пищеварительного тракта. Поэтому дефицит витаминов может возникать вследствие медикаментозного лечения с использованием антибиотиков . Витаминная недостаточность излечивается посредством полноценного питания или с помощью витаминных препаратов. Явление ги- первитаминоза касается лишь витаминов Аи. Избыточное количество других витаминов быстро выводится из организма с мочой. Витамины были открыты в 1880 г. НИ. Луниным, который считал их необходимым дополнительным фактором питания. В 1912 г. К. Функ предложил называть эти дополнительные факторы питания витаминами, те. аминами жизни. В настоящее время известно, что далеко не все из них содержат аминогруппу и вообще азот, однако термин витамины остался и прочно удерживается до сих пор. Благодаря усилиям многих биохимиков и физиологов более чем за столетнюю историю витаминологии выделено около трех десятков витаминов, изучены их состав и строение, физиологическое действие ив подавляющем большинстве случаев осуществлен химический синтез соответствующих препаратов. Современная классификация витаминов не является совершенной она основана на физико-химических свойствах (в частности, растворимости. В зависимости от растворимости различают жирорастворимые и водорастворимые витамины . Помимо этих двух главных групп, различают группу разнообразных химических веществ, некоторые из них частично синтезируются в организме человека и обладают витаминными свойствами. Эти вещества принято объединять в группу витаминоподобных холин, липоевая кислота, пангамовая кислота, оротовая кислота, инозит, убихинон, пара-аминобензой- ная кислота, карнитин, витамин U, комплекс ненасыщенных жирных кислот витамин F). В номенклатуре ферментов используют три названия химическое — в соответствии с химическим строением молекулы, физиологическое — обозначающее основное биологическое свойство или указывающее на способность предотвращения соответствующего заболевания с приставкой «анти» и буквенное — обозначение буквами латинского алфавита, предложенное Мак-Коллумом. Большинство витаминов является предшественниками коферментов, а некоторые витамины выполняют сигнальные функции. 72 Таблица 12. Витамины, их суточная потребность для человека, активная форма и биохимическая функция Суточная Активная форма потребность Биохимическая функция или тип Витамин витамина или для человека катализируемой реакции кофермент мг) А, ретинол, анти 2,7 Цис-ретиналь Зрительный процесс, участие в росте ксерофтальмический и дифференцировке эпителиальной нервной, костной тканей D, кальциферол, 0,01–0,025 1,25‑ диоксихоле- Основной гормональный регулятор антирахитический кальциферол обмена кальция и фосфора в костях Е, токоферол, анти- 5,0 Активная форма Выполняет функции антиоксиданта стерильньй неизвестна перенос электронов) К, филлохинон 1,0 Активная форма Активирует факторы свертывания неизвестна крови II, VII, IX, X путем карбоксилирования остатков В, тиамин, анти- 1,2 ТПФ — тиаминпиро- Окислительное декарбоксилирование невритный фосфат кетокислот и перенос активного альдегида (транскетолаза) В, рибофлавин, 1,7 ФАД — флавина- Реакции переноса водорода, дыхание витамин роста дениндинуклеотид (дегидрогеназы) ФМН — флавин- мононуклеотид В, пантотеновая 3 –5 HS-KoA — кофер Реакции переноса ацильных групп кислота, антидерма- мент А (ациттрансферазы) титный В 5 (РР), никотинамид, 18 НАД – никотин Дыхание, реакции переноса водорода ниацин, антипеллар- амиддинуклеотид (дегидрогеназы) гический НАДФ – никотин- амиддинуклео тидфосфат В, пиридоксин, 2 ПФ – пиридоксаль- Трансаминирование и декарбоксили- пиридоскаль, пири- фосфат рование аминокислот доксамин, антидер- матитньй В, кобаламин, анти- 0,003 Дезоксиаденозил Метилирование гомоцистеина в ме- анемический или метил) коба- тионин, превращение метилмалонил- ламин КоА в сукцинил-КоА В с , фолиевая кислота 1 –2,2 Тетрагидрофолие- Реакции переноса одноуглеродных антианемический вая кислота остатков (синтез нуклеотидов) Н, биотин, антисебо- 0,25 Биоцитин (E-N – Реакции переноса СО, осуществ рейный карбоксибиотинил- ляемые коферментами карбоксилаз лизин) С, аскорбиновая 75 Активная форма Выполняет функции антиоксиданта кислота, антискор- неизвестна участвует в биосинтезе коллагена бутный катаболизме тирозина Р, биофлавоноиды, 50 Активная форма Стабилизирует основное вещество рутин, капилляро неизвестна соединительной ткани путем инги- укрепляющий бирования талуронидазы: совместно с Св окисл.‑ восст. процессах 73 Работа 16. Качественные реакции на витамины Для обнаружения витаминов в различных веществах или биологических жидкостях и определения их количества существуют качественные реакции, основанные на цветных реакциях, характерных для той или иной группировки, входящей в витамин. Реактивы и оборудование Витаминные препараты тиаминхлорид (кристаллический, тиамин (5 %), рибофлавин (0,025 %), никотиновая кислота (РР), пиридоксин (1 %), витамин Р (насыщенный раствор, аскорбиновая кислота (1 %), ретинол (0,05 % хлороформный раствор, 0,05 % хлороформный раствор витамина D, рыбий жир, 0,1 % спиртовой раствор токоферола, 0,1 % спиртовой раствор ви- касола; концентрированные кислоты азотная, соляная, серная, уксусная гидроксид калия (30 %), гексациано-III-феррат калия (10 %), нитрит натрия (5 %), металлический цинк, ацетат меди (5 %), гидрокарбонат натрия (10 %), гидросульфит натрия (свежеприготовленный 5 %), хлорид железа (III) (1 %), карбонат натрия (10 %), 0,01 % раствор йода в 0,2 % растворе йодида калия, трихлоруксусная сурьма (33 %), сульфат железа (II), насыщенный ледяной уксусной кислотой, раствор брома в хлороформе (1:60), изобутиловый спирт, соляная кислота (10 %), гидроксид натрия (10 %), тетраборат натрия (1 %), моча, сульфаниловая кислота (1 %), уксусная кислота (10 %), метиленовая синь (0,01 %), анилин, цистеин (0,025 %). Штативы с пробирками, пипетки на 1, 2 мл, термостат, флюорометр. Реакции на витамин B 1 Тиамин имеет бициклическую природу, состоит из пиримидинового и тиа- зольного кольца В животных тканях тиамин (В) присутствует главным образом в виде кофермента тиаминпирофосфата: Тиаминпирофосфат является коферментом декарбоксилаз кетокислот. Тиа-минпирофосфат катализирует также реакции переноса двухуглеродных фрагментов, будучи коферментом соответствующих ферментов. 74 Тиамин представляет собой мелкие бесцветные кристаллы горького вкуса, хорошо растворимые вводе. Растворы его в кислой среде устойчивы и выдерживают нагревание до высоких температур. В нейтральной и щелочной среде тиамин быстро разрушается. При авитаминозе тиамина развивается заболевание, получившее название полиневрит. Кроме человека, заболеванию подвержены птицы, кролики, собаки, крысы, морские свинки и многие другие животные. А. Реакция окисления В щелочной среде тиамин окисляется под действием гексациано-III- феррата калия в тиохром — пигмент желтого цвета, который в изобутиловом спирте дает интенсивно синюю флюоресценцию Ход работы К мг тиаминхлорида добавляют5–10капель раствора гексациано-III-феррата калия и 2 мл 30 % раствора гидроксида калия, содержимое пробирки тщательно перемешивают. При нагревании жидкость окрашивается в желтый цвет, вследствие превращения тиамина в тиохром. Затем в пробирку добавляют 1 мл изобутилового спирта и содержимое интенсивно взбалтывают в течение 1 минуты. Прогрев флюорометр в течение 10 минут, наблюдают синюю флюоресценцию при облучении раствора ультрафиолетовыми лучами. Б. Диазореакция В щелочной среде В с диазореактивом (смесь солянокислого или сернокислого раствора сульфаниловой кислоты с раствором нитрита натрия) образует сложное комплексное соединение оранжевого или красного цвета. Ход работы В пробирку наливают мл раствора сульфаниловой кислоты, 1 мл 5 % раствора нитрита натрия. Образуется диазореактив, к нему добавляют небольшое количество (на кончике скальпеля) порошка тиамина или 0,5 мл 5 % раствора его. И по стенке пробирки осторожно добавляют 1 мл раствора карбоната натрия. На границе двух жидкостей появляется кольцо оранжевого или красного цвета. 75 Реакция на витамин В Основу молекулы рибофлавина составляет изоаллоксазин, в котором сочетаются бензольный, пиразиновый, пиримидиновый циклы, в положении 9 имеется остаток пятиатомного спирта — рибита: Рибофлавин входит в состав двух родственных коферментов флавинмоно- нуклеотида (ФМН): и флавинаденинуклеотида (ФАД): Эти коферменты функционируют в простетических группах ферментов дегидрогеназ. В катализируемых этими ферментами реакциях изоаллоксазино-вое кольцо флавиновых нуклеотидов служит промежуточным переносчиком атомов водорода, отщепляющихся входе реакции от молекулы субстрата. Рибофлавин химически неустойчив, легко разрушается при кипячении и на свету. Под действием света он распадается на рибит и 6,7‑диметилаллок- сазин или люмихром. Рибофлавин легко окисляется и восстанавливается, наибольшей способностью присоединять атомы водорода обладают атомы азота, находящиеся в мим положениях молекулы изоаллоксазина. 76 При авитаминозе рибофлавина приостанавливается рост, наблюдается выпадение волос, поражаются слизистые оболочки, утомляется зрение, нарушается нормальный синтез гемоглобина. Образующийся при добавлении металлического цинка к концентрированной соляной кислоте водород восстанавливает желтый рибофлавин сначала в родофлавин красного цвета, затем в бесцветный лейкофлавин: Ход работы В пробирку приливают мл раствора рибофлавина мл концентрированной соляной кислоты и опускают кусочек металлического цинка. Выделяющийся водород реагирует с рибофлавином, восстанавливая его, и жидкость постепенно окрашивается в розовый цвета затем обесцвечивается. При взбалтывании обесцвеченного раствора лейкофлавин вновь окисляется кислородом воздуха в рибофлавин. Реакции на витамин РР Никотиновая кислота представляет собой соединение пиридинового ряда, содержащее карбоксильную группу, никотинамид отличается наличием амидной труппы Никотиновая кислота и ее амид входят в состав коферментов никотина- мидадениндинуклеотида (НАД) и никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ) и катализируют окислительно-восстановительные реакции клеточного обмена 77 Никотиновая кислота — белое кристаллическое вещество, слабокислого вкуса, хорошо растворимое вводе, устойчиво, не разрушается при действии обычных химических и физических агентов. Никотиновая кислота является провитамином, а собственно антипелларгическим действием обладает амид никотиновой кислоты. Никотинамид — кристаллическое бесцветное вещество, с температурой плавления 131–132 С. Недостаточное содержание в пище никотинамида вызывает у людей заболевание, названное пеллагрой. Никотиновая кислота и ее амид широко распространены в животном и растительном мире. А. Реакция с ацетатом меди При нагревании витамина РР с раствором ацетата меди образуется плохо растворимый осадок медной соли витамина РР: Ход работы В пробирку помещают мг витамина РР и растворяют при нагревании в 1–2 мл 10 % раствора уксусной кислоты. К нагретому доки- пения раствору приливают равный объем 5 % раствора ацетата меди. Жидкость становится мутной, окрашивается в голубой цвета при стоянии выпадает синий осадок медной соли никотиновой кислоты. Б. Реакция с гидросульфитом натрия Витамин РР восстанавливается гидросульфитом натрия с образованием соединения желтого цвета. Ход работы В пробирку помещают мг витамина РР,добавляют 1,5 мл % раствора гидрокарбоната натрия, перемешивают и прибавляют 1,5 мл 5 % свежеприготовленного раствора гидросульфита натрия. Жидкость окрашивается в желтый цвет. 78 Реакции на витамин В Группа витамина В включает три родственных соединения (пиридоксин пиридоксол, пиридоксаль, пиридоксамин, которые в биологических системах легко превращаются друг в друга. Термином витамин В обозначают все три производных 3‑оксипиридина, которые отличаются друг от друга природой замещающей группы в положении 4 пиридинового ядра. Активной формой витамина В является пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат. Пиридоксальфосфат представляет собой прочно связанную простетическую группу ферментов, катализирующих реакции с участием аминокислот. К наиболее распространенными хорошо изученным реакциям относятся реакции переаминирования, в которых аминогруппа аминокислоты обратимо переносится на углеродный атом кетокислоты. В результате реакций переаминирования, катализируемых аминотрансферазами, прочно связанный с апоферментом пиридоксальфосфат служит промежуточным переносчиком аминогруппы от ее донора аминокислоты к акцептору кетокислоте. Из трех названных выше веществ, образующих пиридоксиновый комплекс, наиболее изучен пиридоксол, который представляет собой бесцветные кристаллы с температурой плавления 160 С, горькие на вкус, хорошо растворимые вводе и спирте. Растворы пиридоксола устойчивы к нагреванию скис- лотами и щелочами, но быстро теряют активность под действием света. Отсутствие в пище витамина В сопровождается резким нарушением обмена белков, липидов, развивается атеросклероз, различного рода дерматиты, нарушается кроветворение. 79 А. Реакция с хлоридом железа (III) При взаимодействии витамина В с раствором хлорида железа (III) жидкость окрашивается в красный цвет вследствие образования соли типа фенолята железа. Ход работы В пробирке смешивают мл водного раствора пиридоксина и 2 капли 1 % раствора хлорида железа (III). Смесь встряхивают. Наблюдают окрашивание жидкости в красный цвет. Б. Обнаружение пиридоксиловой кислоты в моче Витамин В выделяется из организма в виде пиридоксиловой кислоты. Раствор лактона пиридоксиловой кислоты имеет синюю флюоресценцию в ультрафиолетовых лучах. Ход работы В пробирку наливают мл мочи и мл раствора соляной кислоты, помещают на 20 минут в кипящую водяную баню для образования лактона пиридоксиловой кислоты. Пробирку охлаждают, прибавляют 3 капли 10 % раствора гидроксида натрия (pH 9,0) и 1 % раствор тетрабората натрия до половины объема пробирки, перемешивают. Наблюдают появление синей флюоресценции в ультрафиолетовых лучах. Реакции на витамин Р Витамин Р представляет собой семейство веществ, близких по химической структуре катехины, халконы, дигидрохалконы, флавины, флавононы, изофлавоны и др. Все они обладают Р-витаминной активностью ив основе их структуры лежит дифенилпропановый углеводородный скелет флавона. В настоящее время известно свыше десятка соединений, обладающих Р- витаминным действием. Их называют биофлавоноидами. Они отличаются различной степенью гидроксилирования бензольных колец, а также различными гликозидными группировками, присоединяющимися по 3‑му углеродному атому пиранового кольца, так, например, рутин содержит в своем составе остаток дисахарида — рутинозы: 80 Препараты витамина Р — желтые кристаллические вещества, труднорастворимые вводе. При отсутствии витамина Р в пище человека и животных повышается проницаемость капилляров, что сопровождается внезапными кровоизлияниями после сдавления тканей, болью в конечностях. Предполагают, что витамины группы Р участвуют в окислительно- восстановительных реакциях. Действие витаминов Р и С взаимосвязано каждый из них в присутствии другого обладает гораздо более высоким терапевтическим эффектом, чем в одиночку. А. Реакция с хлоридом железа (III) Хлорид железа (III) с рутином образует комплексное соединение, окрашенное в изумрудно-зеленый цвет. Ход работы К мл насыщенного водного раствора рутина прибавляют несколько капель 1 % раствора хлорида железа (III). Наблюдают появление зеленого окрашивания. Б. Реакция сконцентрированной серной кислотой Концентрированная серная кислота образует с флавонолами флавиевые соли, растворы которых имеют ярко-желтую окраску. Ход работы К мл насыщенного водного раствора рутина осторожно по стенке пробирки приливают 1 мл концентрированной серной кислоты. На границе двух жидкостей возникает окрашенное в желтый цвет кольцо. Реакции на витамин С Витамин С (аскорбиновая кислота) представляет собой лактон 2,3‑ де-гидрогулоновой кислоты 81 Обе гидроксильные группы имеют кислотный характер, в связи с чем при потере протона соединение может существовать в форме аскорбат-иона. Аскорбиновая кислота содержит два асимметричных атома углерода в мим положениях, что дает возможность образования четырех оптических изомеров. Витаминной активностью обладают изомеры, относящиеся кряду. Витамин С — бесцветное кристаллическое вещество ст. пл. 192 С, хорошо растворимое вводе и спирте. В бескислородной среде устойчиво, может храниться годами. В присутствии кислорода и щелочей витамин С быстро разрушается. Аскорбиновая кислота широко распространена в природе, присутствует во всех тканях и органах животных и растений. Витамин С является участником окислительно -восстановительных систем и обеспечивает нормальное протекание жизненно важных процессов в тканях. При авитаминозе витамина Су человека развивается цинга, сопровождающаяся кровоизлияниями, разрушением зубов. В основе этих явлений лежат нарушения в синтезе коллагена. Аскорбиновая кислота играет роль кофактора в реакции гидроксилирования пролина, в результате которой образуется ги- дроксипролин — основной компонент коллагена. А. Реакция с гексациано-III-ферратом калия Аскорбиновая кислота легко вступает в окислительно-восстановитель- ные реакции с гексациано-III-ферратом калия, который восстанавливается до гексациано-II-феррата калия, образующий с хлорным железом плохо растворимую вводе соль трехвалентного железа — берлинскую лазурь темно- синего цвета 3K 4 [Fe(CN) 6 ] + 4FeCl 3 → Fe 4 [Fe(CN) 6 ] 3 + 12KCl Ход работы К мл раствора аскорбиновой кислоты прибавляют мл % раствора гексациано-III-феррата калия и 0,5 мл 1 % раствора хлорида железа. Наблюдают образование сине-зеленого окрашивания. 82 Б. Реакция с метиленовой синью Метиленовая синь в присутствии аскорбиновой кислоты легко переходит в бесцветную лейкоформу: Ход работы В две пробирки вносят по одной капле раствора метиленовой сини и 10 % раствора карбоната натрия. В первую пробирку вносят 5 капель 0,1 % раствора аскорбиновой кислоты, во вторую — 5 капель воды и ставят обе пробирки в термостат при 37 С. Через некоторое время в пробирке с аскорбиновой кислотой жидкость обесцвечивается. В. Реакция с йодом Раствор йода в йодиде калия при добавлении к нему раствора витамина С обесцвечивается за счет восстановления аскорбиновой кислоты йодом Ход работы В две пробирки наливают по10капель дистиллированной воды и по 1–2 капле 0,01 % раствора йода в 0,2 % растворе йодида калия. В одну пробирку добавляют 10 капель аскорбиновой кислоты, в другую — столько же воды. В пробирке с аскорбиновой кислотой раствор йода обесцвечивается. 83 Реакции на витамин А Витамин А имеет несколько витамеров, из которых наиболее распространен витамин А, содержащий ионное кольцо и боковую цепь, состоящую из двух остатков изопрена и первичной спиртовой группы, в результате чего он получил название ретинола, или аскерофтола: Ретинол — кристаллическое вещество лимонно-желтого цвета, хорошо растворим в жирах, бензине, эфире. Витамины группы А легко окисляются в присутствии кислорода. Окисляясь в организме при участии биокатализаторов, ретинол превращается в ретиналь, обладающий А-витаминной активностью. Провитамином А является желтый пигмент растений — каротин. В организме каротин под влиянием каротиназы превращается в витамин А. Витамин А входит в состав зрительного пурпура — родопсина, находящегося в палочках сетчатки. Под действием кванта света происходит распад родопсина на 11‑цис-ретиналь и опсин. Для участия в акте зрения организм постоянно нуждается в цис-ретинале. Основная функция витамина А в организме человека — участие в акте зрения. При отсутствии в пище витамина А в организме человека и животных развивается ряд специфических патологических изменений ослабление зрения, поражение роговой оболочки, эпителиальных тканей, торможение роста, общее истощение организма. А. Реакция с трихлоруксусной сурьмой Хлороформный раствор витамина А (или рыбьего жира) в присутствии трихлоруксусной сурьмы окрашивается в специфический синий цвет. Аналогичное синее окрашивание дают все соединения с сопряженными двойными связями. Ход работы Всухую пробирку помещают1–2капли0,05 хлороформного раствора ретинола, затем — 4–5 капель 33 % раствора трихлоруксусной сурьмы в хлороформе и перемешивают. Появляется синяя окраска. Б. Реакция сконцентрированной серной кислотой Витамин А в бензольном растворе сконцентрированной серной кислотой образует комплекс, окрашенный в синий цвет. 84 Ход работы В пробирку с1–2каплями раствора витамина А прибавляют капли концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирки окрашивается в синий цвет, который через некоторое время переходит в фиолетовый цвета затем в бурый. В. Реакция с сульфатом железа (II) Витамин Ас сульфатом железа (II) в кислой среде образует соединение, имеющее розово-красную окраску. Каротины дают при этой реакции зеленоватое окрашивание. Ход работы В пробирку с2–3каплями раствора рыбьего жира в хлороформе (или масляного раствора витамина А) прибавляют 5–10 капель ледяной уксусной кислоты, насыщенной сульфатом железа (II) и 1–2 капли концентрированной серной кислоты. Появляется голубое окрашивание, постепенно переходящее в розово-красное. Реакции на витамин D Витамин D относится к стероидами является производным циклопентан- пергидрофенантрена. Как и витамин А, витамин D существует в виде нескольких витамеров. Наиболее распространены витамины D 2 (эрго кальциферол) и D 3 (холекальциферол. Провитамином D 3 является 7‑дегидрохолестерол, который под действием солнечной радиации переходит в витамин Витамины D 2 и D 3 — бесцветные кристаллы ст. пл. 115–116 С, нерастворимые вводе и хорошо растворимые в жирах, хлороформе, бензоле. Витамины D неустойчивы, легко разрушаются под действием окислителей и минеральных кислот. При отсутствии в пище витамина D у детей развивается рахит. Причина его состоит в расстройстве фосфорно-кальциевого обмена и нарушении отложения фосфата кальция в костной ткани. Недостаток витамина D у взрослых проявляется в виде остеомаляции и остеопороза, возникающих вследствие вымывания из костей солей кальция и фосфора. 85 А. Реакция с анилином Витамин D с анилином в присутствии соляной кислоты образует соединения, окрашенные в красный цвет. Ход работы Всухую пробирку помещают1–2капли рыбьего жира(или раствор витамина D в хлороформе) и добавляют 1 каплю анилинового реактива (анилин сконцентрированной соляной кислотой в соотношении 5:1). После перемешивания образуется эмульсия желтого цвета, содержимое пробирки осторожно нагревают при постоянном помешивании и кипятят 0,5 минуты. Наблюдают красное окрашивание. Через 1–2 минуты эмульсия разделяется на два слоя, из которых нижний окрашен в интенсивный красный цвет. Б. Реакция с бромом Витамин D с раствором брома в хлороформе окрашивается в зелено-голу- бой цвет. Ход работы Всухую пробирку помещают2–4капли рыбьего жира,затем добавляют 4–5 капель раствора брома в хлороформе (1:60). Смесь в пробирке постепенно окрашивается в зелено-голубой цвет. Реакции на витамин Е Витамин Е существует в виде нескольких изомеров α-, β-, γ-токоферолов. Изомеры отличаются друг от друга в основном порядком расположения метильных групп в бензольном кольце Изогексадекан Бензопиран Токоферол отличается от токоферола тем, что лишен метильной группы в положении 7, а токоферол — в положении 5. Токоферолы — бесцветные маслянистые жидкости, хорошо растворимые в растительных маслах, спирте, эфире. Химически устойчивы, выдерживают нагревание до 170 С, разрушаются под действием УВЧ. Е-авитаминоз выражается в нарушении структуры и нормального функционирования многих тканей развивается мышечная дистрофия, дегенерация спинного мозга, паралич конечностей, дегенеративные изменения репродуктивных органов. 86 Витамин Е тормозит свободнорадикальное автоокисление ненасыщенных липидов клеточных и субклеточных мембран, контролирует обмен и функции убихинона, участвует в регуляции биосинтеза некоторых ферментов на уровне транскрипции. А. Реакция с хлоридом железа (III) При взаимодействии с трихлорным железом токоферол окисляется до α- токоферилхинона, имеющего красный цвет. Ход работы Всухую пробирку помещают мл спиртового раствора- токоферола, затем 0,5 мл 1 % раствора хлорида железа (III) и тщательно перемешивают содержимое пробирки. Наблюдают появление красного окрашивания. Б. Реакция с азотной кислотой Токоферол в присутствии азотной кислоты окисляется до α-токоферил хинона, окрашенного в красный или желтовато-красный цвет. Ход работы Всухую пробирку вносят5капель0,1 спиртового раствора токоферола, затем 1 мл концентрированной азотной кислоты. Пробирку интенсивно встряхивают и тщательно перемешивают содержимое пробирки. Наблюдают появление красного окрашивания. Реакции на витамин К Витамины группы К являются производными нафтохинона, отличающиеся строением боковой цепи, содержащей от 30 до 45 углеродных атомов и несущих, соответственно, от 6 до 9 двойных связей. Наиболее распространены витамины К, К, К. Широкое практическое применение имеет синтетический препарат викасол — производное витамина К 3 Викасол К Витамин К — желтоватая маслянистая жидкость ст. пл. 115–145 С. Нерастворим вводе, растворим в жирах, бензине, спирте. Неустойчив при нагревании в щелочной среде. Витамин К — желтые кристаллы ст. пл. 54 С — еще более неустойчив, чем витамин К. Витамин К — желтый кристаллический порошок ст. пл. 106 С, растворим в спирте, эфире. Викасол — бесцветный мелкий кристаллический порошок, растворим вводе К-витамины входят в состав простетической группы ферментов, участвующих в синтезе протромбина, который является необходимым компонентом в процессе свертывания крови. Витамин К содержится в митохондриях и регулирует процесс фосфорилирования. При недостатке витамина Кв пище могут возникать самопроизвольные кровотечения носовые, внутренние, кровавая рвота. А. Реакция с анилином Витамин К взаимодействует с анилином, при этом образуется 1‑метил- 2‑ фениламинонафтохинон, окрашенный в красный цвет. Ход работы В пробирку к мл раствора витамина Кили викасола) добавляют 2 капли анилина и тщательно перемешивают, содержимое пробирки окрашивается в красный цвет. Б. Реакция с цистеином Витамин Кв присутствии цистеина в щелочной среде окрашивается в ли монно-желтый цвет. Ход работы В пробирку наливают мл спиртового раствора викасо ла, затем добавляют 5 капель 0,025 % раствора цистеина и 2 капли 10 % раствора гидроксида натрия. Появляется желтое окрашивание. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ Современные методы количественного определения витаминов в биологических объектах делят на физико-химические и биологические. При взаимодействии витаминов с рядом химических соединений наблюдаются характерные цветные реакции, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации витаминов в исследуемом растворе. Поэтому витамины можно определять фотоколориметрически. Эти методы позволяют судить как о наличии витамина, таки о количественном содержании их в исследуемом пищевом продукте или органах и тканях человека и животных. Для выяснения обеспеченности организма человека каким‑либо витамином часто определяют соответствующий витамин в сыворотке крови, моче. Однако фотоколориметри- ческие методы могут быть применимы не во всех случаях. Например, витамин А имеет специфическую полосу поглощения при 328–330 нм. Для определения витаминов A, B 1 , В и других применяют флюорометрические методы. Широко используют и титрометрические методы. Например, витамин С определяют, титруя его раствор в кислой среде 2,6‑дихлорфенолиндофенолом. Биологические методы основаны на определении того минимального количества витамина, которое при добавлении к искусственной диете, лишенной только данного изучаемого витамина, предохраняет животное от развития авитаминоза или излечивает его от уже развившейся болезни. Количество витаминов принято выражать в миллиграммах, микрограммах. 88 Работа 17. Определение витамина Св растительном материале Метод основан на способности витамина С восстанавливать 2,6‑дихлор- фенолиндофенол, который в кислой среде имеет красную окраску, а при восстановлении обесцвечивается, в щелочной среде окраска синяя. Для предохранения витамина Сот разрушения исследуемый раствор титруют в кислой среде щелочным раствором 2,6‑дихлорфенолиндофенолом до появления розового окрашивания. Для расчета содержания аскорбиновой кислоты в миллиграммах наг растительного продукта используют формулу X = 0,088•А•Г•100 / Б•В, где X — содержание витамина Св миллиграммах наг продукта, 0,088 — содержание аскорбиновой кислоты (мг, А — результат титрования 0,001 н. раствором натриевой соли 2,6‑дихлорфенолиндофенолом (мл, Б — объем экстракта, взятый для титрования (мл, В — количество продукта, взятого для анализа г, Г — общее количество экстракта (мл, 100 — пересчет наг продукта. Реактивы и оборудование Растительный материал ягоды шиповника хвоя капуста морковь картофель соляная кислота (10 %), 0,001 н раствор натриевой соли 2,6‑ дихлор - фенолиндофенола Весы разновесы фарфоровые ступки с пестиками мерные цилиндры на 25 мл мерные колбы на 25 мл конические колбы воронки стеклянные пипетки на 1, 2, 5 мл микробюретки на 4, 5 мл кварцевый песок , бумажные фильтры |