Ганеева Л. А., Зайнуллин ли, Абрамова З. И
 Скачать 5.05 Mb.
|
|
ПЧ = V 2 – V 1 , где V 2 — объем 0,005 М раствора тиосульфата натрия, израсходованный на титрование йода мл, V 1 — т же, израсходованное в контроле. Ж. Определение йодного числа Природные жиры и масла представляют собой смеси смешанных триацил- глицеринов. Мерой их ненасыщенности служит йодное число. Йодное число соответствует количеству граммов йода, которое может присоединиться кг жира. Состав природных жиров и масел и их йодные числа варьируют в достаточно широких пределах например, йодное число сливочного масла — 28–42, оливкового масла — 77–95, трескового жира — 154–170. Йодное число является важным показателем для жиров, оно позволяет судить о степени ненасыщенности масла, о склонности его к высыханию, прогорканию и другим изменениям, происходящим при хранении и переработке пищевых масел. С двойными связями жирных кислот, кроме йода, реагируют и другие галогены (хлор, бром. Однако они не только присоединяются по двойным связям, но и замещают атомы водорода в радикале. Йод же в определенных условиях реагирует преимущественно по двойным связям. Определение йодного числа основывается на реакции присоединения йода по двойным связям Ход работы Берут две конические колбы емкостью мл:в одну колбу помещают навеску масла 0,1–0,2 г, во вторую — 0,1–0,2 мл воды (контроль. В обе колбы приливают по 10 мл 0,1 М спиртового раствора йода, тщательно перемешивают до полного растворения масла. Если масло плохо растворяется, можно подогреть колбу на водяной бане. Через 15 минут содержимое колб оттитровывают 0,1 н. раствором тиосульфата натрия, сначала до появления слабо-желтого окрашивания, а потом, прибавив 1 мл 1 % раствора крахмала, титруют до исчезновения синего окрашивания. Разность между количеством 0,1 н. раствора тиосульфата натрия, затраченного на титрование контроля и опыта, является показателем количества йода, связанного навеской масла. Йодное число вычисляют по формуле ЙЧ = (V 1 –V 2 ) • 0,01269 • К • 100 / m, где V 1 — объем 0,1 н. раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование контрольной пробы (мл, V 2 — тоже самое, израсходованное на титрование опытной пробы (мл 0,01269 — количество граммов йода, эквивалентное 1 млн. раствора тиосульфата натрия К — коэффициент поправки на титр 0,1 н. раствора тиосульфата натрия коэффициент пересчета наг жира m — навеска жира (г. Работа 29. Количественное определение свободных жирных кислот в сыворотке крови Медные соли жирных кислот способны образовывать с диэтилдитиокарба- матом натрия окрашенные комплексные соединения, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации свободных жирных кислот. В крови человека содержится свободных жирных кислот 640–880 мкмоль / л. Концентрация свободных жирных кислот в сыворотке крови увеличивается при сахарном диабете, после введения адреналина, при голодании, поскольку идет мобилизация жира из жирового депо и свободные жирные кислоты транспортируются в комплексе с альбуминами. Реактивы и оборудование Стандартный раствор пальмитиновой кислоты 25,6 мг растворяют в хлороформе и доводят объем до 100 мл, в 1 мл раствора содержится 0,256 мг C 15 H 31 COOH; хлороформ сыворотка крови натрий диэтилдитиокарбамат (0,1 % раствор в перегнанном н-бутаноле); медный реактив готовят из 10 объемов 6,45 % раствора СО • НО, 9 объемов 1 М раствора триэтаноламина и 1 объема 1 н. раствора уксусной кислоты. Центрифуга, ФЭК, пробирки с притертыми пробками, пробирки центрифужные, пипетки на 1, 5, 10 мл, стеклянные палочки, шприцы. Ход работы Берут две пробирки с притертыми пробками:в одну из них вносят 0,5 мл сыворотки крови, в другую — 1 мл стандартного раствора пальмитиновой кислоты в хлороформе. В опытную пробу приливают 5 мл, а в стандарт — 4,5 мл хлороформа и добавляют по 2,5 мл медного реактива. Контрольную пробу готовят параллельно к 5 мл хлороформа добавляют 2,5 мл медного реактива. Пробирки закрывают пробками и встряхивают в течение 3 минут. Содержимое переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3 000 об. / мин. в течение 15 минут. Смесь в пробирках разделяется натри слоя хлороформ, белок, вода. Верхнюю (водную) фазу, содержащую избыток медного реактива, удаляют шприцом, белковую пленку сдвигают стеклянной палочкой на стенки пробирок, хлороформный слой с экстрагированными в нем жирными кислотами переносят в сухие пронумерованные пробирки, куда добавляют по 0,5 мл 0,1 % раствора диэтилдитиокарбамата натрия в бутаноле и перемешивают. Опытную и стандартную пробы фотоколориметрируют на ФЭКе с синим светофильтром в кюветах толщиной 5 мм против контрольной пробы. 140 Содержание свободных жирных кислот рассчитывают по формуле D 1 • 1 000 / D 2 • V (мкмоль / л, где D 1 — оптическая плотность опытной пробы, D 2 — оптическая плотность стандарта, 1 000 — коэффициент пересчета, V — объем сыворотки крови (мл. Вопросы и задания для самопроверки 1. Какие соединения относятся к липидам Что положено в основу классификации липидов 2. В чем отличие простых липидов от сложных Какова их классификация 3. Какие соединения называются жирами Чем отличаются растительные жиры от животных Напишите структурные формулы трипальмитина и триолеина. 4. Дайте краткую характеристику высшим жирным кислотам (предельными непредельным, которые чаще всего входят в состав жиров. 5. Дайте характеристику основным физико-химическим свойствам жиров. 6. Какова сущность процесса эмульгирования жиров, его физиологическое значение 7. В чем заключается процесс омыления Какие вещества называются мыла ми Напишите уравнения реакций гидролиза тристеарина в присутствии гидроксида калия и качественных реакций на продукты гидролиза. 8. Что такое йодное число и для чего его применяют Напишите уравнение реакции присоединения йода к линолевой кислоте. 9. Напишите структурные формулы следующих соединений а) моностеарин, б) пальмитодиолеин, в) олеопальмитостеарин, г) геометрические изомеры олеиновой кислоты. 10. Осуществите нижеперечисленные превращения с использованием структурных формул всех компонентов с указанием ферментов и продуктов реакции а) тристеарин липаза ? б) глицерин → α-фосфатглицерин → диоксифосфатацетон → фосфатгли- цераль; в) пальмитиновая кислота → пальмитил-КоА → дипальмитилфосфатид- ная кислота → дипальмитин → трипальмитин. 11. Приведите схему превращений стеариновой кислоты по окислению, В чем отличие окисления от окисления высших жирных кислот 12. Посредством каких реакций осуществляется регенерация HS-KoA из аце- тил-КоА? 13. В чем заключается специфическая роль СО в биосинтезе жирных кислот Ответ обоснуйте, приведите уравнение реакции. 141 14. Напишите суммарное уравнение биосинтеза пальмитиновой кислоты, начиная с митохондриального ацетил-КоА, цитозольного НАДФ • Н, АТФ и СО 15. Определите энергетическую эффективность (выраженную в АТФ) полного распада трипальмитина до СО и НО. СЛОЖНЫЕ ЛИПИДЫ Фосфолипиды являются производными фосфатидной кислоты в их состав входят глицерин, жирные кислоты, фосфорная кислота и азотсодержащие соединения. R 1 и R 2 — радикалы высших жирных кислот R 3 — радикалы азотистого соединения Наиболее широко распространены фосфатидилхолины (лецитины) и фос- фатидилэтаноламины (кефалины). Эти две группы фосфатидилглицеринов метаболически связаны друг с другом и являются главными компонентами клеточных мембран. Фосфатидилсерины распространены гораздо менее широко, чем лецитины и кефалины, их значение определяется в основном тем, что они участвуют в синтезе фосфатидилэтаноламинов. 142 В природных фосфолипидах в положении С глицериновой цепи находится остаток насыщенной кислоты, в положении С — ненасыщенной. В нейтральной среде остаток фосфорной кислоты во всех фосфатидах заряжен отрицательно, кроме того, остатки азотистых оснований могут нести один или несколько электрических зарядов. Таким образом, фосфоглицериды содержат группировки двух разных типов, а именно полярные (гидрофильные) и неполярные (гидрофобные. Вследствие этого фосфолипиды обладают ам- фипатическими (двусторонними) свойствами, что очень важно для мембранных липидов. Фосфолипиды — твердые вещества жироподобного вида, бесцветны, но быстро темнеют на воздухе вследствие окисления по двойным связям ненасыщенных кислот. Хорошо растворяются в бензоле, эфире, хлороформе, не растворяются вводе, однако могут образовывать стойкие эмульсии. Растворимость в спирте, ацетоне у разных групп фосфолипидов различна. При нагревании с кислотами и щелочами фосфолипиды гидролизуются, распадаясь на основные структурные компоненты глицерин, жирные кислоты, фосфорную кислоту и азотсодержащие соединения. В организме человека вводимые с пищей фосфолипиды подвергаются в кишечнике воздействию специфических фосфолипаз, катализирующих гидролитический разрыв эфирных связей между компонентами, входящими в состав фосфолипидов Накопление образовавшихся под действием фосфолипазы А лизофосфо- липидов может быть устранено, если одновременно на фосфолипиды действуют Аи А 2 -фосфолипазы. 143 Показано, что существует фосфолипаза D, которая способна гидролизовать одновременно эфирные связи в положении 1 и 2 глицериновой цепи. Последовательность реакций расщепления фосфолипидов на отдельные компоненты еще не выяснена. Работа 30. Выделение лецитина из яичного желтка и изучение его растворимости Название свое лецитины получили потому, что были выделены из желтка куриного яйца (lecitos — желток. В их состав входят глицерин, жирные кислоты, фосфорная кислота, аминоспирт — холин. Холинфосфолипиды — составные компоненты клеточных мембран, особенно много их содержится в мозгу, сердце, эритроцитах, надпочечниках млекопитающих. Лецитины животного и растительного происхождения отличаются главным образом природой входящих в них жирных кислот и положением остатка фосфорной кислоты. Различают α- и лецитины, когда остаток фосфорной кислоты расположен у С или С глицерина (α) или С глицерина (β). Природные холинфосфатиды в основном являются лецитинами, которые хорошо растворяются в спирте и не растворяются в ацетоне. Реактивы и оборудование Желток вареного яйца, диэтиловый эфир, этиловый спирт, ацетон. Ступки с пестиком, воронки, фильтры, фарфоровые чашки, пробирки, пипетки на 2 и 10 мл, мерные цилиндры водяная баня, плоскодонные конические колбы. Ход работы Работа проводится в вытяжном шкафу,все горелки и электронагревательные приборы должны быть выключены А. Желток вареного яйца тщательно растирают в ступке с мл эфира. Затемэфир сливают на воронку со складчатым фильтром. Остаток в ступке дважды промывают порциями эфира по 5 мл, сливая их на фильтр. Фильтрат переливают из колбы в фарфоровую чашу и на водяной бане выпаривают досуха. Огонь под водяной баней должен быть погашен) В сухом остатке содержится смесь жиров и фосфолипидов, для удаления жиров сухой остаток дважды обрабатывают кипящим этиловым спиртом порциями по 8 мл. Спиртовые вытяжки после охлаждения отфильтровывают через сухой фильтр, фильтрат должен быть прозрачным, 2 мл фильтрата переносят в пробирку, а из остального спирт осторожно выпаривают на водяной бане. Остаток представляет собой сырой (неочищенный) лецитин. Лецитин растворяют в 10 мл эфира и к полученному раствору при помешивании приливают 30 мл абсолютного ацетона. Лецитин выпадает в осадок. Жидкость из стакана осторожно сливают, остаток лецитина переносят на фильтровальную бумагу. Б Наливают в пробирку мл спиртового раствора лецитина и добавляют по каплям воду, сильно взбалтывают. Наблюдают образование устойчивой эмульсии лецитина. 144 В Всухую пробирку приливают 0,5 мл спиртового раствора лецитина и 0,5 мл ацетона, тщательно перемешивают. Наблюдают помутнение раствора и выпадение в осадок лецитина. Г К 1 мл спиртового раствора лецитина добавляют 0,5 мл насыщенного спиртового раствора хлорида кадмия. Выпадает белый хлопьевидный осадок комплексного соединения лецитина с хлоридом кадмия. Растворы холестерола и растительных масел не осаждаются спиртовыми растворами хлорида кадмия. На основании опыта делают вывод о растворимости лецитина. Работа 31. Гидролиз лецитина и определение продуктов его гидролиза Реактивы и оборудование Лецитин (полученный в работе 30); гидроксид натрия (10 % спиртовой раствор красная и синяя лакмусовые бумаги соляная кислота (10 %); фенолфталеин гидросульфат калия нитрат натрия карбонат калия азотная кислота (конц молибденовый реактив смешивают 15 % раствор молибдата аммония сконцентрированной азотной кислотой в отношении 110 : 90. Пробирки, воронки, конические колбы, фильтровальная бумага, фарфоровые тигли, шпатели, водяные бани. Ход работы Всухую пробирку помещают небольшое количество лецитина, полученного в работе № 30, добавляют 2–3 мл 10 % раствора гидроксида натрия и кипятят на водяной бане в течение 5 минут. 145 А Открытие холина.При кипячении ощущается запах селедочного рассола, характерный для триметиламина, который образуется из холина Триметиламин можно обнаружить по посинению влажной красной лакмусовой бумаги, которую держат у отверстия пробирки. Б Открытие жирных кислот.После окончания гидролиза пробирку вынимают из бани, охлаждают. Гидролизат подкисляют 10 % раствором соляной кислоты до покраснения синей лакмусовой бумаги. В кислой среде из растворимых натриевых солей выделяются нерастворимые жирные кислоты, всплывающие наверх, их отфильтровывают и фильтрат используют для открытия глицерина и фосфорной кислоты. В. Открытие глицерина.Прозрачный фильтрат в сухой пробирке нейтрализуют раствором гидроксида натрия в присутствии фенолфталеина до появления слабо-розовой окраски. Затем фильтрат переносят в фарфоровый тигель и осторожно выпаривают. Половину сухого остатка из тигля переносят всухую пробирку, добавляют немного гидросульфата калия и нагревают до сплавления. Глицерин теряет воду, превращаясь в акролеин, имеющий резкий характерный запах кухонного чада. Г Обнаружение фосфорной кислоты.К оставшемуся в тигле сухому остатку добавляют шпателем нитрат натрия и карбонат калия в соотношении 1:2, перемешивают стеклянной палочкой и сплавляют до полного обесцвечивания. После охлаждения содержимое тигля растворяют в 2 мл концентрированной азотной кислоты. Раствор сливают в пробирку и нагревают с двойным объемом молибденового реактива. Наблюдают образование желтого осадка фос-формолибдата аммония. О + О → 12Н 2 МоО 4 + 24NH 4 NO 3 Н 3 РО 4 + 12Н 2 МоО 4 → Н 3 РО 4 • 12МоО 3 + НОН РО • 12МоО 3 + 3NH 4 NO 3 → (Р • 12МоО 3 ↓ + 3HNO 3 146 Вопросы и задания для самопроверки 1. В чем отличие простых липидов от сложных 2. Какова классификация сложных липидов 3. Какова структура фосфолипидов и их роль в строении и проницаемости клеточных мембран 4. Напишите структурные формулы серинфосфатида, холинфосфатида, кола- минфосфатида. Обозначьте лиофобную и лиофильную части молекул. 5. Напишите структурную формулу исходного липида, соответствующего составу каждой из следующих смесей, полученных при полном гидролизе липидов а) глицерин, олеиновая кислота, стеариновая кислота, неорганический фосфат, холин б) глицерин, пальмитиновая кислота, линолевая кислота, этаноламин, неорганический фосфат в) стингозин, глюкоза, олеиновая кислота. 6. Осуществите нижеперечисленные превращения с использованием структурных формул всех компонентов с указанием ферментов и продуктов реакций а) лецитин → диглицерид → моноглицерид; б) лецитин → лизолецитин → α-глицеролфосфохолин → фосфоглицерин → → глицерин в) кефалин → лизокефалин → α-глицеролфосфоколамин; г) ЦМФ → ЦДФ → ЦТФ → ЦДФ-холин. 7. Каково биологическое значение распада фосфолипидов Какие ферменты принимают участие в распаде фосфатидов? 8. Напишите уравнение реакций превращения нижеуказанных веществ, назовите ферменты а) холин → ацетилхолин б) холин → бетаин в) глицерин → акролеин. 9. Каким образом ЦТФ принимает участие в синтезе серинфосфатида? Приведите уравнения реакций с указанием ферментов. 10. Напишите последовательные этапы и суммарное уравнение для биосинтеза фасфатидилхолина из олеиновой и пальмитиновой кислот, α-глицерол фосфата и холина. Сколько молекул АТФ потребуется для синтеза фосфа- тидилхолина этим способом 147 ПРОИЗВОДНЫЕ ЛИПИДОВ Стероиды обнаружены во всех организмах, где они выполняют различные функции. К настоящему времени описано около 20 000 стероидов. Три наиболее важные группы стероидов составляют стеарины, желчные кислоты, стероидные гормоны. Кроме того, к стероидам относятся соединения растительного происхождения, обладающие ценными фармакологическими свойствами стероидные алкалоиды, гликозиды дигиталиса, стероидные сапонины. Стероиды — сложные жирорастворимые вещества, обладающие сходной структурой, в основе которых лежит конденсированная система циклопентан- пергидрофенантрен. А, В, Сконденсированные циклогексановые кольца D — циклопентан Характерная особенность большинства природных стероидов — наличие кислородсодержащего заместителя в положении С, метильных групп — Си Си алифатического заместителя R в положении С. По величине углеводородной цепи R стероиды делятся на различные группы андростен, эстран, прегнан, холан, холестан и др. В организме животных наиболее важным стерином является холестерин (холестерол). Холестерин присутствует практически во всех животных тканях, крови, особенно широко в нервных тканях. Он является важнейшей составной частью клеточных мембран. Запасной и транспортной формами холестерина служат его эфиры с жирными кислотами. Наряду с другими липидами холестерин и его эфиры присутствуют в составе липопротеидных комплексов плазмы крови. Холестерин входит в состав желчи и многих желчных камней. Нарушение обмена холестерина играет важную роль в развитии атеросклероза заболевания, связанного с отложением холестерина (бляшек) на стенках 148 кровеносных сосудов из‑за повышенного уровня холестерина в крови. Для предупреждения атеросклероза важно, чтобы в пищевом рационе преобладали продукты растительного происхождения, для которых характерно низкое содержание холестерина. Напротив, пищевые продукты животного происхождения содержат много холестерина, особенно яичный желток, мясо, печень, мозги. Очищенный холестерин — белое кристаллическое вещество с температурой плавления 150 С, оптически активен (α D 20–39°). Холестерин растворим в органических растворителях, особенно хорошо в хлороформе, вводе нерастворим, но легко набухает с образованием стойких эмульсий. Холестерин устойчив к действию щелочей, даже концентрированных. При извлечении липидов из мозга или других тканей холестерин переходит в неомыляемую фракцию, на которую щелочи не оказывают никакого действия. Работа 32. Выделение холестерина из мозга и качественные реакции на него Холестерин легко можно получить из тканей мозга. Препарат холестерина из мозга получают путем экстрагирования хлороформом. Реактивы и оборудование Мозговая ткань, гипс, хлороформ, серная кислота (конц, формалин. Стеклянные воронки, фарфоровые ступки с пестиком, пробирки, стеклянные палочки, пипетки на 1 и 2 мл, стеклянные пластинки. Ход работы А Выделение холестерина.Тщательно растирают г мозговой ткани в фарфоровой ступке с 6–10 г гипса до гомогенной ткани. Го- могенант распределяют тонким слоем стеклянной палочкой или скальпелем на стеклянной пластинке и высушивают в сушильном шкафу (60 С. Высушенную гомогенную массу соскабливают со стекла и мелко измельчают в ступке, затем переносят в пробирку. К сухому порошку в пробирке добавляют 5–6 мл хлороформа и экстрагируют в течение 5–10 минут. Полученный экстракт в хлороформе фильтруют всухую пробирку и используют для проведения качественных реакций на холестерол. Б Реакция Шиффа.В пробирку помещают мл холестерина в хлороформеи по стенке пробирки осторожно приливают 1 мл концентрированной серной кислоты. На границе между серной кислотой и раствором хлороформа образуется кольцо красного цвета. В Реакция Уайтби.В сухую пробирку с мл раствора холестерина в хлороформе прибавляют 2 мл смеси концентрированной серной кислоты с формалином (50 :1) и встряхивают. Верхний слой окрашивается в вишнево- красный цвета нижний — в буро-красный. Если верхний слой, содержащий холестерин, слить всухую пробирку и прибавить 2–3 капли уксусного ангидрида, то образуется синее окрашивание, медленно переходящее в зеленое. 149 Вопросы и задания для самопроверки 1. Какова классификация неомыляемых липидов 2. Какие соединения называются стероидами На какие группы разделяются стероиды Приведите примеры. 3. Какова структурная организация стероидов 4. Каковы биологические функции стероидов 5. Напишите структурные формулы пергидрофенантрена, циклопентанпер- гидрофенантрена, холестерина, пальмитохолестерида, холевой кислоты, мужского и женского половых гормонов. Укажите генетическую связь между перечисленными соединениями. 6. Каковы структура и физиологические функции холестерина 7. На чем основано выделение холестерина из биологических объектов 8. С помощью каких реакций можно обнаружить холестерин С помощью какой реакции и каким методом можно количественно определить холестерин в крови, в сыворотке крови 9. Какой витамин относится к стероидам Напишите его структурную формулу, укажите биологическую роль в организме человека. 10. Осуществите нижеперечисленные превращения с использованием структурных формул всех компонентов, укажите ферменты а) пальмитохолестерид → холестерин → дигидрохолестерин; б) стеарил-КоА + холестерол → HS-KoA + стеарохолестерид; в) β-окси-β-метилглутарил-КоА → HS-KoA + мевалоновая кислота г) мевалоновая кислота → фосфомевалоновая кислота → пирофосфомева- лоновая кислота → изопентинилпирофосфат → диметилаллилпирофосфат; д) диметилаллилпирофосфат + изопентинилпирофосфат → геранилпиро- фосфат → фарнезилпирофосфат → сквален. 15 0 ГЛАВА 7. ГОРМОНЫ Гормоны — вещества органической природы, вырабатывающиеся в специализированных клетках желез внутренней секреции, поступающие в кровь и оказывающие регулирующее влияние на обмен веществ и физиологические функции. Термин гормон (от греч. hormao — возбуждаю) был введен в 1905 г. У. Бейлиссом и Э. Старлингом при изучении открытого ими в 1902 г. гормона секретина. К настоящему времени открыто более сотни различных веществ, наделенных гормональной активностью. Гормоны циркулируют в крови в очень низких концентрациях 10 –7 –10 –12 М. Однако эти величины сильно варьируют. Концентрация гормонов подвержена периодическим колебаниям, цикл или ритм которых может зависеть от времени дня, месяца, времени года или менструального цикла. Многие гормоны поступают в кровь импульсами и нерегулярно. Поэтому концентрация гормонов может меняться эпизодически. Выброс гормонов может являться ответом организма на внешнее воздействие или на изменение внутреннего состояния. Концентрация гормонов в крови находится под строгим контролем, причем контроль осуществляется как на стадии синтеза, таки на стадии выброса. Большинство гормонов переносится в кровоток в виде комплексов с плазматическими белками (переносчики гормонов, причем связывание с переносчиками носит обратимый характер. В органах-мишенях имеются клетки, несущие рецепторы, способные связывать гормоны и тем самым воспринимать гормональный сигнал. После связывания гормонов рецепторы передают информацию клетке и запускают цепь биохимических реакций, определяющих клеточный ответ на действие гормона. В зависимости от механизма взаимодействия гормонов с рецептором все гормоны делятся на две группы — гормоны, не проникающие в клетку и взаимодействующие с рецепторами на наружной стороне мембраны (гормоны пептидной и белковой природы, катехоламины): — гормоны, проникающие внутрь клетки и взаимодействующие с рецепторами в цитоплазме клеток (стероидные гормоны, тиреоидные гормоны. Биологическое действие гормонов в организме следующее — изменяют проницаемость мембраны для определенных веществ например, для глюкозы, аминокислот — регулируют активность отдельных ферментов путем аллостерического воздействия — регулируют синтез ферментов, действуя на генетический аппарат клетки — влияют на образование белковой части фермента (или на распад фермента) и образование кофермента. 151 Гормоны осуществляют гуморальную рефляцию обмена веществ и координацию функций организма. Они регулируют размножение, рост, развитие организма, влияют на дифференцировку тканей, формирование тканей, формирование функций, на поддержание системы, участвуют в адаптационных реакциях на стресс и т. д. Химическая природа почти всех известных гормонов выяснена, однако до сих пор не разработаны общие принципы их номенклатуры. Поскольку химические названия большинства гормонов очень громоздки, более распространена тривиальная номенклатура, например инсулин, вазопрессин, пролактин и др. Существуют несколько подходов в отношении классификации гормонов по химическому составу, месту синтеза, растворимости, механизму действия. По месту синтеза (анатомическая классификация) гормоны делят наследующие группы 1. Гормоны гипоталамуса тиреолиберин, люберин, соматостатин, сомато-либерин, меланолиберин, меланостатин. 2. Гормоны гипофиза соматотропин, кортикотропин, тиреотропин, пролактин, фоллитропин, лютропин, вазопрессин, окситоцин. 3. Гормоны щитовидной железы тироксин, кальцитонин. 4. Гормоны поджелудочной железы инсулин, глюкагон, эластин. 5. Гормоны надпочечников адреналин, норадреналин, изопропиладрена- лин, кортикостероиды. 6. Гормоны половых желез эстрогены, андрогены. Однако анатомическая классификация недостаточно совершенна, поскольку некоторые гормоны или синтезируются не в тех железах внутренней секреции, из которых они секретируют в кровь (например, вазопрессин и окситоцин, или синтезируются ив других железах (например, половые гормоны частично синтезируются в коре надпочечников. Наиболее приемлемой следует считать химическую классификацию 1. Аминокислоты и их производные катехоламины, тиреоидные гормоны, мелатонин и др. 2. Пептидные и белковые гормоны а) пептиды кортикотропин (АКТГ), глюкагон, кальцитонин, соматостатин, вазопрессин, окситоцин б) простые белки пролактин, соматотропин, инсулин в) сложные белки фоллитропин, лютропин, тиреотропный гopмон. 3. Производные стероидов кортикостероиды, андрогены, эстрогены. При классификации по растворимости гормоны делятся на две группы 1. Липофильные — после секреции гормоны этой группы связываются с транспортными белками, что разрешает проблему растворимости. 2. Гидрофильные, те. группа водорастворимых гормонов. 152 По механизму действия выделяют две группы 1. Гормоны, связывающиеся с внутриклеточными рецепторами эстрогены, андрогены, тиреоидные гормоны (Т и Т, протеины, глюко- и металлокорти-коиды. 2. Гормоны, связывающиеся с рецепторами на поверхности клеток андренокортикотропный (АКТГ), липотропин (ЛПГ), гастрин, инсулин, пролактин, гормон роста и т. д. Работа 33. Качественное определение гормонов Гормоны определяются двумя способами биологическим (испытание на животных) и химическим (цветные реакции. Реактивы и оборудование Таблетки тиреоидина серная кислота (конц йодат калия (1 % и 10 %); крахмал (1 %); раствор инсулина (в ампулах гидроксид натрия (0,1 %, 10 %, 30 %); уксусная кислота (0,5 %, 10 %); сульфосалициловая кислота (20 %); адреналин содержимое ампулы растворяют в 100 мл дистиллированной воды хлорид железа (II) (1 %); сульфаниловая кислота (1 %); нитрит натрия (5 %); карбонат натрия (10 %); спиртовой раствор фолликулина в делительную воронку наливают 100 мл этанола и масляный раствор фолликулина из 10 ампул, фолликулин экстрагируют спиртом при встряхивании, слоям дают разделиться, нижний (масляный) слой отбрасывают, верхний (спиртовой) используют для работы реактив Фолина: 100 г Na 2 WO 4 • 2H 2 O и 25 г Nа 2 МоO 4 • Н растворяют в 700 мл Н в круглодонной колбе на 1 л, снабженной пришлифованным холодильником Либиха. Прибавляют 50 мл 85 % Н 3 РО 4 и 100 мл HCl (конц. Помещают в колбу несколько капилляров. Смесь кипятят с обратным холодильником 10 часов. Затем прибавляют 150 г Li 2 SO 4 , 50 мл Ни несколько капель Br 2 . Не пользуясь более обратным холодильником, кипятят содержимое колбы в течение 15 минут для удаления избытка Br 2 (тяга. Раствор охлаждают, доводят Н до объема 1 ли фильтруют через стеклянный фильтр. Хранят реактив Фолина в склянке из темного стекла. Все реактивы для приготовления реактива Фолина должны быть химически чистыми Пробирки, пипетки на 1, 2 мл, водяная баня (или термостат. А. Реакции на гормоны щитовидной железы (тиреоидин) Щитовидная железа синтезирует и секретирует высокоактивные йодсодер жащие тиреоидные гормоны тироксин (Т, 3, 3 1 , 5 — трийодгиронин (Та также нейодированный гормон тиреокальцитонин (полипептид), функция которого связана с регуляцией уровня кальция и фосфора в крови. Йодтиронины можно рассматривать как производные L-тиронина, образованные в организме из тирозина 153 При разрушении тиреоидина образуется йодид калия, из которого йод легко вытесняется йодатом калия. Вытеснение йода из соли йодистоводородной кислоты является окисли- тельно-восстановительной реакцией, где йодид калия служит восстановителем, а йодат калия — окислителем. Выделившийся йод обнаруживают с помощью крахмала в кислой среде 5KI + К + 3H 2 SO 4 → 3I 2 + 3K 2 SO 4 + 3H 2 O Ход работы Гидролиз тиреоидина.В ступку помещают0,5таблетки тиреоидина, тщательно растирают, затем пересыпают в пробирку и добавляют 10 капель концентрированной серной кислоты. Осторожно нагревают (во избежание вспенивания) в течение 12 минут. Затем охлаждают. Обнаружение йода. К гидролизату прибавляют 3 капли 1 % раствора крахмала капель 1 % раствора йодата калия. Наблюдают появление синего окрашивания. Б. Реакции на гормоны поджелудочной железы (инсулин) В поджелудочной железе вырабатывается ряд гормонов инсулин, глюкагон, липокаин. Инсулин (от лат. insula — островок) вырабатывается в клетках островков Лангерганса, откуда и получил свое название. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей, соединенных друг с другом дисульфидными связями. Первичная структура инсулина полностью расшифрована. Молекула инсулина, содержащая 51 аминокислотный остаток, состоит из двух цепей А (21 аминокислотный остаток) и Б (30 аминокислотных остатков. Пептидные цепи Аи Б соединены двумя дисульфидными связями (7–7 и 19–20), кроме того, вцепи А имеется дисульфидная связь между 6 и 11 остатками цис, в результате чего образуются петли. 154 Видовая специфичность инсулина связана с изменениями на участке 8–10 цепи А. Наиболее близким по своей структуре к инсулину человека является инсулин свиньи. Инсулин может существовать в нескольких формах, отличающихся по биологическим, иммунологическими физико-химическим свойствам. Различают две формы инсулина свободную, вступающую во взаимодействие с антителами, полученными к кристаллическому инсулину, и стимулирующую усвоение глюкозы мышечной и жировой тканями связанную, не реагирующую с антителами и активную только в отношении жировой ткани. Молекулярная форма связанного инсулина варьирует от 60000 до 100 000 Да. Установлена локализация его в белковых фракциях крови, в частности в области трансферринов и глобулинов. Кроме свободного и связанного инсулинов, различают так называемую форму А инсулина, занимающую промежуточное положение и появляющуюся на быструю потребность организма в инсулине. Инсулин играет важную роль в метаболизме углеводов снижает содержание глюкозы в крови, увеличивает биосинтез гликогена в печении мышцах, усиливает липогенез, те. образование жиров из углеводов. Инсулин является антагонистом адреналина в регуляции синтеза и мобилизации гликогена. Ход работы К мл раствора инсулина прибавляют по каплям раствор гидроксида натрия до выпадения хлопьевидного осадка, который растворяется при подкислении 0,5 % раствором уксусной кислоты (pH 2,5–3,5). К 1 мл раствора инсулина прибавляют 3–5 капель 20 % раствора сульфо салициловой кислоты. Наблюдают выпадение осадка. Инсулин дает ряд реакций, специфических для белков биуретовую, Фоля, Миллона (см. работу 1). Проделайте некоторые из них. 155 В. Реакции на гормоны мозгового слоя надпочечников (адреналин) В мозговом слое надпочечников синтезируются катехоламины, имеющие пирокатехиновое ядро и аминогруппу Биосинтез катехоламинов происходит в мозговом слое надпочечников из аминокислоты тирозин, которая также легко может образоваться из фенилаланина (в печени. Катехоламины, а также глюкагон (гормон поджелудочной железы) и адренокортикотропный гормон (АКТФ — гормон передней доли гипофиза) способствуют распаду гликогена, стимулируют фосфорилазную активность в печени, мышцах, надпочечниках, ноне прямо, а через аденилатциклазу. Адреналин легко окисляется на воздухе с образованием адренохрома, окрашивающегося в щелочной среде в красный цвет. При взаимодействии с нитритами наблюдается желто-оранжевое окрашивание, с диазореактивом — красное, с хлорным железом — зеленое, с йодатом калия — красно-фиолетовое. а) Реакция с хлоридом железа (III). При добавлении к раствору адреналина хлорного железа жидкость окрашивается в изумрудно-зеленый цвет, вследствие образования комплексного соединения типа фенолята железа. Реакция с хлорным железом доказывает наличие пирокатехинового ядра в молекуле адреналина. 156 Ход работы В пробирку вносят мл раствора адреналина,прибавляют 1 каплю 1 % раствора хлорида железа (III) и перемешивают. Наблюдают появление изумрудно-зеленой окраски. Затем добавляют 1 каплю 10 % раствора гидроксида натрия — возникает вишнево-красное окрашивание. б) Реакция с диазореактивом. При взаимодействии диазореактива с адреналином жидкость окрашивается в красный цвет вследствие образования сложного соединения типа азокрасителя. Ход работы К мл раствора сульфаниловой кислоты прибавляют мл % раствора нитрита натрия, затем 1,5 мл раствора адреналина (1:1 000) и 1 мл 10 % раствора карбоната натрия. Перемешивают, наблюдают окрашивание раствора в красный цвет. в) Реакция с йодатом калия. Адреналин в кислой среде с йодатом калия образует соединение красно-фиолетового цвета. Ход работы К мл раствора адреналина прибавляют мл раствора йодата калия, 10 капель 10 % раствора уксусной кислоты, смесь подогревают до 60–65 С. Появляется интенсивное красно-фиолетовое окрашивание. Г. Реакции на гормоны половых желез (фолликулин) Половые гормоны синтезируются в семенниках, яичниках, плаценте и надпочечниках. В яичниках вырабатываются эстрогены, прогестин, релаксин. Вовремя беременности, помимо яичников, эндокринную функцию выполняет также плацента, выделяющая большое количество эстрогенов, прогестинов и собственный специфический гормон — хорионический гонадотропин. Основными природными эстрогенами являются эстрадиол, эстрон и прогестерон Эстрогены имеют гидроксильную группу С, которая благодаря наличию ненасыщенного ароматического кольца обладает фенольной природой. Эстрогены найдены во всех тканях ив циркулирующей крови. Эти гормоны и их метаболиты находятся в крови частично в свободном состоянии, частично в комплексе с белками. 157 Мужские половые гормоны — андрогены — можно рассматривать как производные андростана. К мужским половым гормонам относятся тестостерон и андростерон Андрогены содержат кето-группу у Си гидроксо-группу у С. Андрогены вырабатываются интерстициальной тканью семенных железа также корой надпочечников и яичниками. Андрогены, являясь стероидными гормонами, нерастворимы вводе и могут транспортироваться плазмой только в комплексе с белками. а) Реакция сконцентрированной серной кислотой. Ход работы В пробирку помещают мл спиртового раствора фолликулина и помещают в кипящую водяную баню на 5–10 минут для испарения спирта. К оставшемуся в пробирке фолликулину добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты и пробирку вновь помещают в кипящую водяную баню на 5–10 минут. Жидкость в пробирке окрашивается в соломенно-желтый цвет, переходящий при нагревании в оранжевый и имеющий зеленую флюоресценцию. б) Реакция на фенольную группу. Ход работы К мл спиртового раствора фолликулина добавляют мл % раствора гидроксида натрия и 1 мл реактива Фолина. Появляется синее окрашивание, характерное для фенольной группы. Отчет по работе следует оформить в виде таблицы Таблица 16. Цветные реакции на гормоны Название железы Название Строение Применяемые Наблюдаемое внутренней секреции гормона гормона в опыте реактивы окрашивание Работа 34. Количественное определение адреналина Метод основан на фотоколориметрическом определении интенсивности синего окрашивания, которое образуется при взаимодействии адреналина с реактивом Фолина. 158 Реактивы и оборудование Стандартный раствор адреналина в мерную колбу на 25 мл отмеривают 1 мл раствора адреналина (1:1 000) и доводят до метки водой 1 мл такого раствора содержит 0,04 мг адреналина карбонат натрия (10 % свежеприготовленный раствор исследуемый раствор адреналина в мерную колбу емкостью 25 мл вносят 0,9 мл 0,1 % (1:1 000) раствора адреналина и доводят объем жидкости до метки дистиллированной водой. Перемешивают. Полученный раствор содержит 0,036 гл адреналина реактив Фолина (см. работу 33). Фото- колориметр, мерные пробирки, пипетки на 1 и 5 мл, мерные колбы на 25 мл. Ход работы Готовят две мерные сухие пробирки емкостью мл. В первую вносят 1 мл стандартного раствора адреналина, во вторую — 1 мл исследуемого раствора адреналина и приливают в обе пробирки по 4 мл 10 % раствора карбоната натрия и по 0,5 мл реактива Фолина. Содержимое пробирок встряхивают. Жидкость постепенно окрашивается в синий цвет, достигающий наибольшей интенсивности через 3–5 минут. Далее объем жидкости в пробирках доводят до метки раствором карбоната натрия. Содержимое пробирок перемешивают и измеряют оптическую плотность стандартного и исследуемых растворов на фотоэлектроколориметре с красным фильтром против контроля, содержащего 1 мл дистиллированной воды, 4 мл 10 % раствора карбоната натрия и 0,5 мл реактива Фолина. Концентрацию адреналина в исследуемом растворе (мг / мл) рассчитывают по формуле С = 0,04 • D |