Ганеева Л. А., Зайнуллин ли, Абрамова З. И
 Скачать 5.05 Mb.
|
|
ФОСФОПРОТЕИНЫ Фосфопротеины — сложные белки, содержащие в качестве небелковой части остатки фосфорной кислоты (0,5–1 %). Фосфорная кислота в фосфопро- теинах связана с радикалами серина и треонина эфирной связью. Наиболее часто остатки фосфорной кислоты связаны с гидроксилом того серина, который находится в пептидной цепи рядом с глутаминовой кислотой. К фосфо- протеинам относятся казеиногены молока, вителлин, фосфатин яичного желтка, овальбумин белка куриного яйца, ихтулин икры рыб, некоторые ферменты фосфорилаза, фосфоглюкомутаза, пепсин. Фосфопротеины в клетках синтезируются в результате посттрансляци- онной модификации, подвергаясь фосфорилированию при участии протеин 38 киназ. Уровень фосфопротеинов в клетке зависит в значительной степени от регулирующего действия ферментов, катализирующих фосфорилирование (протеинкиназы) и дефосфорилирование (протеинфосфотазы). Следует особо отметить, что ряд ключевых ферментов, регулирующих процессы внутриклеточного обмена веществ, также существуют как в фосфорилированной, таки в дефосфорилированной формах. Фосфопротеины служат одним из питательных материалов для развития эмбрионов и для растущих организмов. Так, казеиноген (казеин) молока содержит все незаменимые аминокислоты и фосфорную кислоту. Вместе с казеиногеном в организм ребенка поступает фосфорная кислота, необходимая для развития скелета и процессов обмена веществ. Казеиноген молока представлен в виде растворимой кальциевой соли, содержащей два важных минеральных вещества — фосфор и кальций. Таким образом, фосфопротеины являются ценными источниками энергетического и пластического материала в процессе эмбриогенеза и дальнейшего постнатального роста и развития организма. Работа 9. Выделение казеиногена из молока и гидролиз его, определение продуктов гидролиза Казеиноген обладает кислыми свойствами ив молоке находится в виде анионов, растворимых вводе кальциевая соль казеиногена). Изоэлектрическая точка казеиногена находится при pH 4,7. Этим объясняется, что при подкислении молока до 4,7 молоко свертывается в результате выпадения в осадок казеиногена. Не следует добавлять в молоко избыток кислоты, так как молекулы казеиногена вновь перезаряжаются и переходят в раствор, что мешает осаждению. Реактивы и оборудование Серная кислота (10 %); концентрированная уксусная кислота гидроксид натрия (10 %); сульфат меди (1 %); карбонат натрия (0,1 %); фенолфталеин (0,5 % спиртовой раствор концентрированная азотная кислота молоко молибденовый реактив 7,5 г молибдата аммония растворяют в 100 мл дистиллированной воды и добавляют 100 мл 32 % раствора азотной кислоты (плотность 1,21 г / мл. Воронки, фильтры, пробирки, стеклянные палочки, пипетки на 2 мл, колбочки с обратным холодильником. Ход работы К мл молока приливают равный объем дистиллированной воды. Осаждают казеиноген добавлением 2 капель концентрированной уксусной кислоты. Выпавший осадок казеиногена отфильтровывают и промывают на фильтре дистиллированной водой два раза. Все содержимое с фильтра переносят в колбу (или пробирку, осадок с фильтра смывают в туже колбу 2 мл 0,1 % раствора карбоната натрия и добавляют 4 мл 10 % раствора гидроксида натрия. Колбу закрывают 39 пробкой с обратным холодильником и кипятят на умеренном огне 15 минут с момента закипания. После охлаждения к гидролизату добавляют равный объем 0,1 % раствора карбоната натрия и проводят реакции на продукты гидролиза. Белок открывают биуретовой реакцией (см. работу 1). Фосфат обнаруживают молибденовой пробой. К 10 каплям гидролизата добавляют 1 каплю фенолфталеина и 1 каплю концентрированной азотной кислоты и после обесцвечивания реакционной смеси добавляют 20 капель молибденового реактива. Затем доводят содержимое пробирки до кипения и сразу охлаждают ее в струе холодной воды. На дне пробирки появляется желтый осадок фосфорномолибденовокислого аммония. ХРОМОПРОТЕИНЫ Хромопротеины — сложные белки, простетическая группа которых представлена окрашенным небелковым компонентом, откуда и произошло их название (от греч. chroma — краска. Среди хромопротеинов различают гемопро- теины, магнийпорфирины, флавопротеины. Хромопротеины наделены рядом уникальных биологических функций они участвуют в фотосинтезе, дыхании клеток и целостного организма, в транспорте кислорода и углекислого газа, в окислительно-восстановительных реакциях, в свето- и цветовосприятии. Таким образом, хромопротеины играют исключительно важную роль в процессах жизнедеятельности. Достаточно, например, подавить дыхательную функцию гемоглобина путем введения угарного газа или синильной кислоты или ее солей (цианидов, ингибирующих ферментные системы клеточного дыхания, как моментально наступает смерть организма. К хромопротеинам относятся гемоглобин и его производные, миоглобин, хлорофиллсодержащие белки, вся цитохромная система, каталаза, пероксидаза, ксантиноксидаза, альдегидоксидаза, дигидрооротатдегидрогеназа и др. Работа 10. Качественное определение геминовой группировки гемоглобина Гемоглобин состоит из белка (глобина) и простетической группы (гема. По химической природе гем — соединение протопорфирина с двухвалентным железом, способное при особых условиях переходить в трехвалентное метгемоглобин. В каждой молекуле гемоглобина 4 молекулы гема и 4 атома железа. Молекула гемоглобина взрослого человека состоит из двух пари идентичных полипептидных цепей. Видовая специфичность гемоглобина зависит от белковой части глобина, поскольку гем имеет одинаковое строение для всех гемоглобинов. Качественное определение геминовой группировки гемоглобина обусловлено способностью гемоглобина катализировать окисление бензидина перекисью водорода. Бензидин при этом окисляется в парахинондиимин и жидкость приобретает 40 синюю окраску, а при стоянии — красную. Аналогично протекает реакция и с гваяковой кислотой. Эти реакции очень чувствительны и служат для обнаружения минимальных количеств крови в биологических жидкостях. Реактивы и оборудование Кровь перекись водорода (3 %); 1 % раствор бензидина 1 г бензидина растворяют в ледяной уксусной кислоте и доводят объем д 100 мл, хранят в холодильнике в темной склянке с притертой пробкой. Для растворения используют бензидин основной Н 2 N—С 6 Н 4 —C 6 H 4 —NH 2 ; роданид аммония или роданид калия (1 %); концентрированная азотная кислота соляная кислота (10 %). Пробирки, пипетки, тигли с крышками. Ход работы А В первую пробирку наливают мл крови,во вторую мл дистиллированной воды. В обе пробирки добавляют по 0,5 мл 1 % раствора бензидина и по 0,5 мл 3 % раствора перекиси водорода. В пробирке с кровью жидкость окрашивается в синий цвет, через некоторое время смесь приобретает красную окраску. Б На крышку тигля вносят2капли крови и озоляют,добавив4капли концентрированной азотной кислоты, продолжают нагревание до образования сухого остатка. Затем остаток растворяют в 10 % растворе соляной кислоты, прибавив несколько капель. К образовавшемуся раствору прибавляют 2 капли раствора роданида аммония или роданида калия и наблюдают образование роданида железа, окрашивающего жидкость в красный цвет. Вопросы и задания для самоподготовки 1. Что положено в основу классификации белков 2. Можно ли считать существующие виды классификации белков научно обоснованными 3. Какова классификация белков по химическому составу По каким признакам классифицируют простые белки Приведите примеры. 4. В чем отличие сложных белков от простых Дайте краткую характеристику классам сложных белков. 5. Какие белки относятся к гликопротеинам Какие вещества являются их простетической группой Приведите примеры, напишите их структурные формулы. 6. Каким образом осуществляется взаимодействие белковой части и простетической группы в гликопротеинах 7. Какова биологическая роль фосфопротеинов? Какую роль играют процессы фосфорилирования и дефосфорилирования в обмене веществ 8. Почему гемоглобин, цитохромы, флавопротеины относят к классу хромо протеинов Каковы особенности их строения Приведите структурную формулу простетической группы гемоглобина. Каким образом она соединяется с белковой частью Чем объясняется видовая специфичность гемоглобина. Каковы биологические функции хромопротеинов? 10. Какими методами изучают химический состав сложных белков 11. Какими качественными реакциями можно обнаружить продукты гидролиза а) казеиногена, б) гемоглобина 12. Какие два класса белков выделяют, основываясь на форме белковой молекулы. Каковы особенности строения фибриллярных белков Приведите примеры строения коллагена, кератинов. Каковы основные функции фибриллярных белков 14. Дайте краткую характеристику классам глобулярных белков в соответствии с особенностями строения их вторичной и третичной структуры. 15. Какова функциональная классификация белков (Перечислите классы) Каково значение классификации белков по функциям Дайте краткую характеристику представителям некоторых классов (строительные, сократительные, дыхательные, защитные. ОБМЕН БЕЛКОВ Белковый обмен занимает особое место в многообразных превращениях веществ, характерных для всех живых организмов. Выполняя ряд уникальных функций, свойственных живой материи, белки определяют специфику клеток, органов и целостного организма (пластическая функция) ив значительной степени динамическое состояние между организмом и окружающей средой. Кроме того, белки выполняют уникальную каталитическую функцию, которой не наделены ни жиры, ни углеводы, никакие либо другие органические соединения. Белковый обмен строго специфичен, направлен и настроен, обеспечивая непрерывность воспроизводства и обновления белковых тел организма, обеспечивая тем самым непрерываемость жизни. Таблица 5. Содержание белка в некоторых пищевых продуктах Наименование продукта Содержание Наименование продукта рас- Содержание животного происхождения белка (%) тительного происхождения белка (%) Мясо 18 –22 Рис 8 Рыба 17 –22 Горох 26 Сыр 20 –36 Соя 35 Яйца 13 Гречневая крупа 11 Молоко 3,5 Картофель 1,5 –2 Главными источниками белков для человека являются пищевые продукты животного и растительного происхождения. Биологическая ценность пищевого белка целиком зависит от степени его усвоения организмом, что в свою очередь определяется соотношением между аминокислотным составом потребляемого белка и аминокислотным составом белков тела. Такой белок лучше 42 используется организмом для синтеза белков тканей и органов. Для человека белки мяса, молока, яиц биологически более ценны, поскольку их аминокислотный состав ближе к аминокислотному составу органов и тканей. Однако это не исключает приема растительных белков, в которых содержится необходимый набор аминокислот, нов другом соотношении, поэтому для биосинтеза одного итого же количества собственных белков тела человеку потребуется значительно больше растительных белков, чем животных. Нормы белка для взрослого человека и для детей разного возраста основаны на результатах многочисленных научных исследований. Эти нормы выводятся из оптимального содержания белка в пищевом рационе. Так, взрослый человек, занимающийся умственным трудом и подвергающийся средней физической нагрузке, должен получать в сутки 100–120 г белка. Потребности белка в детском возрасте определяются в первую очередь возрастом и массой тела. Дети даже раннего возраста нуждаются в получении 55–72 г белка в сутки. С возрастом (от 12 до 15 лет) эта норма увеличивается до суточной нормы взрослого человека. В организме взрослого человека метаболизм белка в целом сбалансирован, те. количество поступающего и выделяемого белкового азота примерно равно. Предполагается, что в организме взрослого человека (массой около 70 кг) ежедневно разрушается до аминокислот 300–400 г белка. В тоже время примерно такое же количество аминокислот включается во вновь образованные молекулы белка. Высокий оборот белка в организме необходим потому, что многие белки относительно недолговечны, они начинают обновляться спустя несколько часов после синтеза, а биохимический полупериод составляет 2–8 дней. Еще более короткоживущими являются ферменты метаболизма. В противоположность им долговечны структурные белки, гистоны, гемоглобин. Таблица 6. Содержание незаменимых аминокислот в белках различного происхождения (в % на сухую массу) Аминокислоты Пшеничная Соевая Рыба Говядина Коровье Кормовые мука мука молоко дрожжи Аргинин 4,2 4,7 5,0 7,7 4,1 8,0 Гистидин 2,2 2,4 2,3 3,3 2,6 7,1 Изолейцин 4,2 5,4 4,6 6,0 7,8 5,5 Лейцин 7,0 7,7 7,8 8,0 11,0 7,6 Лизин 1,9 6,5 7,5 10,0 8,7 6,8 Фенилаланин 5,5 5,1 4,0 5,0 5,5 3,9 Треонин 2,7 4,0 4,2 5,0 4,7 5,4 Триптофан 0,8 1,5 1,2 1,4 1,5 1,6 Валин 4,1 5,0 5,2 5,5 7,1 6,1 * Не синтезируется в детском организме. 43 Полученные с пищей белки подвергаются полному гидролизу в желудочно-кишечном тракте до аминокислот, которые всасываются кровотоком и распределяются в организме. Не могут синтезироваться во взрослом организме человека 8 из 20 белковых аминокислот, в детском — 10. Эти незаменимые аминокислоты должны поступать с пищей. ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ Весь сложный процесс переваривания пищевых белков в желудочно-ки- шечном тракте происходит таким образом, чтобы путем последовательного действия протеолитических ферментов лишить белки пищи видовой и тканевой специфичности и придать продуктам распада способность всасываться в кровь через стенку кишечника. Ферментативная деградация белков катализируется гидролазами, которые ускоряют разрыв пептидных связей. Причем известны две группы пептидаз экзопептидазы, катализирующие разрыв концевых пептидных связей, и эндопептидазы, катализирующие пептидные связи внутри полипептидной цепи. Эндопептидазы обладают разной субстратной специфичностью действия, определяемой природой радикалов аминокислот по соседству с разрываемой пептидной связью. Белки в желудке денатурируют под действием соляной кислоты и становятся более чувствительными к атаке эндопептидазами желудочного сока. Желудочный сок содержит свободную соляную кислоту, муцины, неорганические соли и предшественников различных ферментов пепсиногены, прохимозин и др. Наиболее важными пищеварительными ферментами желудочного сока являются пепсиногены, которые аутокаталитически активируются при низких значениях pH до пепсинов. Пепсин отличается высокой устойчивостью в сильнокислой среде и характеризуется низким значением изоэлектрической точки (pI 1). Пепсин гидролизует внутренние пептидные связи, образованные ароматическими аминокислотами, а также ала–ата, ала–сер. В желудке интенсивный процесс переваривания белков продолжается в течение часов. Кислое содержимое желудка порциями поступает в двенадцатиперстную кишку, где смешивается со щелочным секретом поджелудочной железы и желчью. Секрет поджелудочной железы содержит множество ферментов, среди которых трипсиноген, химотрипсиноген, эластаза, карбоксипептидаза. Ключевую роль среди протеолитических ферментов играет трипсиноген. Трипсиноген активируется энтеропептидазой, отщепляющей концевой гексапептид, вследствие чего функциональные группы радикалов аминокислот перестраиваются, образуя активный центр. Образующиеся молекулы трипсина способны активировать следующие молекулы трипсиногена (аутокатализа также активировать другие зимогены: химотрипсиноген, проэластазу, прокарбоксипептидазу. 44 Трипсин, химотрипсин, эластаза являются эндопептидазами, те. расщепляют внутренние пептидные связи. Трипсин гидролизует пептидные связи, образованные основными аминокислотами (лиз, арг), химотрипсин ускоряет гидролитический разрыв пептидных связей, образованных карбоксильными группами ароматических аминокислот (фен, тир, три, а эластаза — пептидные связи, образованные гли, ала, сер. Все эти ферменты являются гидролазами с pH- оптимумом в нейтральной или слабощелочной среде (pH 7,5–8,8). Образовавшиеся пептиды небольшого размера атакуются карбоксипептидазами. Дальнейший гидролиз пептидов до свободных аминокислот, помимо карбоксипептидаз, осуществляется в стенках тонкого кишечника аминопептидазами и различными дипептидазами. Среди дипептидаз кишечного сока хорошо изучена глицил-глицин-дипептидаза, а также пролил-дипептидаза, катализирующая гидролиз пептидной связи, в образовании которой участвует карбоксигруппа пролина и пролин-дипептидаза, гидролизующая амидную связь дипептидов про–про. Эта группа ферментов относится к экзопептидазам. При этом образуются свободные аминокислоты, которые подвергаются всасыванию слизистой кишечника с одновременным поглощением ионов натрия. Работа 11. Гидролиз казеина при участии трипсина Трипсин — фермент, относящийся к классу гидролаз, подклассу пептид- пептидгидролаз (эндопептидаз), подподклассу сериновые протеиназы. Строение трипсина хорошо изучено. Это белок с относительной молекулярной массой, равной 23 950, состоит из 228 аминокислотных остатков. Первичная структура трипсина полностью выяснена, также многое известно о вторичной и третичной структурах. В активный центр трипсина входят аминокислоты серин остаток, гистидин остаток. Благодаря сочетанию перечисленных аминокислот в молекуле трипсина и осуществляется гидролиз пептидных связей после аргинина и лизина ала–фен–лиз–вал–арг–глу–гли + НО → ала– фен– лиз + вал–арг + глу–гли. Степень распада белка при действии на него трипсина можно проследить по увеличению количества аминогрупп, освобождающихся при гидролизе пептидных связей белка. Чем больше освободилось α-аминных групп, тем больше, соответственно, распалось пептидных связей и тем выше, следовательно, степень деструкции белковой молекулы. Реактивы и оборудование Раствор казеина (10 мг в 1 мл навеску казеина растворяют в небольшой порции 0,1 % раствора карбоната натрия при осторожном нагревании, разбавляют дистиллированной водой и осторожно нейтрализуют 0,1 н. раствором соляной кислоты раствор трипсина 0,25 мг в 1 мл 0,2 М трис-буфер (рН 8,0): смешивают 50 млн. раствора триоксиметиламинометана с 26,8 млн. раствора соляной кислоты и доводят до 100 мл дистиллированной водой нингидрин (3 %); изопропиловый спирт (50 %); ацетатный буфер (pH 5,4): 270 г ацетата натрия растворяют в 200 мл дистиллированной воды и добавляют 50 мл перегнанной уксусной кислоты и доводят объем до 750 мл дистиллированной водой. ФЭК, термостат, пробирки, штативы для пробирок, пипетки на 1 и 5 мл. Ход работы В две пронумерованные пробирки вносят по мл М трис- НСl буфера (pH 8,0) и по 1 мл 1 % раствора казеина. В одну пробирку приливают мл 0,025 % раствора трипсина, в другую — 1 мл инактивированного раствора трипсина (заранее прокипяченного не менее часа. Растворы хорошо перемешивают и тотчас берут из каждой пробирки по 0,5 мл содержимого в две тщательно вымытые пробирки. Оставшиеся опытную и контрольную пробы помещают в термостат (38 Сна часа, отбирая из них аликвоты по 0,5 мл через 30, 60, 90, 120 минут. В отобранных аликвотах проводят реакцию на наличие свободных α- аминогрупп, для чего их помещают в кипящую водяную баню на 10 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры, после чего прибавляют по 0,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл ацетатного буфера (pH 5,4) и 0,5 мл нингидри-нового реактива. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и помещают для развития окраски в термостат (95 Сна минут. Затем, не вынимая пробирок из термостата, прибавляют в каждую из них по 5 мл 50 % раствора изопропанола. Оптическую плотность опытной пробы измеряют на ФЭКе против контроля при длине волны 507 нм (зеленый светофильтр. Полученные результаты выражают графически, откладывая по оси абсцисс время инкубации, а по оси ординат значения оптических плотностей. Полученная прямая наглядно демонстрирует динамику высвобождения во времени свободных аминогрупп в процессе гидролиза казеина в присутствии трипсина. Вопросы и задания для самопроверки 1. Какое место занимает обмен белков в метаболизме веществ Почему 2. Под влиянием каких ферментов происходит расщепление белков Назовите класс, подкласс, подподкласс этих ферментов Дайте характеристику отдельным представителям. 3. Почему протеолитические ферменты находятся в желудочно-кишечном тракте в виде зимогенов? Каким образом происходит их активирование Что такое аутокатализ 4. Какие ферменты ускоряют гидролиз внутренних пептидных связей белка Дайте краткую характеристику отдельным представителям этого подкласса. 5. Какие пептидные связи гидролитически расщепляются при участии химо- трипсина Опишите механизм действия химотрипсина. 6. Укажите, каким образом действует химотрипсин на пептид лей–тир–цис– фен–лиз–ала–три–арг–цис–фен–глу–ала–лей–иле. 46 7. Укажите, каким образом действует пепсин на пептид лиз–ала–гли–асп– фен–гли–асп–ала–фен–глу–сер–арг–фен–ала–ада–гли. 8. Какие пептиды образуются при обработке трипсином приведенного ниже пептида вал–лиз–глу–мет–арг–цис–глу–лиз–фен–вал–арг–иле–про–гли– лиз–сер–гли–тре? 9. Укажите, каким образом действуют карбоксипептидаза и аминопептидаза на пептид ала–вал–гли–сер. К какому подклассу пептидаз они относятся 10. Где локализованы дипептидазы? Какие из них хорошо изучены В чем отличие пролил-дипептидазы и пролиндипептидазы? Напишите уравнения реакций гидролиза при участии этих ферментов. 11. Какие пищевые белки являются наиболее ценными для организма человека Почему 12. Может ли вегетарианская диета привести к отрицательному азотистому балансу 13. Каковы потребности детей школьного возраста в пищевом белке КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ АЗОТИСТОГО ОБМЕНА Аминокислоты после всасывания через стенки кишечника поступают через воротную вену в печень, где они подвергаются ряду превращений. Значительная часть аминокислот разносится кровью по всему организму и используется для физиологических целей. В печени аминокислоты используются не только для синтеза собственных белков и белков плазмы крови, но также для синтеза специфических азотсодержащих соединений пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, креатина, мочевой кислоты и др. Таким образом, всосавшиеся аминокислоты в первую очередь используются в качестве строительного материала для синтеза специфических белков организма и других биологически активных азотсодержащих веществ. Некоторое количество аминокислот подвергается распаду с образованием конечных продуктов белкового обмена. Метаболизм аминокислот белковых молекул включает общие пути обмена катаболизм и анаболизм аминокислот) и индивидуальные пути превращения отдельных аминокислот. Общие пути превращения аминокислот включают реакции дезаминирования, трансаминирования, декарбоксилирования, реакции по радикалу аминокислот. Аминокислоты, как и белки, не накапливаются и не откладываются в тканях наподобие гликогена и жиров. Количество аминокислот, подвергающихся распаду, зависит от характера питания и от физиологического состояния организма. В организме человека распаду подвергается около 70 г аминокислот в сутки, при этом освобождается большое количество аммиака. Аммиак является клеточным ядом, при высоких концентрациях он повреждает главным образом нервные клетки. Концентрация аммиака в организме должна сохраняться на низком уровне и не превышать 60 мкмоль / л в крови. Аммиак должен быстро инактивироваться и выводиться из организма. Одним из путей обезвреживания аммиака является биосинтез глутамина, протекающий в мозге, сетчатке, мышцах, почках, печени. Основным механизмом обезвреживания аммиака в организме человека является биосинтез мочевины, которая выводится с мочой в качестве главного конечного продукта белкового, соответственно, аминокислотного обмена. У разных видов позвоночных инактивация и выведение аммиака производится различными способами. Живущие вводе животные выделяют аммиак непосредственно вводу например, у рыб он выводится через жабры (аммонио телические организмы. Наземные позвоночные, в том числе человек, выделяют лишь небольшое количество аммиака, а основная его часть превращается в мочевину (уреотелические организмы. Птицы и рептилии, напротив, образуют мочевую кислоту, которая в связи с экономией воды выделяется преимущественно в твердом виде (урикотелические организмы. Местом синтеза мочевины является печень, пять биохимических реакций цикла мочевины разделены на два компартмента: митохондрии и цитозоль. Скорость цикла мочевины лимитируется первой реакцией, образованием кар- бомоилфосфата при участии аммиака и АТФ. Биосинтез мочевины требует больших затрат энергии, необходимая энергия поставляется за счет расщепления макроэргических связей АТФ. Под общим азотом мочи понимают сумму всех азотсодержащих соединений мочи азот мочевины, креатина, мочевой кислоты, аммонийных солей и др. Количество общего азота, выделяемого за сутки с мочой, у взрослого человека составляет 6–17 г, из него 80–90 % составляет азот мочевины. Работа 12. Определение общего азота мочи колориметрическим методом Для определения общего азота мочи сначала проводят сжигание органических веществ мочи сконцентрированной серной кислотой. После сжигания минерализации) органических веществ мочи концентрированной серной кислотой азот в виде аммиака всех исследуемых фракций связывается с серной кислотой, образуя сульфат аммония. Колориметрическое определение общего азота основано на том, что аммиак сульфата аммония образует с реактивом Несслера желто-оранжевое окрашивание при pH 12,0: 2K 2 HgI 4 + КОН + NH 3 → Hg 2 ONH 2 I + 7KI + Н Реактив Несслера Йодит меркураммония Интенсивность окрашивания раствора прямо пропорциональна концентрации аммиака, а следовательно, и азота в моче. 48 Реактивы и оборудование Серная кислота (конц гидроксид натрия (50 %); стандартный раствор сульфата аммония химически чистый сульфат аммония (массой 0,943 г) растворяют в 1 л воды (1 мл раствора содержит 0,2 мг азота реактив Heсслepa: 10 г йодида калия растворяют в 15 мл воды, добавляют 15 г йодида ртути (II), тщательно перемешивают и приливают 80 мл 50 % раствора щелочи (не содержащей карбонатов. Перемешивают и общий объем доводят охлажденной прокипяченной дистиллированной водой до 500 мл. Оставляют на сутки, после чего фильтруют через стеклянную вату. Раствор должен быть прозрачным (хранить в темной склянке с притертой пробкой моча перекись водорода лакмусовая бумага. Колбы Кьельдаля, пробирки, штативы для пробирок, пипетки на 1 и 10 мл, мерные цилиндры на 20 мл, электроплитки, песчаные бани, фотоэлектро колориметр. Ход работы 1. Сжигание.В колбу Кьельдаля помещают мл мочи, разведенной враз, добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты. Одновременно готовят контрольную пробу, заменив мочу на дистиллированную воду. Обе колбы ставят в вытяжном шкафу в наклонном положении на песчаную баню. Содержимое колб нагревают в течение 40–60 минут, охлаждают, приливают по 1–2 капли пероксида водорода и сжигают до обесцвечивания реакционной смеси. Минерализат сливают после охлаждения в мерный цилиндр, споласкивая колбу два раза по 3 мл дистиллированной водой, затем доводят дистиллированной водой в цилиндре до объема 10 мл. Получают минерализованную мочу, разведенную враз. Фотоколориметрирование. В мерный цилиндр помещают 1 мл минерализованной мочи, приливают 10 мл дистиллированной воды, перемешивают и, используя лакмусовую бумагу, прибавляют по каплям 40 % раствор гидроксида натрия до тех пор, пока лакмус не станет приобретать синеватый оттенок. Затем добавляют дистиллированную воду до 14 мл (в мерном цилиндре) и приливают 1 мл реактива Несслера. Необходимо строго соблюдать порядок прили-вания, тщательно перемешивая жидкость стеклянной палочкой. Одновременно таким же образом готовят контрольную пробу. Появляется желто-оранжевое окрашивание, после чего сразу проводят ко- лориметрирование при синем светофильтре. 3. Построение калибровочной кривой. Пока идет сжигание, необходимо приготовить серию стандартных рабочих растворов сульфата аммония с содержанием 0,01; 0,02; 0,05; 0,10; 0,16; 0,20 мг азота в 1 мл. К 1 мл каждого стандартного раствора в мерном цилиндре приливают 13 мл дистиллированной воды и по 1 мл реактива Несслера при помешивании и фото- метрируют. Находят показания оптической плотности при синем светофильтре 49 для каждого стандартного раствора. Затем приступают к построению графика, откладывая на оси ординат оптическую плотность, а на оси абсцисс — концентрацию азота. Через полученные точки проводят прямую линию, которая изображает зависимость оптической плотности от концентрации азота. 4. Расчет. Найдя разницу между значениями оптической плотности в опытной и контрольной пробах и, откладывая ее на калибровочной кривой, определяют содержание азота в 1 мл исследуемой мочи Содержание общего азота в суточной моче, г / сут. = = |