Ганеева Л. А., Зайнуллин ли, Абрамова З. И
 Скачать 5.05 Mb.
|
|
Б Рибозуобнаруживают по реакции с орцином или флороглюцином. При нагревании с 20 % соляной кислотой рибоза дегидратируется и превращается в фурфурол 103 Фурфурол конденсируется с орцином или флороглюцином с образованием соединений зеленого (с орцином) и розово-красного (с флороглюцином) цвета. Дезоксирибоза не дает этой реакции. К 1 мл реактива орцина (или флороглюцина) добавляют половинный объем гидролизата, 1 мл концентрированной соляной кислоты и нагревают до кипения. Наблюдают появление соответствующего окрашивания. В Пентозу(рибозу и дезоксирибозу)обнаруживают с помощью реактива Фелинга: к 0,5 мл гидролизата добавляют 1 мл 10 % раствора щелочи, 0,5 мл реактива Фелинга, перемешивают, нагревают до кипения. Наблюдают появление осадка красного цвета. Г Пуриновые основанияобнаруживают по их реакции с аммиачным раствором нитрата серебра К 2 мл гидролизата приливают по каплям концентрированный растворам миака до щелочной реакции по лакмусу (приблизительно 10 капель) и затем добавляют равный объем 2 % аммиачного раствора нитрата серебра. Через 3– 5 минут образуется светло-коричневый осадок серебряных солей пуриновых оснований, содержимое пробирки перемешивать не следует. Д Фосфорную кислотуобнаруживают с помощью молибдата аммония или магнезиальной смеси. Молибденовая проба на фосфорную кислоту Н + 12(NH 4 ) 2 МоO 4 + О → (NH 4 ) 3 PO 4 • 12МоО 3 ↓ + 21NH 4 NO 3 + 12H 2 O К 2 мл раствора молибдата аммония в азотной кислоте прибавляют 1 мл гидролизата. Смесь слегка нагревают. Образуется желто-зеленый осадок фосфоромолибдата аммония. 104 Вопросы и задания для самопроверки 1. Какие вещества являются мономерами нуклеиновых кислот При помощи каких химических связей они соединены в полинуклеотидные цепи 2. Чем отличаются нуклеозиды от нуклеотидов Напишите структурные формулы нижеперечисленных соединений, укажите, какие из них относятся к нуклеозидам, к нуклеотидам дезоксицитидин, 5 1 ‑ фосфатаденозин, тими-дин, 3 1 ‑ фосфатуридин. 3. Какие постоянные и минорные азотистые основания встречаются в ДНК Напишите структурные формулы их в кетоформе. 4. В чем состоит принцип комплементарности в строении нуклеиновых кислот В чем суть правил Чаргаффа? 5. Какие взаимодействия обеспечивают удержание взаимозакрученных дезоксирибонуклеотидных цепей в составе биспиральной молекулы ДНК 6. Какие волокнисто-кристаллические структуры ДНК выявлены в настоящее время 7. Каковы основные параметры (шаг, число пар нуклеотидных остатков на виток, расстояние между нуклеотидными остатками по высоте, диаметр) двойной спирали ДНК, находящейся в В-форме? 8. Каковы различия в химическом составе молекул ДНК и РНК 9. Каковы функции ДНК и РНК в клетке 10. Какова классификация РНК Дайте краткую характеристику наиболее важным РНК. 11. Напишите структурные формулы нижеперечисленных соединений а) нуклеотидов фУ, фдГ, дЦф, Аф, дайте им полные названия б) фрагмента ДНК фдЦфдТфдАфдГ, комплементарный ему фрагмент, покажите образование между ними водородных связей в) фрагмент антикодоновой ветви тРНК вал из дрожжей фУфИфАфЦфАфЦ. 12. В-форма кристаллической ДНК устойчива в условиях 97 % относительной влажности. Если влажность изменить до 76 %, то происходит переход В-формы в форму. Вычислите, на какую величину (мкм) изменится длина фрагмента ДНК, молекулярная масса которого равна 1 млн Да, если из В-формы он перейдет в А-форму. 13. Осуществите нижеперечисленные превращения с использованием структурных формул всех компонентов а) (ф) УГА (ОН) + НО →? б) (ф) (дАдГдТдЦ (ОН) + НО →? в) 3 1 ‑ фосфатгуанозин → гуанозин → гуанин г) 5 1 ‑ фосфатдезоксицитидин → дезоксицитидин → цитозин 105 ОБМЕН НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Распад нуклеиновых кислот в организме идет достаточно энергично, но разные виды нуклеиновых кислот распадаются с разной скоростью. Медленно распадаются ядерные ДНК. Существуют долгоживущие РНК (до суток) и короткоживущие РНК (от одного до нескольких часов, скорость распада мРНК оказывает сильное воздействие на скорость белкового синтеза. Распад нуклеиновых кислот идет при посредстве ферментов — нуклеаз, которые ускоряют реакции гидролитического разрыва 3 1 , 5 1 ‑ фосфодиэфирных связей либо по 3 эфирной связи (нуклеазы, либо по 5 связи (нуклеазы. Различают эндонуклеазы, гидролизующие связи внутри молекулы одновременно во многих точках с образованием олигонуклеотидов различной величины, и экзонуклеазы, которые катализируют гидролиз концевых связей, отделяя один нуклеотид за другим от одного из концов нуклеотидной цепи. В зависимости от специфичности к субстрату нуклеазы делят на две группы рибо нуклеазы и дезоксирибонуклеазы Помимо этих ферментов, открыты еще рестриктазы ДНКазного типа действия, катализирующие распад чужеродной ДНК в строго определенных участках молекулы, имеющих палиндромную структуру. В живой клетке нуклеазы осуществляют различные важные функции на многих стадиях биохимических превращений ДНК и РНК, включая рекомбинацию генов. Помимо гидролитических нуклеаз, имеются ферменты, катализирующие распад РНК посредством трансферазной реакции. Они катализируют перенос остатка фосфорной кислоты от 5 углеродного атома рибозы одного мононуклеотида к 2 углеродному атому соседнего мононуклеотида, сопровождающийся разрывом 3 1 , 5 1 ‑ фосфодиэфирной связи и образованием 2 1 , 3 1 ‑ фосфодиэфирной связи водном мононуклеотиде. Мононуклеотиды, представляющие собой конечные продукты ферментативного распада нуклеиновых кислот, принадлежат к наиболее сложным метаболитам. Первая ступень распада мононуклеотидов состоит в отщеплении остатка фосфорной кислоты и образовании нуклеозида, который в свою очередь может распадаться до азотистого основания и пентозы или пентоза-1‑фосфата. Дальнейший распад азотистых оснований происходит в результате дезаминирования и окислительно-восстановительных процессов. Распад пуринов и пиримидинов протекает различными путями. Пурины аденин, гуанин) в результате реакций окисления превращаются в мочевую кислоту (конечный продукту человека, птиц, приматов, у большинства животных и растений мочевая кислота превращается в аллонтоин. У костистых рыб — в аллонтоиновую кислоту, у амфибий, большинства растений — в мочевину и глиоксиловую кислоту. 106 Пиримидины (урацил, цитозин, тимин) в процессе распада вначале восстанавливаются, затем происходит гидролитическое расщепление их циклической структуры с образованием углекислого газа, аммиака, аминокислот. Деструкцию нуклеиновых кислот изучают выявлением активности нуклеаз. Чаще всего пользуются измерением экстинции при 260 нм дои после ферментативного гидролиза ДНК и РНК. Активность нуклеаз измеряют также по изменению вязкости раствора ДНК в процессе гидролиза и по величине гиперхромного эффекта. Кроме того, пользуются методами измерения содержания фосфата, пентоза также конечных продуктов распада пуриновых и пиримидиновых оснований. Схема распада нуклеиновых кислот 107 Работа 22. Определение активности рибонуклеазы спектрофотометрическим методом Под действием рибонуклеазы происходит расщепление молекулы РНК до олиго- и мононуклеотидов, количественное определение которых проводят спектрофотометрически при 260 нм (максимум поглощения нуклеотидов. Реактивы и оборудование Раствор очищенной дрожжевой РНК (1 мг / мл) в 0,1 М растворе ацетата натрия 5 г РНК растворяют в 50 мл 0,1 M ацетатного буфера (pH 5,2) и диа-лизуют в течение ночи на холоде против этого буфера. Затем РНК осаждают двойным объемом 96 % этанола, центрифугированием при 1 800 оборотах в течение 45 минут отделяют осадок. Полученный осадок РНК промывают 96 % этанолом и эфиром, затем высушивают в вакуумном эксикаторе 0,2 % водный раствор панкреатической РНК-азы; спиртово- магниевый осадитель (80 % этанол, содержащий 0,02 М MgCl 2 в 1 л. Реактивы готовить непосредственно перед работой. Холодильник, центрифуга, спектрофотометр, термостат, пипетки на 1 мл, пробирки. Ход работы В центрифужные пробирки вносят мл дрожжевой РНКи 0,2 мл водного раствора РНК-азы, перемешивают и ставят в термостат при 37 Сна минут. По истечении времени реакцию останавливают, добавляя к содержимому пробирки мл спиртово-магниевого осадителя и помещают на 1 час в ледяную баню. Затем проводят центрифугирование (8 000 g, 20 минут при охлаждении) для удаления осадка РНК. Из центрифугата отбирают пробы по 0,5 мл, прибавляют к каждой по 3 мл дистиллированной воды, перемешивают и измеряют оптическую плотность полученных растворов на спектрофотометре против дистиллированной воды. Параллельно обрабатывают контрольную пробу, в которую осадитель вносят до прибавления раствора РНК-азы. Прирост поглощения в опытной пробе по отношению к контрольной служит показателем активности РНК-азы и используется для расчета активности фермента по формуле A = ΔE 260 • V 1 • V 2 / (V 3 • t • W), где E 260 — прирост экс- тинции опытной пробы по отношению к контрольной t — время инкубации в мин V 1 — объем пробы после разбавления (мл V 2 — объем пробы после осаждения РНК спиртово-магниевым раствором (мл V 3 — объем пробы, взятой для разбавления (мл W — масса фермента (РНК-азы) в пробе (мг. Вместо раствора панкреатической РНК-азы можно использовать слюну, разбавленную враз мочу, кровь животных, разведенную враз. Работа 23. Определение содержания мочевой кислоты в моче Определение мочевой кислоты основано на ее способности восстанавливать фосфорно-вольфрамовый реактив в фосфорно-вольфрамовую синь. 108 Количество фосфорно-вольфрамовой сини определяют путем титрования гексациано-(III)-ферратом калия. Этим методом мочевую кислоту определяют в образцах, не содержащих белка. Реактивы и оборудование Трихлоруксусная кислота (20 %); карбонат натрия (20 %); гексациано-(III)- феррат калия 1 г соли и 1 г NaOH растворяют в 50 мл воды фосфорно-воль- фрамовый реактив 10 г вольфрамата натрия, 8 мл 85 % фосфорной кислоты и 90 мл воды кипятят в течение 2 часов в колбе с обратным холодильником, после охлаждения доводят объем до 100 мл водой стандартный раствор мочевой кислоты 100 мг чистой, хорошо высушенной мочевой кислоты заливают раствором, содержащим 200 мг гидрофосфата натрия и 400 мг дигидрофосфата натрия. Смесь подогревают до растворения солей и после охлаждения доводят объем водой до 200 мл. Центрифуга, колбы конические на 50 мл, бюретки на 25 мл, пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл. Ход работы 1. Приготовление безбелкового препарата мочи.К5 мл мочи прибавляют равный объем 20 % раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают осадок белков отделяют центрифугированием (3 000 g, 10–15 мин. 2. Качественная реакция на мочевую кислоту. К 5 мл безбелковой мочи приливают 2 мл фосфорно-вольфрамового реактива и 10 мл 20 % раствора карбоната натрия. Смесь тщательно перемешивают. При этом появляется синее окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству мочевой кислоты. 3. Титрование. Полученную окрашенную пробу осторожно, по каплям, титруют раствором гексациано-(III)-ферратом калия до обесцвечивания. 4. Определение количества мочевой кислоты (мг, соответствующей 1 мл гексациано-(III)-феррата калия. Смешивают 0,5 мл стандартного раствора (0,25 мг мочевой кислоты) с 2 мл фосфорно-вольфрамового реактива и 5 мл 20 % раствора карбоната натрия. Образовавшуюся после перемешивания синь титруют раствором гексациано-(III)-феррата калия до обесцвечивания. 1 мл гексациано- (III)-феррата калия соответствует (0,25, деленному на объем пошедшего на титрование гексациано-(III)-феррата калия) количеству (мг) мочевой кислоты. Например, на титрование стандартной пробы (содержащей 0,25 мг мочевой кислоты в 0,5 мл) пошло 3,4 мл гексациано-(III)-феррата калия, следовательно, 1 мл реактива соответствует (0,25 : 3,4) 0,073 мг мочевой кислоты. 5. Расчет. Массовую концентрацию мочевой кислоты (мг) в суточной моче вычисляют по формуле С = m • A • B / V, где m — количество мочевой кислоты, соответствующее 1 мл гексациано-(III)-феррата калия (мг А — количество гексациано-(III)-феррата калия, затраченное на титрование пробы (мл В — суточное количество мочи (1 500); V — объем мочи, взятой для исследования (мл. 109 Вопросы и задания для самопроверки 1. Каковы пути распада нуклеиновых кислот Какие ферменты участвуют в деструкции РНК и ДНК Дайте им краткую характеристику. 2. На какие фрагменты распадается олигорибонуклеотид (ф) АЦЦУГГГУУАА ОН) под действием а) 5 1 ‑ эндорибонуклеазы, б) экзонуклеазы. 3. Какие соединения образуются в результате действия на олигодезоксирибо- нуклеотид (ф) ЦТГААЦАТЦГА (ОН а) ДНК-азы I, б) ДНК-азы II? 4. К какому классу относятся ферменты, участвующие в превращении а) аденина в гипоксантин; б) гуанина в ксантин Напишите уравнения реакций этих превращений. 5. Какие соединения образуются при превращении мочевой кислоты в мочевину у большинства животных и растений Напишите уравнения реакций, укажите ферменты. 6. Каким путем и с помощью каких ферментов осуществляется превращение урацила в аланин, СОН. Осуществите нижеперечисленные превращения с использованием структурных формул всех компонентов назовите ферменты, участвующие в этих превращениях а) 5 1 ‑ фосфатаденозин → аденозин → аденин → гипоксантин → ксантин → мочевая кислота б) тимин → дигидротимин → N-карбамил-β-аминоизомасляная кислота → β-аминоизомасляная кислота в) оротовая кислота → оротидин- 5 фосфат → уридин-5 фосфат. 8. Каковы основные этапы биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов и какие ферменты участвуют в этом процессе 9. Какие соединения используются в качестве исходных при биосинтезе пуриновых оснований 10. В чем состоит роль 5 1 ‑ фосфорибозил-1 пирофосфата в реакциях биосинтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов 11. Каков механизм воспроизведения первичной структуры при биосинтезе нуклеиновых кислот 12. Каковы основные этапы биосинтеза ДНК и к чему сводится роль белковых факторов при репликации Каков механизм ДНК-полимеразной реакции 13. Какие ферменты принимают участие в биосинтезе РНК Дайте характеристику основным этапам транскрипции. 14. В чем состоит отличие пре-мРНК от мРНК? Какие процессы происходят при образовании зрелой мРНК? 15. Какой процесс называют обратной транскрипцией Как называют фермент, ускоряющий обратную транскрипцию 110 ГЛАВА 5. УГЛЕВОДЫ Углеводы входят в состав клеток и тканей всех растительных и животных организмов. По массе углеводы составляют основную часть органического вещества на земле. Углеводы в живой природе имеют большое значение как источники запасной энергии в метаболических процессах крахмал — в растениях гликоген — в животных. Углеводы служат строительным материалом для многих организмов целлюлоза — клеточные стенки растений, мурамин — бактерий, хитин — грибов и т. д. Углеводы являются составными частями важнейших веществ, таких как нуклеиновые кислоты, липиды, белки, выполняющих в организме сложные и важные функции. Углеводы составляют обширную группу соединений, которая делится на моносахариды (простые сахара) и продукты их конденсации олиго-и полисахариды (сложные сахара. Моносахариды — это простейшие углеводы, не подвергающиеся гидролизу. Сложные углеводы способны гидролизоваться. Олигосахаридами называются углеводы, гидролизующиеся с образованием 2–10 молекул моносахаридов. Полисахариды — высокомолекулярные углеводы, при гидролизе которых образуются сотни и тысячи молекул моносахаридов. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА УГЛЕВОДОВ Моносахариды Моносахариды являются полигетерофункциональными соединениями, в молекулах которых одновременно содержатся одна оксогруппа (альдегидная или кетонная) и несколько гидроксильных групп. Моносахариды с химической точки зрения представляют собой полигидроксикарбонильные соединения, те. полигидроксиальдегиды (альдозы) и полигидроксикетоны (кетозы. Моносахариды в зависимости от длины углеродной цепи (3–10) делятся на триозы, тетрозы, пентозы, гексозы, гептозы и т. д. Важнейший природный моносахарид глюкоза является альдозой, содержащей шесть углеродных атомов, пять из которых имеют гидроксильные группы. Четыре углеродных атома (С — С) являются хиральными центрами, кроме глюкозы существует 15 изомерных альдогексоз, лишь немногие из них встречаются в природе. У большинства природных моносахаридов С имеет конфигурацию глицеринового альдегида (конфигурационный стандарт по МА. Розанову). В нейтральном растворе менее 0,1 % молекул глюкозы находятся в ациклической форме. Подавляющая часть глюкозы присутствует в форме циклического полуацеталя, образованного взаимодействием карбонильной группы с одной из гидроксильных групп. В альдогексозах реакция идет главным образом с гидроксильной группой С, с образованием шестичленного пиранозного цикла. Если в реакцию вступает гидроксильная группа Сто образуется пятичленный фуранозный цикл. Пиранозный цикл альдогексоз термодинамически более устойчив. В растворе все формы ациклические, пиранозная и фу- ранозная находятся в динамическом равновесии. В циклической форме возникает дополнительный центр хиральности, так как асимметрическим становится атом углерода, входивший ранее в альдегидную группу. Этот хиральный центр называется аномерным, а соответствующие два стереоизомера — α- и β-аномерами. Циклические моносахариды принято изображать в виде проекционных формул (проекции Хеуорса). Заместители при хиральных атомах углерода располагаются над или под плоскостью кольца в зависимости от их конфигурации. Гидроксильные группы, которые в ациклической форме (проекция Фишера) находятся справа, в циклической форме (проекция Хеуорса) располагаются под плоскостью кольца, а находящиеся слева — над плоскостью кольца. Таутомерные превращения глюкозы 112 В проекции Хеуорса не учитывается тот факт, что в действительности пиранозный цикл неплоский, а имеет форму кресла. Полуацетальная гидроксильная группа у β-аномера D-глюкопиранозы занимает экваториальное, ау α-аномера — аксиальное положение. Таким образом, β-аномер, отличается от α-аномеpa тем, что у него все заместители находятся в более выгодном экваториальном положении (в таутомерной смеси D-глюкопиранозы в количественном отношении преобладает β-аномер). Схема химических превращений глюкозы 113 Конформационное строение D-глюкопиранозы объясняет уникальность этого моносахарида. β-D-Глюкопираноза — единственный моносахарид с полным экваториальным расположением заместителей. Обусловленная этим высокая термодинамическая устойчивость — основная причина широкой распространенности глюкозы в природе. Моносахариды отличаются большой реакционной способностью, могут окисляться и восстанавливаться, полуацетальный гидроксил может замещаться другими в реакциях со спиртами, кислотами, фенолами. Ацилированию и метилированию способны подвергаться и спиртовые группы моносахаридов, однако это требует немного более жестких условий. В разбавленных растворах щелочей при комнатной температуре происходит изомеризация моносахаридов, те. получение из одного моносахарида равновесной смеси моносахаридов, различающихся конфигурацией углеродных атомов Си С. Так, водный раствор глюкозы после добавления к нему известковой воды через 5 суток имеет состав глюкозы (63,5 %), маннозы (2,5 %) и фруктозы (31 %). При нагревании с сильными минеральными кислотами (например, Н) происходит дегидратация моносахаридов (отщепление трех молекул воды. Альдопентозы при этом образуют фурфурол, гексозы — 5‑гидроксиметил- фурфурол, которые способны вступать в реакции конденсации с нафтолом, резорцином, дифениламином и др. с образованием окрашенных продуктов. Цветные реакции на моносахариды используются в количественном анализе, а также в хроматографии. Дисахариды При образовании гликозидной связи между аномерной гидроксильной группой одного моносахарида и ОН-группой другого моносахарида получается дисахарид. Поскольку синтез природных дисахаридов с участием ферментов строго специфичен, гликозидная связь может находиться только водной из возможных конфигураций (α или β). Существуют два типа связывания моносахаридных остатков за счет полуацетальной ОН-группы одного и любой спиртовой ОН-группы другого моносахарида восстанавливающие дисахариды) и за счет полуацетальных ОН-групп общих моносахаридов (не- восстанавливающие дисахариды. В природе в виде самостоятельно существующих дисахаридов встречается ограниченное число, основные из них мальтоза, целлобиоза, лактоза, сахароза. Значительно шире распространены дисахаридные фрагменты, входящие в состав гликозидов растительного и бактериального происхождения. Мальтоза (солодовый сахар) — основной продукт гидролиза крахмала под действием фермента амилазы. 114 В мальтозе остатки двух молекул D-глюкопиранозы связаны α- 1,4‑ гликозид ной связью, которая образуется полуацетальным гидроксилом в α- положении со спиртовым гидроксилом С второй молекулы, а свободный полуаце-тальный гидроксил может иметь как α- (мальтоза, таки- конфигурацию (мальтоза. Целлобиоза, как и мальтоза, состоит из двух D-глюкопиранозных остатков, связанных 1,4‑гликозидной связью, однако она имеет конфигурацию. Лактоза (молочный сахар) — важнейший углеводный компонент молока млекопитающих. В коровьем молоке содержится до 4,5 % лактозы, в женском молоке — до 7,5 %. Лактоза состоит из остатков β-D-галактопиранозы и D-глюкопиранозы, связанных β-1,4‑гликозидной связью, в образовании которой принимают участие аномерный атом галактопиранозы, имеющий конфигурацию, и спиртовой гидроксил С D-глюкопиранозы. Аномерный атом глюкопиранозного фрагмента может иметь как α (лактоза, таки конфигурацию (лактоза. Сахароза состоит из α-D-глюкопиранозы и β-D- фруктофуранозы. В сахарозе обе аномерные ОН-группы связаны гли- козидной связью, и, следовательно, сахароза относится к невосстанавливающим дисахаридам. В растениях сахароза является растворимым резервным сахаром. Дисахариды вступают во многие реакции, характерные для моносахаридов, образуют простые и сложные эфиры, окисляются (восстанавливающие дисахариды, гидролизуются, растворы восстанавливающих дисахаридов мутаротируют. Сахароза (невосстанавливающий дисахарид) не проявляет восстанавливающих свойств и ее растворы не мутаротируют. 115 Полисахариды Полисахариды широко распространены в природе. По функциональным свойствам они подразделяются натри группы. Структурные полисахариды придают клеткам, органами целым организмам механическую прочность. Водорастворимые полисахариды высоко гидратированы и предохраняютот высыхания клетки и ткани. Резервные полисахариды служат энергетическим ресурсом. Благодаря полимерной природе резервные полисахариды осмоти- чески неактивны и поэтому могут накапливаться в клетках в больших количествах. Полисахариды, построенные из моносахаридных звеньев одного типа, называются гомогликанами, а построенные из различных моносахаридных звеньев — гетерогликанами. К группе гомогликанов относятся многие полисахариды растительного (крахмал, целлюлоза, пектиновые вещества, животного (гликоген, хитин, бактериального (декстраны) происхождения. К ге- терогликанам относятся многие животные и бактериальные полисахариды, мурамин, хондроитинсульфаты, гиалуроновая кислота, гепарин и др. Полисахариды могут быть линейными и разветвленными. В качестве примера разветвленного гомогликана можно представить фрагмент молекулы гликогена. Гликоген построен из остатков D-глюкопиранозы, связанных в положении α-1,4. В гликогене точки ветвления располагаются в среднем через каждые 8– 10 остатков глюкозы. Связи в точках ветвления находятся в положении α-1,6. 116 Сложную структуру имеет линейный гетеропептидогликан муреин. В муре-ине чередуются остатки двух различных моносахаридов, связанных в положении N-ацетилглюкозамин и N-ацетилмурановая кислота. Таблица 15. Важнейшие представители полисахаридов Тип Тип связи Полисахарид Моносахарид 1 Моносахарид 2 в точках Источник связи ветвления Мурамин N- ацетил- N- ацетил-мура β-1,4 — Клеточные стенки глюкозамин новая кислота бактерий Декстран α-D-глюко- — α-1,6 α-1,3 Слизи бактерий пираноза Крахмал α-D-глюко- — α-1,4 α-1,6 Хлоропласт листьев пираноза плоды, семена, клубни растений Целлюлоза β-D-глюко- — β-1,4 — Клеточные стенки пираноза растений Агароза D- галактоза 3,6- ангидро β-1,4 β-1,3 Красные водоросли галактоза агар) Инулин D- фруктоза — β-2,1 — Запасающие клетки растений Гликоген D- глюко- — α-1,4 α-1,6 Печень, мышцы пираноза человека, животных Хитин N- ацетил- — β-1,4 — Наружный скелет глюкозамин насекомых, ракообразных, клеточные стенки мицелл грибов Гиалуроновая ацетил- Глюкуроновая β-1,4 — Соединительные кислота глюкозамин кислота β-1,3 ткани человека и животных На конце полисахаридных цепей находится восстанавливающий остаток моносахарида. Поскольку доля концевого остатка относительно всей макромолекулы весьма невелика, то полисахариды проявляют очень слабые восстанавливающие свойства. Гликозидная природа полисахаридов обуславливает их легкий гидролиз в кислой среде и высокую устойчивость в щелочной среде. Полисахаридам присущ характерный для высокомолекулярных веществ более высокий уровень организации макромолекул. Наряду с первичной структурой, те. определенной последовательностью мономерных остатков, важную роль играет вторичная структура, определяемая пространственным расположением макромолекулярной цепи. 117 Работа 24. Качественные реакции на углеводы Восстанавливающие свойства моносахаридов Реакции окисления являются важнейшими в химии углеводов, их используют в биохимических анализах для обнаружения моносахаридов (в частности, глюкозы) в биологических жидкостях (моче, крови. В зависимости от условий окисления моносахаридов образуются различные продукты. В щелочной среде альдозы способны восстанавливать катионы металлов (меди, серебра, висмута, соли при этом окисляются с образованием различных продуктов окисления. Для обнаружения моносахаридов применяют реактивы Толлена, Бенедикта, Фелинга. Принцип действия этих реактивов одинаков и основан на восстановлении двухвалентной меди до одновалентной. Реактивы и оборудование Глюкоза (5 %); гидроксид натрия (5 %); сульфат меди (5 %); нитрат серебра (5 %); водный раствор аммиака (10 %); реактив Фелинга: А. 200 г сегнетовой соли и 150 г гидроксида натрия растворяют в дистиллированной воде и доводят объем дол Б. 40 г перекристаллизованного сульфата меди растворяют в дистиллированной воде и доводят объем дол. Равные объемы растворов Аи Б смешивают перед началом работы. Штативы с пробирками, стеклянные палочки, пипетки градуированные, горелки, термостат. А. Реакция Троммера ООО Ход работы К мл раствора глюкозы приливают1мл5 раствора щелочи и 5 капель 5 % раствора сульфата меди. Содержимое пробирки окрашивается в голубой цвет. Осторожно нагревают содержимое пробирки до кипения. Наблюдают выпадение желтого осадка гидроксида меди (I) или красного осадка оксида меди (I). 118 Б. Реакция Фелинга Ход работы К мл раствора глюкозы приливают равный объем реактива Фелинга и нагревают пробирку до кипения. Наблюдают появление красного осадка. В. Реакция серебряного зеркала по Толленсу ООО Ход работы В пробирку наливают мл раствора нитрата серебра, 1 мл раствора гидроксида натрия и по каплям водный раствор аммиака до растворения образующегося серого осадка. Затем к содержимому пробирки добавляют 3 мл раствора глюкозы, перемешивают и осторожно нагревают в пламени горелки до появления бурого окрашивания. Далее реакция идет без нагревания. Наблюдают выпадение металлического серебра в виде черного осадка или его осаждения на стенках пробирки в виде блестящего зеркального налета. Реакция на основе дегидратации моносахаридов При нагревании с сильными минеральными кислотами (H 2 SO 4 , НС) происходит дегидратация моносахаридов (отщепление трех молекул воды. Альдо-пентозы при этом образуют фурфурол 119 Альдо- и кетогексозы при нагревании сдают 5‑ гидроксиметил-фурфурол: Фурфурол и 5‑гидроксиметилфурфурол способны вступать в реакции конденсации с фенолами (нафтолом, резорцином, флороглюцином) и ароматическими аминами (анилином, дифениламином) с образованием окрашенных продуктов, например, фурфурол с анилином дает красное окрашивание, 5‑ги-дроксиметилфурфурол — красное окрашивание с резорцином. Некоторые из этих химических реакций используют в количественном анализе, а также в хроматографии. Реактивы и оборудование Глюкоза (1 %); рибоза (0,1 %); спиртовой раствор нафтола (1 %); серная кислота (конц фруктоза (1 %); реактив Селиванова: 0,05 г резорцина растворяют в 100 мл разбавленной (1:1) соляной кислоты соляная кислота конц кристаллический орцин. Штатив с пробирками, стеклянные палочки, термостат, градуированные пипетки, часы. А. Реакция Подобедова — Молиша Реакция с нафтолом является чувствительной и широко используется для обнаружения моносахаридов. Продукты дегидратации пентоз и гексоз фурфурол и 5‑ гидроксиметилфур-фурол), соединяясь смоль нафтола образуют продукты конденсации красного и красно-фиолетового цвета. 120 Ход работы Берут две пробирки:в одну приливают мл раствора рибозы, в другую — 5 мл 1 % раствора глюкозы ив обе пробирки добавляют по 2 мл 1 % спиртового раствора нафтола и осторожно по стенке каждой пробирки приливают по 3 мл концентрированной серной кислоты, которая опускается на дно пробирок. На дне или на границе раздела жидкостей образуются красно-фиолетовые кольца. Б. Реакция Селиванова Продукт конденсации кетоз — оксиметилфурфурол — дает с резорцином соединение, окрашенное в вишнево-красный цвет Альдозы также дают эту реакцию, но она у них протекает значительно медленнее, что обуславливает специфичность реакции Селиванова на кетогексозы. Ход работы В две пробирки наливают по мл реактива Селиванова,за- тем в одну прибавляют 2 капли 1 % раствора фруктозы, в другую — 2 капли 1 % раствора глюкозы. Обе пробирки помещают в термостат при 80 Си оставляют на 8 минут. За это время в пробирке с фруктозой появляется вишнево-красное окрашивание. В. Реакция Биаля Фурфурол (продукт дегидратации пентоз, конденсируя с орцином в присутствии следов хлорида железа (III), дает продукт зеленого цвета. 121 Ход работы В пробирку приливают мл раствора рибозы, 2 мл концентрированной соляной кислоты, затем помещают несколько кристаллов орцина и тщательно перемешивают. Помещают пробирку в термостат при 100 Си выдерживают 6 минут. По истечении времени наблюдают образование зеленого окрашивания. Реакции на дисахариды Восстанавливающие дисахариды, имеющие свободный гликозидный гидроксил, способны окисляться до соответствующих кислот, участвуя в реакциях, характерных для альдоз. Невосстанавливающие дисахариды, не имеющие свободного гликозидного гидроксила, в такие реакции не вступают. Наиболее широко для обнаружения невосстанавливающих дисахаридов используют методы, в основе которых лежит гидролиз дисахаридов с последующим обнаружением продуктов гидролиза. Реактивы и оборудование Мальтоза (5 %), лактоза (5 %), сахароза (5 %), соляная кислота (конц. и 25 %), гидроксид натрия (5 %), кристаллический резорцин, кристаллический бикарбонат натрия. Штатив с пробирками, пипетки градуированные, капельницы, термометр, термостат, горелки, часы. А. Восстанавливающая способность лактозы и мальтозы Благодаря наличию свободной альдегидной группы в молекуле лактозы (в остатке глюкозы) и мальтозы (у второго остатка глюкозы) эти дисахариды обладают редуцирующими свойствами и способны участвовать в реакциях восстановления Троммера, Фединга, Толленса и т. д. Ход работы В одну пробирку наливают мл раствора лактозы,в другую — 2 мл 5 % раствора глюкозы. В обе пробирки затем приливают по 1 мл раствора гидроксида натрия и по 5 капель раствора сульфата меди. Пробирки осторожно нагревают в пламени горелки и наблюдают образование красного осадка. Б. Гидролиз сахарозы и открытие продуктов гидролиза В молекуле сахарозы связь между остатками глюкозы и фруктозы образуется за счет двух гликозидных гидроксилов. Сахароза не обладает восстанавливающими свойствами. После гидролиза сахарозы образуются моносахариды, которые можно обнаружить, например, реакцией Троммера глюкозу, а реакцией Селиванова — фруктозу. 122 Ход работы В две пробирки наливают по мл раствора сахарозы:в одну из них добавляют 1 мл концентрированной соляной кислоты, вторая пробирка контрольная. Обе пробирки выдерживают в термостате при температуре 100 Св течение 5 минут. После охлаждения гидролизат нейтрализуют сухим бикарбонатом натрия, добавляя его небольшими порциями до тех пор, пока не прекратится выделение углекислого газа. Затем с опытными контрольным растворами проводят реакции Троммера и Селиванова. Отмечают изменение окраски в гидролизатах и отсутствие таковой в контрольных пробах. Реакции на полисахариды Полисахариды отличаются друг от друга химической природой повторяющихся моносахаридных единиц, степенью разветвления и длиной цепи. Полисахариды содержат редуцирующий гликозидный гидроксид на конце цепи и поскольку доля его относительно всей микромолекулы весьма невелика, то полисахариды не проявляют восстановительных свойств. Реактивы и оборудование Крахмал (0,1 % и 1 %); гликоген (0,1 %); гидроксид натрия (10 %); реактив Люголя: 1 г йода и 2 г йодида калия растворяют в 15 мл дистиллированной воды и затем доводят водой объем до 300 мл соляная кислота (конц вата источник клетчатки серная кислота (80 % и 3 %); реактив Фелинга; гидроксид натрия (5 %); сульфат меди (5 %); кристаллический гидрокарбонат натрия. Штативы с пробирками, стеклянные палочки, градуированные пипетки, капельницы, термостат. А. Реакция крахмала и гликогена с йодом При взаимодействии крахмала и гликогена с йодом образуются комплексные адсорбционные соединения, окрашенные в реакции с крахмалом в синий цвета с гликогеном — в красно-бурый. Различие в цвете комплексов обусловлено химической структурой крахмала и гликогена. При нагревании окраска исчезает, но появляется опять при охлаждении, что свидетельствует об образовании нестойких комплексов крахмала и гликогена с йодом. Обесцвечивание происходит также при добавлении гидроксида натрия или калия. Исчезновение окраски при нагревании и добавлении щелочей обусловлено тем, что в образовании комплексов принимает участие молекулярный йода не йодид-ионы. 123 Ход работы В одну пробирку помещают мл раствора крахмала, в другую — 2 мл 0,1 % раствора гликогена. Затем в обе пробирки вносят по 1–2 капли реактива Люголя. Содержимое пробирок перемешивают и наблюдают появление окрашивания. Затем из каждой пробирки отливают по 1 мл в две другие пробирки. Одну пару пробирок помещают в термостат при 100 С, а в другую пару добавляют по 1 мл 10 % раствора гидроксида натрия. Наблюдают исчезновение окраски. Пробирки из термостата охлаждают, наблюдают вновь появление окраски. Б. Гидролиз крахмала и обнаружение продуктов гидролиза При нагревании крахмала с минеральными кислотами происходит полный гидролиз с образованием глюкозы, которую можно обнаружить качественными реакциями. Ход работы В две пробирки помещают по мл раствора крахмала:в одну из них добавляют 1 мл концентрированной соляной кислоты, вторая пробирка является контрольной. Помещают пробирки в термостат при 100 Сна минут, затем в обеих пробирках проводят реакцию Троммера или Фелинга. Наблюдают изменение окраски в пробирке с гидролизатом и отсутствие таковой в контрольной пробе. В. Гидролиз целлюлозы и обнаружение продуктов гидролиза Целлюлоза не расщепляется ферментами желудочно-кишечного тракта человека. Гидролиз целлюлозы минеральными кислотами происходит значительно медленнее, чем крахмала, и требует предварительной обработки целлюлозы 80 % раствором серной кислоты. Ход работы Небольшое количество ваты мг)помещают в пробирку, заливают 3 % раствором серной кислоты и кипятят 10–15 минут. В другой пробирке такое же количество ваты обрабатывают небольшим количеством 80 % раствора серной кислоты (около 0,5 мл) до полного растворения ваты, затем добавляют дистиллированную воду (примерно 0,5–1 мл) и кипятят 5 минут. После охлаждения содержимое пробирок нейтрализуют бикарбонатом натрия и проводят реакцию Фелинга. Положительная реакция Фелинга свидетельствует о том, что произошел гидролиз целлюлозы и образовался восстанавливающий продукт — β, D-глюкопираноза. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ Для количественного определения моносахаридов в крови используются редуктометрические, фотоколориметрические, энзиматические методы. Редуктометрические методы основаны на восстановительных свойствах моносахаридов. Недостаток этих методов состоит в том, что они неспецифичны, так как присутствующие в крови редуцирующие вещества, не являющиеся углеводами, также обладают восстанавливающими свойствами, и полученные результаты включают всю сумму восстанавливающих соединений в крови. Фотоколориметрические методы основаны на определении степени интенсивности окраски соединений, образующихся при взаимодействии моносахаридов с определенными веществами. Метод специфичен и точен. Энзиматические методы основаны на доставке фермента глюкозооксидазы, окисляющей глюкозу до глюконовой кислоты кислородом воздуха. Этот метод специфичен и широко применяется в клинико-диагностических лабораториях. Работа 25. Определение содержания фруктозы в сыворотке крови фотоколориметрическим методом Определение фруктозы основано на превращении фруктозы в 5‑гидрокси- метилфурфурол (см. работу 24), образующий с резорцином окрашенный продукт. Хотя реакцию Селиванова дают также и альдогексозы (например, глюкоза, скорость образования оксиметилфурфурола из фруктозы во много раз больше, что и обуславливает специфичность этой реакции для фруктозы. Содержимое фруктозы вычисляют на основе измерения оптической плотности окрашенных растворов продуктов конденсации оксиметилфурфурола и резорцина при 490–510 нм на фотоэлектроколориметре. В крови взрослого человека содержится 0,1–0,5 мг / мл (5,55–27,75 мкмоль / л) фруктозы. Реактивы и оборудование Сыворотка крови резорцин (0,1 % в 95 % этаноле соляная кислота (10 н стандартный раствор фруктозы 0,25 г фруктозы, взятые с точностью 10 –4 г, растворяют в 100 мл воды в мерной колбе хлорная кислота 0,1 н. Фотоэлек троколориметр, центрифуга, пробирки, воздушные обратные холодильники, колбы мерные на 100 мл, пипетки на 2, 5, 10 мл, микропипетки, термостат. Ход работы В центрифужную пробирку вносят мл сыворотки крови, затем 2,5 млн. раствора хлорной кислоты (НС, перемешивают, выдерживают минут, после чего центрифугируют 5 минут при 5 000 об. / мин. 125 Берут три пробирки в первую пробирку вносят 1 мл центрифугата; во вторую пробирку — 1 мл смеси, состоящей из 0,1 мл стандартного раствора фруктозы и 2,5 млн. раствора хлорной кислоты в третью пробирку контроль) — 1 мл смеси, состоящей из 0,1 мл дистиллированной воды и 2,5 млн. раствора хлорной кислоты. Вовсе пробирки приливают по 1 мл 0,1 % спиртового раствора резорцина и 3 млн. раствора соляной кислоты, закрывают пробками с воздушным холодильником и ставят в термостат при 80 С. Через 8 минут быстро охлаждают водопроводной водой. Выдерживают при комнатной температуре 5 минут, затем измеряют оптическую плотность содержимого пробирок № 1 и 2 против контроля (пробирка № 3) при 490–510 нм в кювете шириной 1 см (или 0,5 см. Содержание фруктозы в сыворотке крови расчитывают по формуле СЕ а / Е, где Е — оптическая плотность сыворотки крови, Е — оптическая плотность стандартного раствора фруктозы, а — количество фруктозы в пробе стандартного раствора (в мкг. Работа 26. Определение глюкозы энзиматическим методом Метод основан на каталитическом действии глюкозооксидазы, ускоряющей окисление глюкозы кислородом воздуха до глюконовой кислоты С 6 Н 12 O 6 + ОНО глюкозооксидаза С 6 Н 12 O 7 + Н Образующийся в эквимолярном количестве пероксид водорода под действием пероксидазы разлагается, а выделившийся атомарный кислород окисляет добавленный к реакционной смеси хромогенный кислородный акцептор (о- толидин). Количественное определение глюкозы сводится к измерению оптической плотности образовавшегося в опыте, окрашенного в синий цвет соединения. Этот метод предназначен для специфического определения содержания глюкозы в биологических жидкостях после удаления белков в присутствии других сахаров и редуцирующих веществ неуглеводной природы. Реактивы и оборудование Сульфат цинка (5 %); гидроксид натрия (0,3 н хлорид натрия (0,9 %); о- толидин (1 %, перекристаллизованный в абсолютном этаноле ацетатный буфер (0,25 н, pH 4,8): 4 части уксусной кислоты (0,25 н) смешивают с 6 частями ацетата натрия (0,25 н стандартный раствор глюкозы (50, 100, 200 мкг / мл, приготовленный на насыщенном водном растворе бензойной кислоты рабочий реактив к 70–80 млн. ацетатного буфера (pH 4,8) добавляют 2 мг препарата глюкозооксидазы и 1 мг сухой криcmaллuческой пероксидазы. Смесь перемешивают, приливают 1 мл 1 % раствора о-толидина и доводят объем до 100 мл ацетатным буфером. Реактив готовят за 1–2 часа 126 до употребления. Рабочий реактив можно хранить в темной склянке с притертой пробкой в холодильнике в течение 1,5–2 месяцев. Фотоэлектроколо- риметр, центрифуга, секундомер, пипетки, градуированные на 1 и 5 мл, пробирки химические и центрифужные. Ход работы Осаждают белок из анализируемой биологической жидкости (кровь, сыворотка крови, гемолимфа). С этой целью в центрифужной пробирке смешивают 0,4 мл 5 % раствора сульфата цинка, 0,4 млн. раствора гидроксида натрия и 1,1 мл 0,9 % раствора хлорида натрия, затем добавляют 0,1 мл исследуемой биологической жидкости. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и центрифугируют при 5 000 об. / мин. в течение 10–15 минут. Из центрифужной пробирки переносят в химическую пробирку 1 мл на- досадочной жидкости и приливают 3 мл рабочего реактива для определения глюкозы. Одновременно в три пробирки приливают по 1 мл стандартного раствора глюкозы соответственно 50, 100, 200 мкг / мл ив две пробирки контрольные по 1 мл воды. Затем вовсе пробирки с интервалом в 2 минуты приливают по 3 мл рабочего реактива. Эту последовательность следует соблюдать (интервал 2 минуты) и при измерении оптической плотности растворов. Через 10 минут после добавления рабочего реактива измеряют оптическую плотность исследуемого и стандартных растворов против контроля на фото электроколориметре при красном светофильтре (620 нм. На основании полученных величин оптической плотности для всех стандартных растворов глюкозы строят стандартную кривую, по которой рассчитывают количество глюкозы в исследуемой биологической жидкости. Вопросы и задания для самопроверки 1. На чем основана классификация углеводов 2. Докажите некорректность термина углеводы, приведите примеры. 3. Напишите в ациклической и циклической форме моносахариды рибозу, глюкозу, маннозу, галактозу, фруктозу. 4. Напишите проекционные формы по Хеуорсу для α- и β-аномерных форм глюкозы, фруктозы, галактозы. В чем состоит основное различие между этими формами 5. С помощью каких реакций можно доказать наличие в молекуле глюкозы альдегидной группы и пяти гидроксильных групп 6. С помощью каких реакций можно осуществить следующие превращения а) сахароза → глюкоза → глюконовая кислота б) СОСН СНОСНО С 2 Н 5 ОН. 7. На чем основаны качественные реакции на углеводы Каково их практическое значение 8. На чем основаны методы количественного определения углеводов Какие методы количественного определения углеводов наиболее достоверны 127 9. Напишите уравнения реакций, с помощью которых можно различить глюкозу и фруктозу. 10. Какие моносахариды можно открыть реакцией Селиванова? Напишите уравнения реакций. 11. Какое явление называют реакцией серебряного зеркала Напишите уравнение реакции. 12. Напишите уравнения реакций дегидратации рибозы и фруктозы в присутствии концентрированной соляной кислоты. 13. В каких условиях протекает гидролиз ди- и полисахаридов Напишите уравнения реакций гидролиза мальтозы и целлюлозы. 14. Почему дисахарид сахароза не может существовать в двух аномер-ных формах, тогда как дисахарид мальтоза может существовать в двух α- и β- аномерных формах. Изобразите проекционные формы Хеуорса для аномерных форм лактозы и сахарозы. 15. Какими особенностями строения обусловлены различия в свойствах гликогена и целлюлозы Изобразите схемы строения молекул гликогена и целлюлозы. Каковы биологические функции гликогена и целлюлозы ОБМЕН УГЛЕВОДОВ Гликолиз — катаболический путь обмена углеводов в цитоплазме, протекает почти во всех организмах и клетках независимо оттого, живут они в аэробных или анаэробных условиях. В аэробных условиях молекулы глюкозы деградируют до двух молекул пирувата. В анаэробных условиях пируват претерпевает дальнейшие превращения, при этом образуются продукты брожения, такие как лактат или этанол (анаэробный гликолиз. Сахара подвергаются метаболическим превращениям преимущественно в виде сложных эфиров фосфорной кислоты. Глюкоза в АТФ-зависимой реакции, катализируемой гексокиназой, превращается в глюкозо -6‑ фосфат. После изомеризации глюкозо-6‑фосфата во фруктозу -6‑ фосфат вновь происходит фосфорилирование с образованием фруктозо -1,6‑ дифосфата.Фосфофруктокиназа,катализирующая эту стадию, является важным ключевым ферментом гликолиза. Фруктозо -1,6‑ дифосфат расщепляется далее альдозой на два фосфорилированных фрагмента глицеральдегид -3‑ фосфат и дигидроксиацетонфосфат,которые превращаются один в другой триозофосфатизомеразой. Глицеральдегид -3‑ фосфат затем окисляется глицеральдегид-3‑фосфатдегидрогеназой с образованием НАДН • Н. В этой реакции в молекулу включается неорганический фосфат с образованием 1,3‑ дифосфоглицерата. Такое промежуточное соединение содержит смешанную ангидридную связь, расщепление которой является высокоэкзоэргическим процессом. 128 Следующий промежуточный продукт, гидролиз которого может быть сопряжен с синтезом АТФ, образуется в реакции изомеризации 3‑фосфо-глицерата и последующего отщепления воды с образованием фосфоенолпирувата. На последней стадии, катализируемой пируваткиназой, образуется пируват и АТФ. При гликолизе на активацию одной молекулы глюкозы потребляется 2 молекулы АТФ, в тоже время при метаболическом превращении каждого С 3 - фрагмента образуется две молекулы АТФ.В результате выигрыш энергиисоставляет 2 моля АТФ на моль глюкозы. Работа 27. Качественная проба на молочную кислоту Анаэробный гликолиз в тканях животных завершается образованием молочной кислоты, которую можно обнаружить с помощью реактива Уффельма-на: комплексный фенолят железа фиолетового цвета в присутствии молочной кислоты превращается в молочнокислое железо желтовато-зеленого цвета. 3С 6 Н 5 ОН + FeCl 3 → (C 6 H 5 O) 3 Fe + 3HCl Реактивы и оборудование Фенол (1 %), хлорид железа (III) (1 %), молочная кислота (0,5–1 %), мышцы лягушки свежие лед Термостат воронки фильтры марля бумаж - ные ), ступки с пестиком стеклянные лопаточки кварцевый песок штативы с сухими пробирками |