Ганеева Л. А., Зайнуллин ли, Абрамова З. И

• Название: Ганеева Л. А., Зайнуллин ли, Абрамова З. И
• Дата: 13.11.2022
• Размер: 5.05 Mb.
• Имя файла: Ganeeva_i_dr_Biochemistry.pdf
• Тип: Практикум; #785165
• страница: 2 из 11

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКА Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набуханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электрическом поле, способность к поглощению УФ-лучей при 280 нм обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот. Белки — высокомолекулярные соединения, молекулярная масса которых колеблется от 6 000 до 1 000 000 Дальтон и выше. Современные методы исследования позволили установить существование в природе глобулярных (шарообразных) и фибриллярных (нитевидных) белков. Благодаря применению методов сканирующей микроскопии и рентгеноструктурного анализа высокого разрешения (0,2–0,3 нм) удалось расшифровать не только полную пространственную структуру, соответственно форму, но и степень асимметричности белковых молекул. Оказалось, что даже глобулярные белки крови (гемоглобин, альбумины, глобулины) являются асимметричными.
Физико-химические свойства белков зависят главным образом от свойств радикалов аминокислот, входящих в его состава также от количества свободных функциональных групп. Белки являются амфотерными электролитами, так как в их молекуле присутствуют как кислые, таки основные группы.
Кислотноосновные­ свойства белков определяются главным образом боковыми радикалами аминокислот, способными к ионизации. Вклад концевых амино-и карбоксильных групп крайне незначителен. Величины рК боковых радикалов аминокислот в составе белков несколько отличаются от таковых в свободных аминокислотах, поскольку степень ионизации групп в белках зависит
26

от природы соседних боковых радикалов, те. от электростатического окружения. Присутствие диссоциирующих группировок в белках обуславливает определенный суммарный заряд молекулы, зависящий от pH среды. Большинство природных белков относится к кислым благодаря значительному содержанию дикарбоновых кислот и поэтому при pH, близких к нейтральным, имеют отрицательный заряд (как и цитоплазма. Для каждого белка существует такое значение активной реакции среды, при котором положительные и отрицательные заряды в молекуле скомпенсированы. Значение pH, при котором белок не несет суммарного заряда и не движется в электрическом поле, называют изоэлектрической точкой (ИЭТ) и обозначают как pI. Величины ИЭТ определяют при кислотно-основном титровании белкового раствора, а также при изоэлектрофокусировании белка. Для большинства глобулярных белков ИЭТ лежат в кислой области (4,5–6,5). Однако есть и исключения, например, пепсин имеет р около 1, лизоцим — р около 11. Поскольку в ИЭТ молекула белка не имеет суммарного заряда и между соседними молекулами отсутствует электростатическое отталкивание, белки легко осаждаются из растворов при pH, равном их pI. Изоэлектрическую точку белка следует отличать от изоионной точки, так как эти величины не всегда совпадают. Изоионной точкой белка называют то значение pH, при котором число протонов, связанных с основными группами, равно числу протонов, отданных диссоциированными кислотными группами в белковой молекуле. Таким образом, изоионной точке соответствует значение pH, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю в условиях полного отсутствия электролитов в растворе. Подавляющее большинство белков — гидрофильные вещества, хорошо растворяющиеся вводных растворах. Растворимость белков определяется природой тех групп, которые оказываются на поверхности молекулы при ее пространственной укладке в нативную конформацию. Большая часть поверхности белковой молекулы образована гидрофильными группами (—СООН, ОН, —CONH
2
, —NH
2
). Растворимость белков вводе возрастает при добавлении небольших концентраций нейтральных солей. Нейтральные соли в малых концентрациях увеличивают степень диссоциации ионизированных групп белка, экранируют заряженные группы белковых молекул и тем самым уменьшают белок-белковое взаимодействие. Высокие концентрации нейтральных солей осаждают (высаливают) белки из водных растворов, наиболее активно это происходит в ИЭТ белка. Растворимость белка также зависит от pH растворителя, его состава, температуры. В растворах белки проявляют коллоидные свойства они медленно диффундируют, не проходят через полупроницаемую мембрану, рассеивают свет, характеризуются высокой вязкостью. Однако следует иметь ввиду что белковые растворы не являются типичными коллоидными растворами, т. к. белки диспергированы до единичных молекул и образуют гомогенный раствор. Растворы белков, как и типичные коллоидные растворы, могут при определенных условиях терять свою текучесть и образовывать гели. Полагают, что в ряде растительных и животных тканей белки находятся в виде гелей (в протоплазме клеток, хрусталике глаза, соединительных тканях и др. При подготовке растений к зиме происходит переход части белков из растворенного состояния в гелеобразное. Благодаря гидрофильными гидрофобным группировкам белки могут влиять на растворимость других веществ, выступая в роли эмульгаторов. Вор- ганизме человека в эмульгированном состоянии находятся жиры в крови и лимфе. Белок образует на поверхности капелек жира тонкую пленку, которая притягивает воду и препятствует слипанию жировых частичек. Характерным свойством белков является их способность к денатурации. Под денатурацией белка понимают любые вызванные физическими и химическими воздействиями изменения, которые при сохранении первичной структуры сопровождаются большей или меньшей потерей его биологической активности и других индивидуальных свойств белков. Таким образом под денатурацией следует понимать нарушение уникальной структуры нативной молекулы белка,
вызванной ослаблением гидрофобных взаимодействий,раз-рывом водородных связей, а в присутствии восстановителей и разрушением дисульфидных связей. Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых растворов, увеличению количества свободных функциональных групп и изменению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря его биологической активности каталитической, гормональной, защитной и других. Физически денатурация может быть вызвана механическими (сильное перемешивание, встряхивание) или физическими воздействиями (нагревание, ультрафиолетовое, рентгеновское, радиоактивное облучение, обработка ультразвуком и абсорбция на границе раздела. Химическая денатурация достигается прежде всего с помощью соединений, разрывающих водородные связи (6–8 М раствор мочевины, 4 М раствор гидрохлорида гуанидина, обработкой кислотами и щелочами (3 < рН < 9), а также воздействием поверхностно-активных веществ, например 1 % раствором додецилсульфата натрия. Чувствительность отдельных белков к денатурирующим средствам различна. Денатурация с разрывом нековалентных связей обычно обратима. Путем образования новых связей, а также благодаря взаимодействию с денатурирующим веществом новая конформация стабилизируется. Возникающее метастабильное состояние при восстановлении физиологических условий может вернуться к нативной конформации, те. происходит ренатурация. Способность
28

к ренатурации экспериментально была доказана для трипсина, панкреатической рибонуклеазы и др. Реактивы и оборудование Сульфат аммония (кристаллический и насыщенный раствор уксусная кислота (1 % и 10 %); гидроксид натрия (10 %); концентрированные кислоты азотная, серная, соляная, уксусная трихлоруксусная кислота (5 %); сульфоса-
лициловая кислота (20 %); сульфат меди (1 %); ацетат свинца (1 %); нитрат серебра (1 %); пикриновая кислота (насыщенный раствор таннин (10 %); соляная кислота (5 %); 0,2 М уксусная кислота 0,2 М ацетат натрия этиловый спирт ацетон гексацианоферрат (III) калия (5 %); казеин (1 %); яичный белок
(1 %); солевая вытяжка белка 10 г измельченной мышечной ткани настаивают при помешивании в ступке в течение 10–15 минут с 40–50 мл 10 % раствора хлорида натрия. Образовавшуюся однородную массу фильтруют через двойной слой марли. Первые мутные капли фильтрата сливают на фильтр и повторно фильтруют. Фильтрование идет медленно. Получают около 15–
20 мл прозрачного опалесцирующего розово-красного раствора. В полученной солевой вытяжке белка содержатся глобулины и альбумины. Штатив с набором пробирок, стеклянные воронки, стеклянные палочки, фильтры бумажные, пипетки на 1 и 2 мл, спиртовки, целлофановые мешочки вырезают из целлофана круг диаметром 9–12 см. Складывают его в форме мешочка, вставляют в отверстие стеклянную трубку, длиной 5–6 см и диаметром 0,5–0,8 см, так, чтобы верхний конец трубки выступал из мешочка на 2–3 см, а нижний был погружен внутрь на одну треть мешочка. Мешочек туго завязывают на трубке шнурком. До работы диализный мешочек следует сохранять наполненным водой и погруженным вводу. Перед работой воду выливают и с помощью воронки с оттянутым концом вливают в мешочек солевой раствор белка (не более половины объема мешочка диализатор (или стеклянный стакан на 0,5 л. Работа 4. Диализ солевого раствора белка Метод диализа основан на способности низкомолекулярных веществ диффузно проникать через полупроницаемые мембраны, а макромолекул — не проникать. Белки, являясь высокомолекулярными коллоидными веществами, не диффундируют через полупроницаемые мембраны (например, коллоди-евую или целлофановую пленки. Это свойство белков лежит в основе очистки их от низкомолекулярных примесей. Ход работы Вначале с помощью биуретовой реакции(см.работу1)опре­
деляют, содержит ли исследуемый раствор белок. Целлофановый мешочек наполняют на одну треть объема 1 % раствором исследуемого белка. Мешочек помещают в диализатор, заполненный дистиллированной водой, зажимая у верхнего края двумя стеклянными палочками,
29

которые скреплены резиновыми колечками. Через 48 часов с диализатом (наружная жидкость) и используемой для диализа дистиллированной водой проводят реакцию на обнаружение хлоридов. Готовят две пробирки, в одну из них наливают 1 мл диализата, в другую — 1 мл дистиллированной воды, затем по 1 капле 10 % раствора азотной кислоты и 1 % раствора нитрата серебра. В пробирке, содержащей диализат, выпадает белый осадок, а в пробирке с дистиллированной водой осадка нет. Делают вывод о том, что при диализе солевого раствора белка хлориды проникли в диализат через полупроницаемую мембрану. Для проверки содержания белка в одну пробирку наливают 3 мл диализата, в другую — 3 мл диализируемой жидкости, затем в обе пробирки добавляют по 1 мл 10 % раствора гидроксида натрия и по 1–2 капли 1 % раствора сульфата меди (проводят биуретовую реакцию. По изменению окраски в пробирке с диализируемой­ жидкостью делают вывод о том, что белок не проникает через полупроницаемую мембрану. Работа 5. Определение изоэлектрической точки казеина Определение изоэлектрической точки белков основано на их способности под действием осадителей, вызывающих дегидратацию белков, при значении pH среды, соответствующих их pI, легко осаждаться. В отличие от других белков, казеин осаждается в изоэлектрической точке без дегидратирующих средств. Изоэлектрическая точка казеина соответствует pH 4,7. Ход работы В шести пронумерованных пробирках готовят буферные растворы с разными значениями pH, используя данные таблицы 4. Таблица 4. Соотношение компонентов реакционной смеси (мл) для приготовления буферных систем для определения ИЭТ казеина
№ Состав буферной смеси pH ацетатной Степень помутнения
СН
3
СООН, 0,2 ММ пробирок буферной смеси раствора казеина
1 1,9 0,1 3,4 2
1,8 0,2 3,8 3
1,4 0,6 4,4 4
1,0 1,0 4,7 5
0,6 1,4 5,1 6
0,2 1,8 5,7 Содержимое пробирок взбалтывают ив каждую добавляют по 1,0 мл 1 % раствора казеина. После этого содержимое пробирок снова встряхивают и оставляют на несколько минут, затем по максимальной степени помутнения определяют изоэлектрическую точку казеина.
30

Работа 6. Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания Высаливание — обратимая реакция осаждения белков из растворов с помощью больших концентраций нейтральных солей (NaCl, Na
2
SO
4
, MgSO
4
,
(NH
4
)
2
SO
4
и др. При высаливании происходит дегидратация макромолекул белка и устранение заряда. На процесс высаливания влияет ряд факторов, таких как гидрофильность белка, его относительная молекулярная масса, заряд. Вследствие этого для высаливания различных белков требуется разная концентрация одних и тех же солей. Глобулины осаждаются в полунасыщенном растворе сульфата аммония, а альбумины — в насыщенном растворе сульфата аммония. Ход работы К мл яичного белка приливают равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сульфата аммония, в котором выпадает осадок глобулина. Через 5 минут осадок отфильтровывают. В фильтрате остается другой белок — яичный альбумин. Для высаливания альбумина к фильтрату добавляют кристаллический сульфат аммония до полного насыщения, те. пока новая порция соли остается нерастворенной. Выпавший осадок альбумина отфильтровывают. Работа 7. Осаждение белков Белок, находящийся в растворе, способен при определенных условиях выпадать в осадок. Это его свойство используется для обнаружения белка вис следуемом материале и для выделения его в чистом виде. Методы осаждения можно разделить на обратимые (высаливание нейтральными солями, действие спиртов) и необратимые, которые приводят к разрушению нативной конформации белка, те. денатурации. Осаждение белков при нагревании Выпадение белков в осадок при нагревании характерно почти для всех белков (исключение составляет желатин. Особенно легко и более полно происходит осаждение белка в слабокислой среде, вблизи от ИЭТ. В нейтральной и сильнокислой среде осаждение белков идет значительно хуже, а в щелочной среде вовсе не наблюдается. Тепловая денатурация в начальной стадии ведет к региоселективным изменениям конформации, которые могут быть обратимыми. На последующей стадии неконтролируемая агрегация ведет к образованию неупорядоченного клубка. Ход работы В пять пронумерованных пробирок наливают по мл раствора яичного белка. Первую пробирку нагревают до кипения. Наблюдают образование осадка. Во вторую пробирку добавляют 0,1 мл 1 % раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Выпадает хлопьевидный осадок. Осаждение идет полнее
31

и быстрее, чем в первом случае, вследствие того, что частицы белка теряют заряд, потому что pH раствора приближается к изоэлектрическому состоянию. В третью пробирку добавляют 0,5 мл 10 % раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадок не образуется даже при кипячении, т. к. молекулы белка приобретают положительный заряд, что повышает их устойчивость. В четвертую пробирку добавляют 0,5 мл 10 % раствора уксусной кислоты.
0,5 мл насыщенного раствора хлорида натрия и нагревают. Наблюдают появление осадка. Его образование обусловлено тем, что белок при взаимодействии с ионами хлорида натрия теряет свой заряд. В пятую пробирку добавляют 0,5 мл 10 % раствора гидроксида натрия. При кипячении осадок не образуется, т. кв щелочной среде увеличивается отрицательный заряд белка. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами
Многие белки денатурируют при сильном подкислении (pH 2–3). В этих условиях практически все диссоциирующие группы белка имеют одноименный заряд. Взаимное отталкивание одноименных зарядов вызывает разрыв слабых связей, в результате чего нарушается нативная конформация. Минеральные кислоты вызывают дегидратацию белковых молекула также способны к образованию комплексных солей. Однако необходимо учитывать, что некоторые белки достаточно устойчивы в сильнокислой среде. Например, при pH 2 стабильны гистоны, протамины, лизоцима у пепсина при pH 1,5–2,2 активность максимальна. Ход работы В три сухие пробирки наливают по мл концентрированных азотной, серной, соляной кислот. Затем, наклонив каждую пробирку, осторожно по стенке пробирки прикапывают по 0,5 мл раствора белка. На границе раздела двух жидкостей образуется осадок в виде кольца. Содержимое пробирок перемешивают, в пробирках с соляной и серной кислотами осадки растворяются, в пробирке с азотной кислотой осадок не исчезает. Осаждение белков органическими кислотами Органические кислоты, такие как трихлоруксусная, сульфосалициловая, вызывают дегидратацию и денатурацию белковых молекул. Для этих кислот характерен сложный механизм денатурации, включающий как непосредственное воздействие на водородные связи, таки блокирование полярных группировок. Сульфосалициловая и трихлоруксусная кислоты являются чувствительными и специфическими реактивами на белок, трихлоруксусную кислоту используют для полного осаждения белков из биологических жидкостей, например сыворотки крови.
32

Ход работы В две пробирки наливают по мл раствора белка и добавляютв первую — 0,5 мл 5 % раствора трихлоруксусной кислоты, во вторую — 0,5 мл 20 % раствора сульфосалициловой кислоты. В обоих случаях наблюдают выпадение осадка белка. Осаждение белков алкалоидными реактивами Механизм осаждения белков алкалоидными реактивами (таннином, пикриновой, гексациановой, фосфорно-вольфрамовой, фосфорно-молибденовой кислотами и их солями) обусловлен образованием нерастворимых соединений этих реактивов с аминогруппами белка. В таких соединениях алкалоидные реактивы являются анионами, а белки — катионами. Для придания молекуле белка положительного заряда раствор белка подкисляют. В результате этого положительно заряженные частицы белка легко взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами осадителя. Гистоны, протамины легко осаждаются алкалоидными реактивами без подкисления. Ход работы В три пробирки приливают по мл яичного белка,по0,5 мл раствора уксусной кислоты и по 2–3 капли в первую — 10 % раствора пикриновой кислоты, во вторую — насыщенного раствора таннина, в третью —
1 % раствора гексациано-(III)-феррата калия. Наблюдают выпадение осадка. При добавлении избытка раствора таннина и гексациано-(III)-феррата калия осадки растворяются. Осаждение белков солями тяжелых металлов Соли тяжелых металлов (меди, ртути, цинка, серебра, свинца) осаждают белки в результате образования комплексных соединений. Осадок денатурированного белка в избытке солей некоторых тяжелых металлов ацетата свинца, сульфата меди) растворяется. Это связано стем, что избыток ионов этих металлов, адсорбируясь на поверхности белковых частиц, вызывает перезарядку белкового комплекса, в результате чего он переходит в раствор. Этот процесс называется адсорбционной пептизацией. Способность белка прочно связывать ионы тяжелых металлов в виде нерастворимых вводе осадков используется как противоядие при отравлениях солями ртути, меди, свинца и др. Сразу после отравления следует принимать молоко или яйца, пока еще эти соли находятся в желудке и не успели всосаться. Вслед за этим необходимо вызвать рвоту, чтобы удалить яд из организма. Ход работы В три пробирки наливают по мл яичного белка и добавляютпо
1–2 капли в первую — 1 % раствора сульфата меди, во вторую — 1 % раствора ацетата свинца, в третью — 1 % раствора нитрата серебра. Во всех пробирках образуются осадки, нерастворимые вводе. Затем добавляют в пробирки соответственно по 5–10 капель растворов сульфата меди, ацетата свинца, нитрата серебра. В первых двух пробирках наблюдают растворение осадков. В третьей пробирке в избытке нитрата серебра растворение осадка не происходит.
33

Осаждение белков органическими растворителями Органические растворители осаждают белки из водных растворов вследствие дегидратации белковых молекул. Ход работы В две пробирки наливают по мл раствора яичного белка и добавляют в первую — 1–2 мл этилового спирта, во вторую — ацетона. Растворы в обеих пробирках становятся мутными. Затем в обе пробирки добавляют по 1 мл насыщенного раствора хлорида натрия, через некоторое время наблюдают выпадение осадка белка. Вопросы и задания для самопроверки
1. Какие факторы влияют на растворимость белков и их стабильность в растворе
2. Почему при нагревании в слабокислой или слабощелочной среде белок легко выпадает в осадок
3. На каких свойствах белка основаны реакции осаждения и каково их практическое применение
4. При добавлении к водному раствору белков нейтральных солей в высоких концентрациях белок выпадает в осадок. Как называется это явление Почему добавление солей в высоких концентрациях приводит к понижению растворимости белка
5. Дайте определение изоэлектрической точке белка и изоэлектрическому состоянию его.
6. Какие аминокислоты преобладают в составе белка, если ИЭТ лежит в пределах а) pH 3, б) pH 10? Приведите примеры белков кислого и основного характера.
7. В какой среде (кислая, щелочная, нейтральная) находится ИЭТ следующих пептидов а) глу–сер–фен–три–асп–цис–про–вал, б) мет–
гис–тир–тре– арг–лиз–ала, в) иле–про–лей–мет–вал–фен–мет–тир.
8. Пепсин желудочного сока имеет изоэлектрическуто точку около pH 1. Какие функциональные группы должны присутствовать в пепсине в относительно больших количествах
9. Какие аминокислоты должны присутствовать в гистонах, если изоэлектрическая точка их около pH 10,8?
10. Какие свойства характерны для нативных белков
11. Что такое денатурация белков и какими факторами можно ее вызвать Какие свойства характерны для денатурированных белков
12. Почему глобулярные белки, в которых содержится много остатков цистина, денатурируют при более высоких температурах и длительном нагревании. Приведите примеры таких белков.
13. Что такое ренатурация? В каких условиях проводят ренатурацию?
14. Какой процесс носит название адсорбционной пептизации
15. На чем основан метод диализа С какой целью применяют диализ в белковой химии
34

КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ Из огромного количества природных белков структура и функции расшифрованы для относительно небольшого числа, следовательно, не представляется возможным систематически классифицировать белки по структурно-функцио­ нальным параметрам. В белковой химии используются различные принципы классификации, часто перекрещивающиеся и во многих отношениях несовершенные. Взяв за основу происхождение организма, различают растительные, животные, вирусные, бактериальные белки. По месту локализации белков в органах, тканях, клеточных органеллах различают белки плазмы, мышечные белки, белки молока, яиц, рибосомальные белки, ядерные белки, белки мембран и т. д. Характеризуя белки по химическому составу, их делят на две большие группы простые и сложные. Простые белки (однокомпонентные) построены из аминокислот, сложные белки (двухкомпонентные) состоят из простого белка и небелкового компонента, называемого простетической группой. Простые белки в свою очередь делят на основании некоторых критериев, например растворимости вводе, водно-солевых, спиртовых растворах, наряд подгрупп альбумины, глобулины, проламины; по аминокислотному составу
— протамины (содержат до 80–90 % аргинина, гистоны (содержат не менее
30 % аргинина, лизина, гистидина, проламины (содержат 20–50 % глутаминовой кислоты и 10–15 % пролина. Классификация сложных белков основана на химической природе входящего в их состав небелкового компонента фосфопротеины (содержат фосфорную кислоту, хромопротеины (содержат различные пигменты, нуклеопротеины содержат нуклеиновые кислоты, гликопротеины (содержат углеводы, липо- протеины (содержат липиды, металлопротеины (содержат металлы. Приведенная классификация крайне несовершенна. Тонкие методы анализа белков, интенсивно проводящиеся в последние годы, позволяют обнаружить в составе простых белков незначительные, но стабильные соединения, не являющиеся аминокислотами. Например, яичный альбумин, долгое время считавшийся простым белком, содержит около 2 % маннозы. По форме белковой молекуы выделяют два класса фибриллярные и глобулярные белки. Молекула фибриллярного белка имеет вытянутую форму, обладает волокнистой структурой. Часто молекулы фибриллярных белков имеют очень большой размер, состоят из двух и более полипептидных цепей и образуют структурные элементы соединительной ткани. Фибриллярные белки нерастворимы вводе. Важнейшими представителями фибриллярных белков являются коллагены, кератины, эластины, фиброины и др. Глобулярные белки обладают гораздо более компактной структурой, вследствие высокоупорядоченного способа, которым пептидная цепь сложена, изогнута, скручена. Такие молекулы по форме представляют собой почти правильную сферу либо эллипсоид. Глобулярные белки растворимы вводе. Хорошая растворимость их объясняется локализацией на поверхности глобулы заряженных аминокислотных остатков, которые, окружая себя гидратной оболочкой, обеспечивают хороший контакт с растворителем. Среди глобулярных белков наблюдается гораздо большее разнообразие, они выполняют каталитические, защитные, регуляторные, гормональные, транспортные, дыхательные и другие функции. В последние годы, на основе достижений биохимии и биофизики белков, предприняты попытки классификации белков в соответствии с особенностями их структурной организации. Согласно этой классификации глобулярные белки делят на четыре подкласса α-, β-, α+β-, α / белки. К белкам относятся глобулярные белки, содержащие спиральные конформации в количестве не менее 60 % от полипептидной цепи к белкам относятся содержащие не менее двух (антипараллельных цепей к классу белков относятся содержащие спираль и структуру в пределах одной и той же полипептидной цепи к классу α / белков относятся содержащие многочисленные β- структуры, либо чередующиеся вдоль полипептидной цепи, либо расположенные так, что один или несколько слоев окружены несколькими спиралями каждой. Большинство изученных глобулярных белков относятся к классу α / β, которому по численности немного уступает класс, классы α и
α+β менее распространены. Наиболее общепринятая классификация белков основана на их функциях По этой классификации среди белков выделяют достаточно большое количество классов каталитически активные белки ферменты, белки-гормоны, регуляторные белки, защитные белки, токсичные белки, транспортные белки, сократительные белки, структурные белки, рецепторные белки, запасные белки, дыхательные белки, антистрессовые белки и т. д. Конечно, существующая классификация белков далека от совершенства, нов каждом классе белков удается подметить некоторые черты общности структуры, свойств, функциональной активности включенных в его состав конкретных белков. Это позволяет более глубоко понять соотношение структуры и функции белковых молекул, открывает возможности для обобщения материалов, касающихся взаимодействия белков с другими классами веществ углеводами, нуклеиновыми кислотами, липидами и др. ГЛИКОПРОТЕИНЫ Гликопротеины — сложные белки, в составе которых имеется углеводный компонент. В соответствии с особенностями химического строения гликопротеины могут быть подразделены на истинные гликопротеины и протеогликаны
(глюкозаминопротеогликаны). Основное различие между ними заключается в том, что углеводные группировки истинных гликопротеинов содержат обычно до 15–20 моносахаридных компонентов, не образующих повторяющихся олигосахаридных фрагментов, в то время как у протеогликанов они построены из очень большого числа повторяющихся единиц, в основном имеющих своеобразный дисахаридный характер. Молекулярная масса истинных гликопротеинов варьирует в широких пределах, достигая иногда 1 млн и более. Особенно велика молекулярная масса у гликопротеинов слюны. На долю углеводного компонента в гликопротеинах приходится от 1–3 % (овальбумин) до 80–90 % (групповые вещества крови) массы всей молекулы. В составе углеводных компонентов обнаружено более 10 различных моносахаридов галактоза, манноза, глюкоза,
N- ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, ксилоза, арабиноза и др. Типичным компонентом гликопротеинов является также нейраминовая кислота, чаще встречаемая в форме сиаловых кислот. Связь между углеводным компонентом и белковой частью в разных гликопротеинах осуществляется через одну из трех аминокислот аспарагин, серин, треонин. Молекулярная масса протеогликанов велика и достигает нескольких миллионов за счет большого числа чередующихся дисахаридных звеньев. Растворы этих углеводсодержащих белков обладают высокой вязкостью. Протеогликаны состоят из небольшой белковой части, к которой ковалентно присоединяется значительное число (несколько десятков) гетерополисахаридных цепей, содержащих в своих молекулах остатки аминосахаридов и уроновых кислот гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат, гепарин, гепарансульфат, кератансуль- фат. В протеогликанах, содержащих гиалуроновую кислоту, на долю белковой части приходится 0,4–2 % от всей массы молекулы, в случае хондроитинсуль- фатов — 17–22 %. Связь между углеводными и белковыми компонентами осуществляется в протеогликанах через гликозидную связь ксилозы и серина (у хондроитинсульфатов, гепарина, N-ацетилглюкозамина и треонина (у ке- ратансульфатов).
Углеводсодержащие белки широко распространены в живых организмах, они встречаются у животных, растений и микроорганизмов, где выполняют самые разнообразные функции избирательного взаимодействия, высокоспецифи­ ческого узнавания, транспортные, каталитические, структурно-механические. Помимо перечисленных, гликопротеины выполняют в организме и ряд других функций, например, участвуют в процессах свертывания крови (фибриноген, протромбин, гепарин, защитные (интерфероны, иммуноглобулины, гормональные (гонадотропные, фолликулостимулирующий, тиреоглобулин­) и др. Следует отметить, что углеводные компоненты значительно повышают стабильность молекул, в состав которых они входят, к различного рода физическими химическим воздействиями предохраняют их от действия протеиназ, определяя тем самым биологическую роль гликопротеинов.
37

Работа 8. Определение углеводного компонента в гликопротеинах Реактивы и оборудование Вареный яичный белок, 1 % раствор яичного белка, 0,1 % спиртовой раствор нафтола, 1 % спиртовой раствор тимола, концентрированные кислоты соляная, серная, уксусная. Пробирки, штатив для пробирок, стеклянные палочки, пипетки, фильтровальная бумага. Доказательство наличия углеводного компонента в яичном альбумине Ход работы А В пробирку вносят кусочек вареного яичного белка и млконцентрированной соляной кислоты. Содержимое пробирки осторожно нагревают в пламени горелки, не доводя до кипения. Белок, а затем и вся жидкость приобретают фиолетовое окрашивание. Б В две пробирки наливают по мл раствора белка,затем в однуиз них добавляют 2–3 капли 0,1 % раствора нафтола, в другую — столько же 1 % раствора тимола. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и осторожно по стенке приливают по 0,5 мл концентрированной серной кислоты и дают постоять. На границе раздела двух жидкостей впервой пробирке наблюдают фиолетовое кольцо, во второй — красное. Окрашенные кольца возникают за счет реакции фурфурола с нафтолом и тимолом соответственно. Выделение муцина из слюны и определение его углеводного компонента Ход работы А В пробирку собирают мл слюны и по каплям приливают концентрированную уксусную кислоту (10–20 капель. Выпадает осадок муцина. Осторожно сливают жидкость из пробирки, а сгусток высушивают фильтровальной бумагой. Со сгустком проделывают реакции с нафтолом или тимолом. Б К сгустку муцина приливают3капли0,2 спиртового растворао-нафтола. Дают постоять, затем осторожно по каплям приливают 0,5 мл концентрированной серной кислоты. Появляется розово-фиолетовое окрашивание.