Ганеева Л. А., Зайнуллин ли, Абрамова З. И
 Скачать 5.05 Mb.
|
|
Ход работы 1. Приготовление растительного материала.Взвешивают исследуемый растительный материал 1 г ягод шиповника, или 1 г сосновой хвои, или 1 г капусты, или 5 г картофеля, или 5 г капусты. Мелко измельчают, помещают в ступку и растирают с небольшим количеством кварцевого песка, 2 мл 89 10 % соляной кислоты, 8 мл дистиллированной воды. Затем без потерь содержимое ступки переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят водой до метки. Полученную смесь оставляют на 5–10 минут, постоянно перемешивая. Затем содержимое колбы фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Экстракт, полученный из картофеля, не фильтруют. 2. Титрование. Для титрования отмеряют 2 мл фильтрата, добавляют 10 капель 10 % раствора соляной кислоты и титруют 0,001 н. раствором натриевой соли 2,6‑ дихлорфенолиндофенола до розовой окраски, сохраняющейся в течение полминуты. 3. Расчет. Вычисляют содержимое аскорбиновой кислоты в 100 г исследуемого растительного материала по формуле, приведенной выше. Работа 18. Определение содержания витамина Св моче Определение содержания витамина Св моче дает представление о запасах этого витамина в организме, так как наблюдается соответствие между концентрацией витамина Св крови и количеством этого витамина, выделяемого с мочой. Однако при гиповитаминозе С содержание аскорбиновой кислоты в моче не всегда понижено. Часто оно бывает нормальным, несмотря на большой недостаток этого витамина в тканях и органах. У здоровых людей введение per os 100 мг витамина С быстро приводит к повышению его концентрации в крови и моче. При гиповитаминозе С ткани, испытывающие недостаток в витамине, задерживают принятый витамин Си его концентрация в моче не повышается. Моча здорового человека содержит 20–30 мг витамина С или 113,55–170,33 мкмоль / сут. У детей уровень этого витамина понижается при цинге, а также острых и хронических инфекционных заболеваниях. Реактивы и оборудование Моча соляная кислота (10 %), натриевая соль 2,6‑ дихлорфенолиндофе - нола н Конические колбы на 50–100 мл мерные цилиндры на 10 мл или пипетки на 10 мл микробюретки , капельные пипетки Ход работы В стаканчик или колбочку отмеривают мл мочи и мл дистиллированной воды, перемешивают, подкисляют 20 каплями 10 % раствора соляной кислоты и титруют 0,001 н. раствором 2,6‑дихлорфенолиндофенола до розовой окраски. Расчет содержания аскорбиновой кислоты в моче проводят по формуле X = 0,088 • А • В / Б где X — содержание аскорбиновой кислоты (мг / сут А — результат титрования 0,001 н. раствором 2,6‑дихлорфенолиндо-фенола (мл Б — объем мочи, взятый на титрование (мл В — среднее суточное количество мочи для мужчин — 1 500 мл, для женщин — 1 200 мл. 90 Работа 19. Определение витамина Р в чае — черном и зеленом Рутин способен окисляться перманганатом калия, в качестве индикатора применяется индигокармин, который вступает в реакцию с перманганатом калия, после того как окислится весь рутин. Экспериментально установлено, что 1 млн. раствора перманганата калия окисляет 6,4 мкг рутина. Реактивы и оборудование Чай черный и зеленый, индигокармин, 0,05 н. раствор перманганата калия. Весы разновесы, конические колбы, микробюретки, мерные цилиндры на 50 мл, пипетки на 10 мл, капельные пипетки. Ход работы К мг чая черного и отдельно зеленого приливают мл горячей дистиллированной воды и проводят экстракцию в течение 5 минут. 10 мл экстракта черного и зеленого чая помещают в конические колбы, добавляют по 10 мл дистиллированной воды и 5 капель индигокармина, содержимое колб окрашивается в синий цвет. Титруют из микробюретки 0,05 н. раствором перманганата калия до появления устойчивой желтой окраски. Определяют процентное содержание витамина Р в чае по формуле X = 3,2 • A • V 1 • 100 / V 2 • P • 1 000, где X — содержание витамина Р в чае (%), 3,2 — стандартный пересчетный коэффициент А — результат титрования 0,05 н. раствором перманганата калия (мл V 1 — объем, в котором растворена взятая для анализа навеска (мл 100 — общее количество вещества для расчета процентного содержания (г V 2 — объем раствора, взятый для титрования мл Р — навеска (мг 1 000 — перевод микрограммов в миллиграммы. Сравнивают содержание витамина Р в черном и зеленом чае. Работа 20. Количественное определение тиамина (В) в моче Определение основано на окислении тиамина в тиохром, экстракции тиох- рома органическим растворителем и изменении интенсивности голубой флюоресценции. Для количественного определения тиамина сравнивают флюоресценцию окисленных стандартных и испытуемых растворов тиаминхлорида на флюорометре. Реактивы и оборудование Моча, раствор гексациано-(III)-феррата калия (10 %), раствор гидроксида натрия (20 %), рабочий стандартный раствор тиамина (10 мкг в 1 мл, этанол, изобутанол. Флюорометр, штатив с пробирками, пипетки, делительные воронки. Ход работы В делительную воронку наливают мл мочи,прибавляют равный объем изобутанола и встряхивают в течение 2 минут. Промытую мочу нижний слой) сливают в две сухие делительные воронки (по 2 мл) и прибавляют по 1 мл раствора гидроксида натрия. 91 В опытную воронку по каплям вносят свежеприготовленный раствор гексациано-(III)-феррата калия до тех пор, пока окраска не сохранится в течение полминуты. В опытную и контрольную воронки прибавляют по 5 мл дистиллированной воды, по 10 мл изобутанола и интенсивно встряхивают в течение минут. Нижний слой мочи сливают, а верхний (изобутанол) собирают в две сухие пронумерованные пробирки. В третью делительную воронку вносят 1 мл рабочего стандартного раствора тиамина и 1 мл воды, в четвертую — 2 мл дистиллированной воды. В обе воронки прибавляют по 1 мл раствора гидроксида натрия, по 10 капель раствора гексацино-(III)-феррата калия, встряхивают, доливают по 5 мл воды и по 10 мл изобутанола, снова встряхивают в течение 2 минут. Нижний слой удаляют, а верхний собирают в две сухие пронумерованные пробирки. Для просветления растворов вовсе четыре пробирки — опытную, стандартную и две контрольные — добавляют по 2 мл этанола. Проводят сравнение интенсивности флюоресценции исследуемой мочи и контроля. Содержание тиамина определяют на флюорометре по флюоресценции тиохрома. Массовую концентрацию тиамина (мкг) в исследуемом материале находят по формуле X = С (Е оn – Е к ) V 0 / Ест V 1 , где X — массовая концентрация тиамина в моче, С — концентрация тиамина в 1 мл рабочего стандартного раствора (10 мкг V 1 — объем мочи, взятой для анализа (2 мл V 0 — общий объем мочи за сутки (мл E on — интенсивность флюоресценции опытной пробы Е к — контрольной Ест — стандартной. Вопросы и задания для самопроверки 1. Какова биологическая роль витаминов 2. На чем основана классификация витаминов 3. На каких принципах основана номенклатура витаминов Приведите примеры. В каком году принята Международная номенклатура витаминов 4. Какая связь существует между витаминами и ферментами 5. Что такое гипо-, гипер-, авитаминозы 6. Почему недостаток в пище водорастворимых витаминов быстрее приводит к развитию гиповитаминоза, чем недостаток жирорастворимых? 7. Вследствие чего потребление жирорастворимых витаминов приводит к развитию гипервитаминоза, а повышенное потребление водорастворимых витаминов нет 8. Какой витамин содержит в качестве структурных элементов изопреновые фрагменты Напишите его структурную формулу. 9. Отсутствие какого витамина в организме человека вызывает заболевание роговицы глаза — ксерофтальмию 10. Приведите схему обмена витамина А при участии его в акте зрения и объясните причину перехода транс-формы ретиналя в цис-форму. 92 11. Какие витамины являются производными стеролов? Напишите его структурную формулу. 12. Какие нарушения в обмене веществ характерны для рахита Какой витамин обладает антирахитическими свойствами 13. Для каких витаминов характерно явление витамерии? В чем оно проявляется Дайте характеристику отдельным представителям. 14. Какой витамин является α,γ-дигидрокси-β,β-диметилбутирил-β- аланином Напишите его структурную формулу. 15. Какой витамин является составной частью кофермента А Напишите структурную формулу HS—KoA. Каков механизм его действия 16. Какой витамин является производным диметилгидроксиметилбензохино- на Напишите его структурную формулу. 17. Какой витамин оказывает влияние на проницаемость капилляров Каков механизм процессов свертывания крови и роль этого витамина в нем 18. Какой из витаминов является бисульфитным соединением метилнафтохи- нона Кто и когда впервые его синтезировал 19. Какой витамин является производным β-пиридинкарбоновой кислоты Напишите его структурную формулу. 20. Коферментом пируватдегидрогиназы является производное одного извита минов. Какого Назовите кофермент и напишите его структурную формулу. 21. Какова химическая природа пиридоксина Напишите структурные формулы всех витаминов В 22. Какой витамин входит в состав кофермента, участвующего в реакциях трансаминирования? Выразите схемой механизм реакции переаминирова- ния аспартата и пирувата с участием кофермента трансаминаз. 23. Какова химическая природа аскорбиновой кислоты 24. Для какого витамина характерна реакция с 2,6‑дихлофенолиндофенолом? Приведите уравнение реакции. 25. Производное какого витамина участвует в реакции декарбоксилирования кетокислот Приведите схему уравнения реакций декарбоксилирования пирувата с участием тиаминпирофосфата. 26. Напишите уравнение реакции окисления витамина В в тиохром гексациано-III-ферратом калия в щелочной среде. 27. Какие коферменты входят в состав витамина В Напишите структурные формулы. Приведите схему дегидрогеназной реакции с участием этих коферментов. Напишите уравнение реакции окисления токоферола до β-токохинона. 29. С помощью какой реакции можно открыть рибофлавин Приведите уравнение этой реакции. 30. Какие принципы лежат в основе количественного определения витаминов в биологических материалах 93 ГЛАВА 4. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ Нуклеиновые кислоты играют основную роль в сохранении и реализации генетической информации. В каждом живом организме присутствуют два типа нуклеиновых кислот рибонуклеиновая кислота (РНК) и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК).В тоже время вирусы содержат только один какой‑нибудьтип нуклеиновых кислот либо РНК, либо ДНК. Нуклеиновые кислоты определяют вид форму составит. д. живой клетки и ее функции. Роль нуклеиновых кислот в организме трудно переоценить. Все нуклеиновые кислоты представляют собой высокомолекулярные соединения, хотя размер их сильно варьирует от 25 000 до 1 000 000 000. СОСТАВ, СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ РНК и ДНК состоят из мономерных единиц — нуклеотидов, поэтому нуклеиновые кислоты называют также полинуклеотидами. Каждый нуклеотид содержит три химически различных компонента неорганический фосфат, моносахарид (пентозу) и остаток пурина или пиримидина (азотистое осно- вание).Эти составные части соединены друг с другом в следующем порядке: фосфат — остаток моносахарида — азотистое основание. Нуклеотиды связаны друг с другом посредством эфирной связи между моносахаридом одного и фосфатом другого нуклеотида, называемой фосфодиэфирной. Азотистые основания связаны с остатком моносахаридов N-гликозидной связью. Последовательность азотистых оснований вдоль сахарофосфатной цепи определяет уникальную структуру и функциональную индивидуальность молекул ДНК и РНК. Нуклеотиды в составе РНК содержат рибозу, в ДНК — дезоксирибозу. Азотистые основания, которые обычно встречаются в РНК и ДНК, — это пурины и пиримидины. 94 Пурины и пиримидины — плоские молекулы, для Г, У, Ц, Т известна кето- енольная таутомерия, однако кетоструктуры гораздо более стабильны и доминируют при физиологических условиях. Кроме постоянных азотистых оснований в составе РНК и ДНК присутствуют минорные (редкие) азотистые основания, особенно это характерно для тРНК. Фрагмент нуклеотида, представляющий собой азотистое основание с присоединенным к нему углеводным остатком, называют нуклеозидом. В нуклеозидах ковалентная связь, образованная С-атомом сахара и атомом азотистого основания, называется N-гликозидной. Для нуклеозидов наиболее распространены тривиальные названия аденозин, гуанозин, уридин, цитидин, дезоксиаденозин, тимидин. 95 В состав некоторых РНК кроме основных входят и необычные нуклеозиды Нуклеотиды фосфорные эфиры нуклеозидов.Обычно у нуклеозидов этерифицируется гидроксильная группа С 1 или С 1 пентозного остатка. В зависимости от строения пентозы различают рибонуклеотиды и дезокси- рибонуклеотиды. В зависимости от числа имеющихся остатков фосфорной кислоты различают нуклеозидмонофосфаты, нуклеозиддифосфаты, нуклео- зидтрифосфаты. Для нуклеотидов используют два вида названий одно включает наименование нуклеозида с указанием положения фосфатного остатка аденозин фосфат, дезоксиаденозин-5 фосфат другое строится с добавлением «-овая кислота к названию остатков азотистых оснований (3 1 ‑ адениловая кислота, 5 1 ‑ дезоксиадениловая кислота. Сокращения АМФ, дАМФ, ГМФ, ГМФ и т. д. всегда относятся к 5 нуклеотидам. Нуклеотиды связываются в длинные цепи с помощью фосфатных групп, образуя высокомолекулярные продукты поликонденсации — нуклеиновые кислоты. Рибонуклеотиды образуют РНК, дезоксирибонуклеотиды — ДНК. Фосфатная группа в полинуклеотидной цепи образует две сложноэфирные связи с участием 3 1 и 5 1 углеводных атомов пентозы и эту связь называют 3 1 , 5 1 ‑ фосфодиэфирной связью. 96 Схема построения нуклеотидной цепи Полимерная цепь нуклеиновых кислот состоит из чередующихся пентоз- ных и фосфатных остатков, а гетероциклические основания являются боковыми группами, присоединенными к пентозным остаткам. Концы линейной полинуклеотидной цепи обозначают 5 1 — конец (слева) и 3 1 — конец справа, так как написание цепи начинают с 5 1 — конца (5 → 3). На 5 1 — конце находится фосфатная группа (ф, на 3 1 — конце цепи в пентозном остатке сохраняется свободной гидроксильная группа у СОН. Для удобства записи полинуклеотидных цепей используются сокращенные обозначения, причем каждый мономер обозначается однобуквенным символом А, ГЦ, ТУ. Тогда полинуклеотид записывается как последовательный набор конкретных нуклеотидных остатков от 5 1 — конца к 3 1 — концу. 97 Для нуклеотидного состава ДНК (независимо от источника ее выделения) известны важные общие закономерности, известные как правила Чаргаффа: 1. Число пуриновых оснований (А + Г) равно числу пиримидиновых оснований (Т + Ц, те. отношение пуринов к пиримидинам равно 1. 2. Число остатков аденина равно числу остатков тимина, те. отношение аденина к тимину равно 1. 3. Число остатков гуанина равно числу остатков цитозина, те. отношение гуанина к цитозину равно 1. Кроме того, существенным для характеристики вида ДНК оказался так называемый коэффициент специфичности, отражающий отношение ГЦ АТ. Это отношение часто выражают в молях или процентах ГЦ-пар. ГЦ-тип ДНК характерен для недрожжевых грибов, актиномицетов, ряда бактерий, вирусов. АТ тип ДНК — для хордовых и беспозвоночных животных, высших растений, дрожжевых организмов. Основываясь на данных рентгеноструктурного анализа ДНК и правиле Чаргаффа, Уотсон и Крик предложили в 1953 году модель двухспиральной структуры ДНК. Две цепи правозакрученной, двухспиральной модели удерживаются друг возле друга за счет водородных связей, образующихся между комплементарными парами Аи Т, Г и ЦВ двухцепочечной молекуле ограничения обусловлены заторможенностью вращения вокруг фосфодиэфирной связи, преимущественная антиконфигурация гликозидных связей и преимущественные кетоформы четырех оснований создают условия, в которых А может образовать прочную пару только с Та Г только с Ц. Две цепи двойной спирали являются антипараллельными, те. направление одной цепи 5 1 →3 1 , другой — 3 1 →5 1 . Одну из двух комплементарных цепей ДНК, содержащую информацию о структуре определенного гена в виде специфической последовательности нуклеодитных звеньев, обычно называют кодирующей (или матричной, другая комплементарная ей цепь носит название не-кодирующей. ДНК может формировать несколько типов двойных спиралей. В настоящее время известно шесть форм. Эти формы различаются числом пар азотистых оснований на один виток двойной спирали расстоянием между плоскостями 98 пар азотистых оснований и углом, который они образуют с осью спирали диаметром спирали, направленностью (правозакрученная, левозакрученная) двойной спирали. Конформационные переходы форм ДНК друг в друга происходят при изменении концентрации соли и степени гидратации. При физиологических условиях (низкая концентрация соли, высокая степень гидратации) доминирующим типом ДНК является В-форма. В условиях менее высокой гидратации и при более высоком содержании ионов Na + или К возникает А-форма. Эта правоспиральная конфигурация имеет больший диаметр спирали, чем В-форма и большее число пар оснований на виток. Она сходна со структурой, характерной для РНК-ДНК-дуплексов. Таблица 13. Параметры двойной спирали ДНК A (Na + ) В (Na + ) СТ Число комплементарных пар на шаг спирали 11 10 9,3 8 Шаг спирали (нм) 2,81 3,36 3,10 2,72 Расстояние между комплементарными парами (нм) 0,255 0,336 0,332 0,34 Угол между комплементарными парами (градусы) 32,73 36 39 45 Угол наклона комплементарных пар (градусы) 20 2 6 6 Направленность двойной спирали правая правая правая правая При определенных условиях В-форма ДНК может переходить в форму (Zigzag), представляющую собой левую двойную спираль. ДНК — наименее скрученная, на виток приходится 12 пар оснований, она обладает только одним желобом (бороздкой. ДНК выявляют в повторяющихся последовательностях чередующихся пуриновых и пиримидиновых дезоксинуклеотидов ГЦ или АЦ) при наличии ряда других стабилизирующих факторов, к которым относятся высокие концентрации солей или специфических катионов связывание ДНК со специфическими белками метилирование атома углерода — 5 1 некоторых остатков дезоксицитидина. ДНК в форме может участвовать в регуляции экспрессии генов. В ДНК человека имеются участки, потенциально способные переходить в форму она диспергирована в геноме. Есть основания предполагать, что в клетках человека могут реализоваться условия, необходимые для стабилизации формы. В структуре ДНК имеются большие и малые бороздки, закрученные вокруг оси молекулы параллельно фосфодиэфирному остову. В этих бороздках белки могут специфически взаимодействовать с определенными атомами азотистых оснований и, следовательно, узнавать конкретные нуклеотидные последовательности, не нарушая комплементарных взаимодействий в структуре двойной спирали. Именно за счет таких взаимодействий регуляторные белки могут осуществлять конкретные экспрессии генов. 99 ДНК бактерий, бактериофагов и многие другие ДНК, содержащие вирусы животных, представляют собой замкнутую кольцевую структуру. Такая структура не нарушает полярность молекул, нов ней исчезают свободные 3 1 и 5 гидроксильные и фосфатные группы. Замкнутые кольца могут существовать в релаксированной или суперспиральной формах. Суперспиральность проявляется тогда, когда замкнутое кольцо сворачивается вокруг собственной оси или когда скручивается участок линейной ДНК, концы которой зафиксированы. Этот требующий энергии процесс приводит к появлению внутримолекулярного напряжения структуры. При увеличении супервитков внутреннее напряжение возрастает. Супервитки ДНК, образованные за счет скручивания против часовой стрелки (в направлении, обратном закрашиванию правосторонней двойной спирали В-формы ДНК, называются отрицательными. Энергия перехода молекулы ДНК к другому типу надмолекулярной структуры может понижаться за счет образования участков отрицательного скручивания. Один из таких переходов — разделение цепей при подготовке к репликации и транскрипции. Суперспирализация ДНК весьма выгодна в биологических системах. Двухспиральную структуру ДНК можно расплавить в растворе, повышая температуру или понижая концентрацию соли. При плавлении происходит не только расхождение цепей ДНК, но и нарушается система стэкинг-взаимодействий азотистых оснований внутри данной цепи. Фосфодиэфирные связи при этом не разрываются. Денатурация ДНК сопровождается усилением оптического поглощения пуриновых и пиримидиновых оснований. Это явление называют гиперхром- ным эффектом денатурации ДНК.При денатурации исчезает высокая вязкость, присущая растворам нативной ДНК, волоконноподобная структура. Разделение цепей данной молекулы ДНК происходит в пределах определенного интервала температур. Средняя точка этого интервала называется температурой плавления ДНК, значение которой зависит от нуклеотидного состава ДНК и концентрации соли в растворе. ГЦ-тип ДНК плавится при более высокой температуре, чем АТ-тип ДНК (80–90 С. Генетическая информация, закодированная в последовательности нуклеотидов, служит двум целям. Во-первых, она необходима для синтеза белковых молекул, во‑вторых, обеспечивает передачу самой себя в ряду клеточных поколений и поколения организмов. Обе функции основаны на том, что молекула ДНК служит матрицей, в первом случае для транскрипции — перекодирования информации в структуру молекул РНК, во втором для репликации — копирования информации в дочерних молекулах ДНК. ДНК и РНК имеют много общего, однако по ряду признаков они отличаются друг от друга. У РНК пентозой является рибоза, а не β- дезоксирибоза. В РНК не содержится тимин, его место занимает урацил. РНК — одноцепочечная молекула, 100 в отличие от двухцепочечной ДНК, однако при наличии вцепи РНК участков с комплементарными последовательностями единичная цепь РНК способна сворачиваться с образованием структур, имеющих двухспиральные характеристики. Так как молекула РНК представляет собой одиночную цепь, содержание в ней гуанина необязательно равно содержанию цитозина, а содержание аденина необязательно равно содержанию урацила. Информация, содержащаяся в одноцепочечной РНК, реализуется в виде определенной последовательности пуриновых и пиримидиновых оснований цепи. Известно несколько видов РНК. Почти все они непосредственно вовлечены в процесс биосинтеза белка. Молекулы цитоплазматической РНК, выполняющие функции матриц белкового синтеза, называются матричными ( мРНК); другой вид — рибосомная РНК (рРНК) выполняет роль структурных компонентов рибосом. Адапторные молекулы транспортных (тРНК) участвуют в трансляции (переводе) информации мРНК в последовательность аминокислот в белках. Таблица 14. Свойства наиболее важных РНК тРНК рРНК мРНК 1 Число нуклеотидных остатков 2 Количество под- Более 50 4 Более 1 000 типов в клетке 3 Содержание 10 –20 % 80 % 5 % в клетке 4 Время жизни Продолжительное Продолжительное Короткое 5 Функция Трансляция кодиро Трансляция структурные Трансляция переносит вание, акцептирование, и функциональные части генетическую информа- транспорт аминокислот рибосом цию из ядра в цитозоль Значительная часть РНК, образующихся в эукариотических клетках, включая и клетки млекопитающих, подвергается деградации в ядре и не играет какой‑либо структурной или информационной роли в цитоплазме. В культивирующих клетках человека обнаружен класс малых ядерных РНК ( мяРНК), которые непосредственно не участвуют в синтезе белка, но могут оказывать влияние на процессинг РНК и общую архитектуру клетки. Размеры этих относительно небольших молекул варьируют и могут содержать от 90 до 300 нуклеотидов. РНК являются основным генетическим материалом у некоторых вирусов животных и растений. Некоторые РНК-содержащие вирусы никогда не проходят стадию обратной транскрипции РНК в ДНК. Однако для большинства известных вирусов, таких как ретровирусы, характерна обратная транскрипция их РНК-генома, направляемая РНК-зависимой ДНК-полимеразой с образованием двухспиральной ДНК-копии. Во многих случаях образующийся 101 двухспиральной ДНК транскрипт встраивается в геном ив дальнейшем обеспечивает экспрессию генов вируса, а также наработку новых копий вирусных РНК-геномов. В ядрах клеток млекопитающих, включая человека, содержатся ядерные РНК (непроцессированные продукты транскрипции, такие ядерные РНК очень гетерогенны и достигают значительных размеров. Молекулы гетерогенных ядерных РНК (гяРНК) могут иметь молекулярную массу более в то время как молекулярная масса мРНК обычно не превышает 2 • 10 Работа 21. Выделение рибонуклеопротеинов (РНП) из дрожжей и качественное определение продуктов их гидролиза Нуклеиновые кислоты являются составной частью сложных белков (ну- клеопротеинов), содержащихся во всех клетках животных, растений, бактерий, вирусов. Нуклеиновые кислоты — сильнокислые и при физиологических значениях pH несут отрицательный заряд. Этим объясняется способность нуклеиновых кислот взаимодействовать по типу ионной связи с основными белками (гистонами и негистонами), ионами металлов преимущественно с Mg 2+ ), а также полиаминами (спермином, спермидином). Поэтому для выделения нуклеиновых кислот из комплекса с белками необходимо прежде всего разрушить эти сильные и многочисленные электростатические связи между положительно заряженными молекулами белков и отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот. Для этого измельченный путем гомогенизации биоматериал обрабатывают крепкими солевыми растворами (10 % раствор хлорида натрия) и затем этанолом. В настоящее время для выделения нуклеиновых кислот в нативном состоянии пользуются более мягким фенольным методом, основанном на обработке нейтрального забуференного раствора нуклеопротеидов фенолом. Обычно эту процедуру проводят в присутствии веществ, вызывающих денатурацию белкового компонента (например, додецилсульфата или салицилата натрия, затем смесь подвергают центрифугированию. При этом денатурированный белок попадает в фенольную фракцию, а нуклеиновые кислоты остаются вводной, из которой их осаждают на холоде добавлением 2–3 объемов этанола. Этим методом удается получить достаточно очищенные препараты нуклеиновых кислот. В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным выше методом. В их числе хроматография нагеле фосфата кальция, ионнообменная хромотография на адсорбентах ДЭАЭ-целлюлозе, ДЭАЭ-се- фадексе и других, ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гельэлектрофорез и др. После получения нуклеиновых кислот в чистом виде их подвергают гидролизу для изучения химического состава. 102 Реактивы и оборудование Пекарские дрожжи гидроксид натрия (0,4 % и 10 %); уксусная кислота (10 %); лакмусовая бумага соляная кислота (конц сульфат меди (1 %); аммиак конц нитрат серебра (1 %); диэтиловый эфир, серная кислота (10 %); орциновый реактив 50 мл С • 6H 2 O растворяют в 250 мл концентрированной соляной кислоты (ρ 1,14 г / мл. Этот раствор хранят в склянке темного цвета под тягой не более одного месяца. Перед опытом к нему добавляют орцин, из расчета на 1 мл раствора 4,76 мг орцина; раствор флороглюцина 0,2 г флороглюцина растворяют в 100 мл 30 % соляной кислоты Фе- лингова жидкость готовят два раствора А. — 34,6 г ОНО в 500 мл раствора. Б. — 17,3 г сегнетовой соли и 70 г NaOH в 500 мл раствора. Растворы хранят раздельно. Перед применением смешивают равные объемы первого и второго раствора молибдат аммония смешивают 15 % раствор молибдата аммония сконцентрированной азотной кислотой в отношении 110:90; магнезиальная смесь 100 г хлорида магния, 200 г хлорида аммония, 20 мл концентрированного раствора аммиака растворяют вводе и доводят до 1 литра. Центрифуга, колбы круглодонные на 100 мл с обратным воздушным холодильником, ступки с пестиком, кварцевый песок, стаканы с носиком на 200 мл, цилиндры мерные на 50 мл, воронки стеклянные, палочки стеклянные, пробирки, песчаные бани, фильтровальная бумага. Ход работы 1. Гомогенизация. 10 г дрожжей смешивают в ступке со смесью из 2 мл эфира и 2 мл воды, добавляют 5 г песка и тщательно растирают, приливая к растертой массе небольшими порциями 40–50 мл 0,4 % раствора гидроксида натрия. Растирание продолжают в течение 15–20 минут. 2. Центрифугирование. После этого гомогенант помещают в центрифуж ные пробирки для центрифугирования. Центрифугат сливают в стакан и к нему прибавляют небольшими порциями (по 0,5 мл) 10 % уксусную кислоту до слабокислой реакции по лакмусу (5–6 мл. Полученный осадок нуклеопротеидов отделяют центрифугированием. 3. Гидролиз. Осадок из центрифужной пробирки помещают в колбу для гидролиза, приливают 20 мл 10 % раствора серной кислоты. Колбу закрывают пробкой с проходящим через нее воздушным холодильником (стеклянная трубка длиной 70 см и диаметром 0,7–0,8 см, смесь кипятят на песчаной бане в течение 1 часа, поддерживая слабое кипение. 4. Анализ гидролизата. Гидролизат отфильтровывают ив прозрачном фильтрате определяют белки, пентозы, пуриновые основания, фосфорную кислоту. А Белкиобнаруживают с помощью биуретовой реакции(см.работу1). |