Издательский дом Питер
 Скачать 5.79 Mb.
|
|
Глава 6. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПЕРЕЛИВАНИЯ КРОВИ 6.1. Общие положения Открытие Карлом Ландштейнером групп крови послужило основой современного развития учения о переливании крови. С начала XX века любое обсуждение проблем иммунологии применительно к переливанию крови фокусируется на клинически значимом взаимодействии антигенов клеток крови и антител к ним. Виды и расчетная частота посттрансфузионных осложнений иммунного генеза представлены в табл. 36. В настоящей главе приводятся как фундаментальные данные, так и практические рекомендации по проведению иммуногематологических исследований. Регламентирующим документом этого важного раздела медицины является приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 09.01.1998 г. №2 «Об утверждении инструкций по иммуносерологии». В целях совершенствования системы обеспечения иммунологической безопасности переливания крови и ее компонентов, профилактики посттрансфузионных реакций и осложнений этим приказом введено в действие 19 документов. 1. Инструкция по предупреждению несовместимости при переливании крови. 2. Инструкция по изготовлению стандартных изогемагглютинирующих сывороток для определения группы крови системы АВО. 3. Инструкция по определению группы крови системы АВО при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток. 4. Инструкция по применению цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ диагностических жидких для определения группы крови системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ). 5. Инструкция по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус. 6. Инструкция по удалению из сывороток антирезус антител другой специфичности. 226_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови Таблица 36 Неблагоприятные последствия гемотрансфузий иммунного генеза
1Индуцирована цитокинами, чаще встречается у реципиентов множественных трансфузий. 2Распространенность у реципиентов множественных трансфузий клеточных компонентов достигает 100 %. 3 Распространенность у реципиентов множественных трансфузий плазмы достигает 3 %. 4 В основном связано с антилейкоцитарными антителами в плазме донора, часто не регистрируется. 5 В основном связана с продукцией специфических антител у пациентов с дефицитом IgA. 7. Инструкция по определению резус-принадлежности крови. 8. Инструкция по определению резус-принадлежности крови на плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и реактива антирезус, предназначенных для этой цели. 9. Инструкция по применению цоликлона анти-D диагностического жидкого для определения D антигена системы резус (антитела монок л опальные анти-D). 10. Инструкция по применению анти-D IgM моноклонального реагента для определения резус-принадлежности (цоликлона анти-D супер). 11. Инструкция по исследованию сыворотки на наличие резус-антител. 12. Инструкция по изготовлению редких сывороток, предназначенных для определения различных изоантигенов эритроцитов человека. 13. Инструкция по применению цоликлона анти-С моноклонального для определения антигена С системы резус на эритроцитах человека (цоликлон анти-С супер). Группы крови_______________________________________227 14. Инструкция по применению цоликлона анти-Е моноклопального для определения антигена Е системы резус на эритроцитах человека (цоликлон анти-Е супер). 15. Инструкция по предупреждению посттрансфузнойных осложнений, обусловленных факторами Kell и с. 16. Инструкция по иммунизации доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус. 17. Инструкция по взятию и учету крови, получаемой от доноров малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов. 18. Инструкция по определению иммунных антител групповой системы АВО. 19. Инструкция по изготовлению стандартных эритроцитов и их применению в изосерологических исследованиях. Аналогичные документы, действующие ранее, признаны утратившими силу. 6.2. Группы крови Понятие группы крови охватывает все генетически наследуемые факторы, выявляемые в крови человека. /. Клеточные факторы — Эритроцитарные, выявляемые реакцией антиген-антитело, проявляющейся агглютинацией тест-эритроцитов; — ферментные группы эритроцитов; — антигены лейкоцитов и тромбоцитов. 2. Сывороточные группы крови По химической структуре антигены групп крови в основном относятся к одному из трех классов: — гликолипиды (системы групп крови AB0, Lewis, P); — протеины (системы групп крови Rhesus, MNS); — гликопротеины (система HLA). В практической трансфузиологии под группами крови традиционно понимают различные сочетания антигенов эритроцитов (агглютиногенов). Антигены групп крови — генетические признаки, наследуемые от родителей и не изменяющиеся в течение жизни. Прошло более столетия с открытия первых групп крови. За это время были открыты сотни антигенов эритроцитов и предлагались самые разнообразные терминологии и классификации групп крови. Для преодоления разобщенности исследователей и практических врачей Международным обществом переливания крови (ISBT, International Society of Blood Transfusion) в 1980 г. создано Рабочее совещание по терминологии антигенов поверхности эритроцитов (ISBT working party on terminology for red cell surface antigens). Зада- 228_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови ча совещания — на основе генетического картирования создать числовую (номерную) терминологию для антигенов эритроцитов. На сегодняшни день около 270 антигенов эритроцитов имеют четкую генетическую характеристику и относятся к одной из четырех классификаций: 1) системы группы крови; 2) коллекции группы крови; 3) редко встречающиеся антигены (700-е серии); 4) часто встречающиеся антигены (901-е серии). Система группы крови состоит из одного или более антигенов, контролируемых одним генетическим локусом или двумя и более очень тесно связанными гомологичными генами с небольшой или не выявляющейся рекомбинацией между ними. Для каждой системы показана четкая генетическая дискретность от другой системы группы крови. Известно 26 систем группы крови (табл. 37). Нумерация систем в основном соответствует порядку их открытия: АВО — в 1901 г. (Landsteiner), MNS — в 1927 г. (Landsteiner, Levine), RH — в 1940 г. (Wiener, Landsteiner, Levine) и т. д. Антигены двух систем групп крови (Lewis и Chido/Rogers) не экспрес-сируются на эритроцитах непосредственно, а, сохраняя иммуногенность, адге-зируются из плазмы, являясь продуктами секреции других клеток Коллекция группы крови содержит серологически, биохимически или генетически родственные антигены, характеристики которых не соответствуют критериям системы. Известно 5 коллекций, содержащих 11 антигенов. К редко встречающимся антигенам (700-е серии) относят 37 антигенов, распространенность которых в популяции не превышает 1 %. Часто встречающиеся антигены (901-е серии), распространенность которых в популяции более 90 %, насчитывают 14 антигенов. Каждый антиген, принадлежащий к системе группы крови, обозначается шестизначным номером: первые три цифры соответствуют номеру системы (например, 004 для RH), вторые три цифры — специфичности антигена внутри системы (например, 004003 для антигена Е системы RH). Также возможно написание RH003 или RH3. Антигены коллекций группы крови обозначаются аналогичным образом. Обозначения антигенов серий 700 и 901 начинаются с этих цифр. Практически ежегодно Рабочее совещание уточняет номенклатуру поверхностных антигенов эритроцитов. Для практической трансфузиологии важное значение имеют наиболее иммуногенные антигены, в первую очередь систем ABO, RH (резус), Kell (Келл) и другие, указанные в табл. 38. Антигены коллекций, редко и часто встречающиеся, менее иммуногенны и необходимость их специфической идентификации в повседневной практике лечебных учреждений отсутствует. Следует подчеркнуть региональные и расовые различия распространенности антигенов групп крови. Например, жители Центральной и Южной Группы крови 229 Таблица 37 Системы группы крови, кодирующие гены, и их хромосомная локализация
Америки в основном имеют фенотип О (I), следовательно, проблема АВО-не-совместимости для трансфузиологов этого региона не столь актуальна. D-негативный фенотип встречается у 15-40 % представителей белого населения (кавказоидов), тогда как среди китайцев, японцев и американских индейцев — менее чем у 1 % (соответственно резус-конфликты у беременных чрезвычайно редки). В ряде регионов достаточно широко распространены антигены, чрезвычайно редко встречающиеся в других популяциях: — Dia (система Diego) — у китайцев (2-5 %), японцев (8-12 %) и американских индейцев (11-36%); 230 Глава 6. Иммунологические основы переливания крови Таблица 38 Наиболее иммуногенные антигены эритроцитов Система Номер антигена
— 1nа (система Indian) — среди населения Индии и Пакистана (2,3-4,5%); — антигены системы Gerbich отсутствуют у 80 % жителей Новой Гвинеи, что нехарактерно для остального мира. Проводятся достаточно интенсивные исследования генетического полиморфизма антигенов групп крови, особенностей их тканевой экспрессии, биологических свойств и структурно-функциональных взаимосвязей. С учетом имеющейся информации антигены групп крови можно предварительно классифицировать на 5 категорий: 1) транспортеры и мембранные каналы; 2) рецепторы для экзогенных лигандов и микроорганизмов; 3) молекулы адгезии; 4) ферменты; 5) структурные белки [Carton J. P., Colyn Y., 2001]. Важный момент для трансфузиологии — различия типа экспрессии антигенов эритроцитов, что обусловливает необходимость использования разных методических подходов к их выявлению. Ключевое значение имеет высота антигена над липидным бислоем мембраны. Следует иметь в виду ряд обстоятельств. В суспензии клеток расстояние между липидными бислоями двух эритроцитов — 18 нм. Максимальное расстояние между двумя антиген-связывающими участками молекулы IgG — 12 нм. Максимальное расстояние между двумя антиген-связывающими участками молекулы IgM — 30 нм. Антигены систем АВ0 и MNS выступают над липидным бислоем мембраны на 10-12,5 нм. Антигены систем резус и Diego выступают над липидным бислоем мембраны около или менее чем на 1 нм. Группы крови____________________________________231 Таким образом: — молекула антитела класса IgG может соединиться своими антиген-свя-зывающими участками с антигенами систем АВО и MNS (12нм + 10нм+10 нм > 18 нм); — молекула антитела класса IgG не может соединиться своими антиген-связывающими участками с антигенами систем резус и Diego (12 нм + 1 нм +1 нм < 18 нм). Для связывания антигенов системы резус пригодны и широко применяются в клинической практике два способа: — использование специфических антител класса IgM, так как молекула антитела класса IgM может соединиться своими антиген-связывающими участками с антигенами систем резус (30 нм + 1 нм +1 нм > 18 нм); — использование дополнительных «антиглобулиновых» антител — антител к глобулинам человека (проба Кумбса). В этой реакционной среде имеет значение расстояние между специфическими антиген-связывающими центрами двух антител класса IgG. А два эти антитела в свою очередь связаны специфическим антителом к глобулинам человека. Соответственно расстояние между участками молекул иммуноглобулинов, связывающими антигены эритроцитов, значительно превышает 18 нм. Наряду с антиглобулиновым тестом еще одним способом, повышающим чувствительность реакции агглютинации эритроцитов антителами класса IgG, является «ферментный» тест. В результате предварительной обработки эритроцитов протеолитическими ферментами (папаин, бромелин, трипсин и др.) происходят два процесса, облегчающие непосредственное взаимодействие молекулы IgG с антигенами эритроцитов: — удаление большинства составляющих клеточной мембраны, обусловливающих ее отрицательный заряд (остатки сиаловых кислот на гликофори-нахА, В, С, D); — удаление с поверхности клетки гликопептидов, затрудняющих доступ молекулы IgG к липидному бислою мембраны. Ограниченность ферментного метода обусловлена тем, что протеазы повреждают некоторые антигены групп крови (М, N, Ss, Gerbich, Fy8, Ina/Irib, Cromer). В то же время ряд клинически значимых антигенов (Rh, Di, К, Jk) остаются сохранными. В последние годы внедряются в практику новые иммуногематологичес-кие методы (микропланшетный, гелевый, твердофазный), позволяющие стандартизировать и автоматизировать процедуры определения антигенов эритроцитов и антител к ним. Физическая природа связи антигена и антитела состоит в межмолекулярных нековалентных взаимодействиях: электростатические силы, водородные связи, гидрофобные эффекты, силы Ван дер Ваальса. Прочность этих связей 232_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови зависит от изменений рН, ионной силы, температуры, свойств окружающей жидкости. Связь антигена и антитела специфична и обратима. Диссоциация иммунного комплекса, при которой антитело отделяется от антигена клеточной поверхности, называется элюцией. Взаимодействие антигенов эритроцитов и антител к ним проявляется реакцией агглютинации (табл. 39). Картина агглютинации определяется концентрацией взаимодействующих структур (рис. 21): — при избытке антител агглютинаты не образуются вследствие отсутствия свободных эпитопов («прозона»); — при приблизительно равном соотношении антигенных детерминант и молекул антител развивается видимая агглютинация («зона эквивалентности»); — при дефиците антител агглютинаты не образуются вследствие связывания единичных молекул иммуноглобулинов с отдельными клетками («постзона» ). Наличие антител к эритроцитам может также проявляться гемолизом вследствие разрушения мембраны комплементом, активированным комплексом антиген-антитело. Опосредованный антителами гемолиз не развивается в отсутствие комплемента или в плазме, содержащей кальций-связывающий антикоагулянт (цитрат, ЭДТА). При условии, что изначально сыворотка не была гемолизированной и при тестировании не добавлялись гемолитические агенты, гемолиз в супернатанте — признак реакции антиген-антитело (табл. 40). Методы, основанные на реакции агглютинации, наиболее распространены в практике службы крови. Фактически реакция агглютинации протекает в две стадии: — стадия сенсибилизации: соединение антител с антигенами мембраны эритроцита; — стадия гемагглютинации: соединение сенсибилизированных клеток в видимые агглютинаты. Это разделение довольно условно и полезно для понимания процесса, происходящего invitro. Фактически обе стадии протекают одновременно, и гемагглютинация начинается до завершения сенсибилизации. Результат реакции агглютинации зависит от ряда условий. Соблюдение адекватного соотношения концентраций антигенов и антител — для создания «зоны эквивалентности». рН. Большинство антител к антигенам эритроцитов реактивны при величине рН от 6,5 до 7,5. Обычно используется рН 7,0. Ионная сила. Ионы Na+ и С1- в обычном физиологическом растворе отчасти нейтрализуют электрический заряд активных участков антигенов и антител. При снижении ионной силы среды этот нейтрализующий эффект умень- Группы крови 233
Примечание. 1) Микро — при микроскопии; Макро — при макроскопии. 2) Для взбалтывания осевшего на дне пробирки агломерата эритроцитов нужно аккуратно перемешать или перевернуть пробирку. 3) После оценки степени разрушения агломерата эритроцитов и полного ресуспендирования клеток оценивают степень агглютинации в соответствии с данными таблицы. 4) Следует оценить и описать характер агглютинации. Должны быть особо отмечены расплывчатые, «волокнистые», неоднородные и распадающиеся агглютинаты, наличие которых может иметь ключевое диагностическое значение при сложных клинических ситуациях. 234 Глава 6. Иммунологические основы переливания крови  Увеличение концентрации антигенов Рис. 21. Проявления взаимодействия антигенов и антител. Таблица 40 Интерпретация гемолиза в серологической реакции
шается. Кроме того, низкая концентрация ионов способствует ускорению образования комплекса антиген-антитело. Поэтому в иммуногематологической практике широко распространено использование раствора низкой ионной силы (РНИС, LISS) в качестве «усиливающего» реагента. Температура. Антитела к антигенам групп крови различаются по температурному оптимуму реагирования. Антитела класса IgM лучше реагируют при температуре от 4 до 27 °С, а антитела класса IgG лучше реагируют при температуре 37 °С. Антитела, реагирующие invitroтолько при температуре менее 37 °С, как правило, не вызывают разрушения эритроцитов и не имеют клинического значения. Время, Слишком ранний учет результатов чреват тем, что реакция еще не произошла. При затянутой инкубации может произойти диссоциация иммунных комплексов. При использовании «усиливающих» реагентов, например LISS, оптимальное время инкубации сокращается. Группы крови ________________235 Учет класса антител. Как обсуждалось выше, антитела класса IgM активнее индуцируют агглютинацию, чем антитела класса IgG. Учет возможности недостаточной экспрессии антигенов. В ряде случаев возможно, что на мембране эритроцита экспрессировано незначительное количество молекул антигена, либо антиген «погружен» в липидный бис-лой. Электростатическое отталкивание эритроцитов. Эритроциты отталкиваются вследствие отрицательного поверхностного заряда («дзета-потенциала»). Для преодоления этого эффекта используют: 1) обработку клеток протеолитическими ферментами; 2) добавление коллоидов в реакционную среду; 3) центрифугирование. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||