Издательский дом Питер

• Название: Издательский дом Питер
• Анкор: Zhiburt_E_B_Transfuziologia.doc
• Дата: 31.01.2017
• Размер: 5.79 Mb.
• Имя файла: Zhiburt_E_B_Transfuziologia.doc
• Тип: Учебник; #1519
• страница: 27 из 77

6.2.1.3. Определение групповой принадлежности крови по системе АВ0

Возможны два способа определения группы крови.

1. Определение группы крови при помощи стандартных изогемагглюти-нирующих сывороток. При этом способе в крови устанавливают наличие или отсутствие агглютиногенов и, исходя из этого, делают заключение о группо­вой принадлежности исследуемой крови.

242_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

2. Определение группы крови перекрестным способом, т. е. одновремен­но при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток и стандар­тных эритроцитов. При этом способе, так же как и при первом, определяют наличие или отсутствие агглютиногенов и, кроме того, при помощи стандарт­ных эритроцитов устанавливают наличие или отсутствие групповых агглю­тининов.

Группа крови у больных и других лиц, которым предполагается сделать переливание крови, определяется сертифицированным специалистом, имею­щим специальную подготовку. Во избежание ошибки процедуру взятия крови и определения группы повторяют.

Результат определения группы крови записывается в правом верхнем углу лицевого листа истории болезни с указанием даты и за подписью специали­ста, производившего определение.

Группа крови у доноров определяется два раза сертифицированным спе­циалистом: один раз при первичном обращении донора при помощи стандар­тных сывороток двух различных серий каждой группы, и второй раз при окончательном зачислении в доноры — перекрестным способом, т. е. одновре­менно при помощи стандартных сывороток (также двух различных серий каждой группы) и стандартных эритроцитов. Результаты обоих определений записываются на лицевой стороне донорского журнала (карты) с указанием даты и за подписью лиц, определявших группу крови.

При использовании изогемагглютинируюших сывороток с титром не ниже 1:64 разрешается проводить первичное определение группы крови у доноров и больных одной серией сыворотки каждой группы. При повторном и пере­крестном определении можно использовать также сыворотки одной серии (с титром не ниже 1:64), но отличающиеся от тех серий, которые были примене­ны при первичном определении.

6.2.1.4. Определение группы крови системы АВ0 простой реакцией

Ход определения.

Определение группы крови производят при хорошем освещении и темпе­ратуре от 15 до 25 °С на планшетах. На левой стороне планшета надписыва­ют 0 (I), в середине — А (II), на правой стороне — В (III). В середине верх­него края планшета отмечают фамилию донора или номер исследуемой крови. Используют активные стандартные сыворотки трех групп (0, А, В) с титром не ниже 1:32 двух серий. Сыворотки располагают в специальных штативах в два ряда. Каждой сыворотке соответствует маркированная пипетка. Для дополнительного контроля используют сыворотку группы АВ (IV).

На планшет наносят по 1-2 капли стандартных сывороток в два ряда: сыворотку группы 0 (I) — слева, сыворотку группы А (II) — в середину, сыворотку группы В (III) — справа.


Группы крови


243

Капли крови из пальца или пробирки наносят пипеткой или стеклянной палочкой около каждой капли сыворотки и смешивают палочкой. Количе­ство крови должно быть в 8-10 раз меньше, чем сыворотки. После смешива­ния тарелку или планшет осторожно покачивают в руках, что способствует более быстрой и четкой агглютинации эритроцитов. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3 мин, к каплям сыворотки с эритроци­тами, где наступила агглютинация, добавляют по 1 капле 0,9 % раствора хло­рида натрия и продолжают наблюдение до истечения 5 мин. Через 5 мин читают реакцию в проходящем свете (см. табл. 39). Если агглютинация не­четкая, к смеси сыворотки и крови дополнительно добавляют по 1 капле 0,9 % раствора хлорида натрия, после чего дают заключение о групповой принад­лежности (табл. 43).

Результаты реакции.

1. Отсутствие агглютинации во всех 3 каплях указывает на то, что в ис­следуемой крови нет агглютиногена, т. е. кровь относится к группе 0 (I).

2. Наступление агглютинации в каплях с сыворотками 0 (I) и В (III) указывает на то, что в крови имеется аггглютиноген А, т. е. кровь относится к группе А (II).

3. Наличие агглютинации в каплях с сыворотками группы О (I) и А (II) указывает на то, что в исследуемой крови имеется агглютиноген В, т. е. кровь группы В (III).

4. Агглютинация во всех 3 каплях указывает на наличие в исследуемой крови агглютиногенов А и В, т. е. кровь относится к группе АВ (IV). Одна­ко в этом случае, учитывая, что агглютинация со всеми сыворотками возмож­на за счет неспецифической реакции, необходимо нанести на планшет или тарелку 2-3 капли стандартной сыворотки группы АВ (IV) и добавить к ним 1 каплю исследуемой крови. Сыворотку и кровь перемешивают и результат реакции наблюдают в течение 5 мин.

Таблица 43 Результаты определения группы крови системы АВ0

Результаты исследования						Групповая принадлежность исследуемой крови
эритроцитов с реагентом			сыворотки (плазмы) со стандартными эритроцитами
анти-АВ	анти-А	анти-В	0 (1)	А (П)	В (III)
-	-	—	—	+	+	0 (I)
+	+	—	—	—	+	А (II)
+	-	+	—	+	—	В (III)
+	+	+	-	-	-	AB (IV)

Примечани. «+» — наличие агглютинации; «-» — отсутствие агглютинации.

244_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

Если агглютинация не наступила, то исследуемую кровь относят к груп­пе АВ (IV). Если же агглютинация появляется с сывороткой группы АВ (IV), значит реакция неспецифическая. При слабой агглютинации и во всех сомни­тельных случаях кровь заново проверяют со стандартными сыворотками других серий.

6.2.1.5. Определение группы крови системы AВ0 двойной реакцией (по стандартным сывороткам и стандартным эритроцитам)

Стандартные эритроциты представляют собой 10-20 % взвесь свежих на-тивных эритроцитов (или отмытых от консерванта тест-клеток) группы 0 (I), А (II) и В (III) в 0,9% растворе хлорида натрия или цитратно-солевом ра­створе. Нативные стандартные эритроциты могут быть использованы в тече­ние 2-3 дней при условии хранения их в изотоническом солевом растворе при температуре 4 °С. Консервированные стандартные эритроциты хранят при температуре 4 °С в течение 2 мес и отмывают от консервирующего раствора перед использованием.

Ампулы или флаконы со стандартными сыворотками и стандартными эритроцитами располагают в специальных штативах с соответствующей мар­кировкой. Для работы с типирующими реагентами используют сухие чистые пипетки, отдельные для каждого реагента. Для промывания стеклянных (пла­стмассовых) палочек и пипеток подготавливают стаканы с 0,9 % раствором хлорида натрия.

Для определения группы берут 3-5 мл крови в пробирку без стабилиза­тора. Кровь должна отстояться в течение 1,5-2 ч при температуре 15-25 °С.

Ход определения.

На планшет наносят по 2 капли (0,1 мл) стандартных сывороток групп 0(1), А (II), В (III) двух серий. Соответственно каждой группе сывороток располагают по 1 маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп 0(1),А(П),В(Ш).В стандартные сыворотки добавляют по 1 капле иссле­дуемой крови, а в стандартные эритроциты — по 2 капли исследуемой сыво­ротки. Количество крови должно быть в 8-10 раз меньше, чем сыворотки. Капли перемешивают стеклянной палочкой и, покачивая планшет в руках в течение 5 мин, следят за наступлением агглютинации. Если агглютинация нечеткая, к смеси сыворотки и крови дополнительно добавляют по 1 капле 0,9 % раствора хлорида натрия (0,1 мл), после чего делают заключение о групповой принадлежности (см. табл. 43).

Оценка результатов определения группы крови системы АВ0.

1. Наличие агглютинации со стандартными эритроцитами А и В и отсут­ствие агглютинации в трех стандартных сыворотках двух серий указывает на то, что в исследуемой сыворотке присутствуют оба агглютинина: а и Р, а в

Группы крови 245

исследуемых эритроцитах нет агглютиногенов, т. е. кровь относится к груп­пе 0 (I).

2. Наличие агглютинации со стандартными сыворотками групп 0 (I), В (III) и со стандартными эритроцитами группы В (III) указывает на то, что в исследуемых эритроцитах имеется агглютиноген А, а в исследуемой сыво­ротке — агглютинин (3. Следовательно, кровь относится к группе А (II).

3. Наличие агглютинации со стандартными сыворотками групп 0 (I), А (II) и со стандартными эритроцитами группы А (II) указывает на то, что в исследуемых эритроцитах имеется агглютиноген В, а в исследуемой сыво­ротке агглютинин а. Следовательно, кровь относится к группе В (III).

4. Наличие агглютинации со всеми стандартными сыворотками и отсут­ствие агглютинации со всеми стандартными эритроцитами указывает на то, что в исследуемых эритроцитах имеются оба агглютиногена, т. е. кровь отно­сится к группе АВ (IV).

6.2.1.6. Определение групповой принадлежности крови с использованием цоликлонов анти-А и анти-В

Цоликлоны анти-А и анти-В (моноклональные антитела к антигенам А и В) предназначены для определения группы крови системы АВО человека вза­мен стандартных изогемагглютинирующих сывороток. Для каждого опреде­ления группы крови применяют по одной серии реагента анти-А и анти-В.

Ход определения.

На планшет (пластинку) наносят по 1 большой капле цоликлона анти-А и анти-В (0,1 мл) под соответствующими надписями: «Анти-А» или «Анти-В». Рядом помещают по 1 маленькой капле исследуемой крови (соотноше­ние кровь:реагент — 1:10), затем реагент и кровь смешивают и наблюдают за ходом реакции при легком покачивании планшета или пластинки.

Агглютинация с цоликлонами анти-А и анти-В обычно наступает в пер­вые 5-10 с. Наблюдение следует вести 2,5 мин ввиду возможности более позднего наступления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В.

Оценка результатов реакции агглютинации с цоликлонами анти-А и анти-В представлена в табл. 43, в которую также включены результаты оп­ределения агглютининов в сыворотке доноров с помощью стандартных эрит­роцитов.

При подозрении на спонтанную агглютинацию у лиц с группой крови АВ (IV) проводят контрольное исследование с 0,9 % раствором хлорида натрия. Реакция должна быть отрицательной.

Цоликлоны анти-А (розового цвета) и анти-В (синего цвета) выпускаются как в нативной, так и лиофилизированной форме в ампулах по 20, 50, 100 и 200 доз с растворителем, приложенным к каждой ампуле по 2, 5, 10, 20 мл соответственно.

246_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

Дополнительным контролем правильности определения группы крови АВ0 реагентами анти-А и анти-В служит моноклональный реагент анти-АВ. Реа­гент анти-АВ целесообразно использовать параллельно как с иммунными по-ликлональными сыворотками, так и с моноклопальными реагентами. В ре­зультате реакции с реагентом анти-АВ развивается агглютинация эритроци­тов групп А (II), В (III) и АВ (IV); у эритроцитов группы 0 (I) агглютинация отсутствует.

6.2.1.7. Ошибки при определении групповой принадлежности

Ошибки при определении групп крови могут зависеть от трех причин:

1) технических;

2) неполноценности стандартных сывороток и стандартных эритроцитов;

3) биологических особенностей исследуемой крови.

1. Ошибки по техническим причинам:

— неправильное расположение сывороток на планшете;

— неправильные количественные соотношения сывороток и эритроцитов;

— применение недостаточно чистых планшетов и других предметов, со­прикасающихся с кровью. Для каждой сыворотки должна быть отдельная пипетка; для промывания пипеток следует применять только 0,9 % раствор хлорида натрия;

— неправильная запись исследуемой крови;

— несоблюдение положенного для реакции агглютинации времени; при поспешности, когда реакцию учитывают до истечения 5 мин, агглютинация может не наступить, если в исследуемой крови имеются слабые агглютиноге-ны; при передержанной более 5 мин реакции может произойти подсыхание капель с краев, симулирующее агглютинацию, что также поведет к ошибоч­ному заключению;

— отсутствие агглютинации из-за высокой (выше 25 °С) температуры ок­ружающего воздуха. Во избежание этой ошибки целесообразно: использовать специально приготовленные сыворотки для работы в условиях жаркого кли­мата; производить определение групп крови на тарелке или пластмассовом подносе, внешняя поверхность дна которых опущена в холодную воду;

— неправильное центрифугирование: недостаточное может привести к ложноотрицательному результату, а избыточное — к ложноположительно-му.

2. Ошибки от применения неполноценных стандартных сывороток и стандартных эритроцитов:

— слабые стандартные сыворотки с титром ниже 1:32 или с истекшим сроком годности могут вызывать позднюю и слабую агглютинацию;

— применение негодных стандартных сывороток или эритроцитов, кото­рые были приготовлены нестерильно и недостаточно законсервированы, ве­дет к возникновению неспецифической «бактериальной» агглютинации.

Группы крови 247

3. Ошибки от биологических особенностей исследуемой крови

3.1. Ошибки от биологических особенностей исследуемых эритроци­тов:

— поздняя и слабая агглютинация объясняется «слабыми» формами ан­тигенов эритроцитов, чаще — наличием в группах А и АВ слабого агглюти-ногена А₂. При этом в случае определения группы крови без исследования сыворотки на наличие агглютининов (простая реакция) могут наблюдаться ошибки, вследствие которых кровь группы А₂В определяют как группу В (III), а кровь А₂ — как группу 0 (I). Поэтому во избежание ошибок определение группы крови как доноров, так и реципиентов необходимо проводить с ис­пользованием стандартных эритроцитов (двойная, или перекрестная, реакция). Для идентификации агглютиногена А₂ рекомендуется повторить исследова­ние с другими видами (сериями) реагентов, используя другую лабораторную посуду, с увеличением времени регистрации реакций. Специфическими реа­гентами уточнения группы крови при наличии слабых вариантов антигена А (А₁, А₂, А₃) методом прямой реакции агглютинации являются цоликлон анти-А_сл и реагент анти-А,;

— «панагглютинация», или «аутоагглютинация» — это способность кро­ви давать одинаковую неспецифическую агглютинацию со всеми сыворот­ками и даже со своей собственной. Интенсивность подобной реакции после 5 мин ослабевает, в то время как истинная агглютинация усиливается. Наи­более часто встречаются у гематологических, онкологических больных, обо­жженных и др. Для контроля рекомендуется оценить, происходит ли агг­лютинация тестируемых эритроцитов в стандартной сыворотке группы АВ (IV) и физиологическом растворе. Группа крови при «панагглютинации» может быть определена после трехкратного отмывания эритроцитов. Для ус­транения неспецифической агглютинации планшет помещают в термостат при температуре 37 °С на 5 мин, после чего неспецифическая агглютинация ис­чезает, а истинная остается. Целесообразно повторить определение с исполь­зованием моноклональных антител, постановки пробы Кумбса. В том слу­чае, когда отмывание эритроцитов не дает желаемого результата, необходи­мо произвести повторное взятие образца крови в предварительно согретую пробирку, поместить пробу в термоконтейнер для поддержания температу­ры 37 °С и доставить в лабораторию на исследование. Определение группы крови необходимо производить при температуре 37 °С, для чего использу­ют реактивы, физиологический раствор и планшет, предварительно подо­гретые;

— эритроциты тестируемой крови складываются в «монетные столбики», которые при макроскопии можно принять за агглютинаты. Прибавление 1-2 капель изотонического раствора хлорида натрия с последующим мягким покачиванием планшета, как правило, уничтожает «монетные столбики»;

248_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

— смешанная или неполная агглютинация: часть эритроцитов агглюти­нирует, а часть остается свободной. Результат «химеры» определяется состо­янием, при котором в крови содержится две или более популяции клеток — продуктов различных источников эритропоэза. Возможны генетические хи­меры (анастомоз или соединение тканей близнецов в раннем эмбриональном периоде). К этой категории относят проявляющийся тканевой мозаикой хи-меризм вследствие оплодотворения одной яйцеклетки двумя разными спер­матозоидами. Чаще встречаются «искусственные» химеры — последствие пе­реливания крови, пересадки аллогенного костного мозга или фетоматеринс-кого кровотечения. Разнородность эритроцитов периферической крови четко верифицируется в гелевом тесте DiaMed;

— «полиагглютинация» — эритроциты агглютинируются АВ0-совмести-мыми сыворотками (за исключением сыворотки плода). Аутоконтроль, как правило, отрицательный. В обычной сыворотке крови нормальных людей при­сутствуют полиагглютинины (в основном класса IgM), реагирующие с ано­мальными структурами поверхности эритроцита. Эти аномальные структу­ры могут возникать в результате:

— действия микробных ферментов;

— соматических мутаций кроветворной ткани;

— наследственных заболеваний (постоянно присутствующие аномальные антигены Cad, HEMPAS и NOR).

Чаще полиагглютинация регистрируется в период вирусной или бакте­риальной инфекции (а по выздоровлении исчезает), когда микробные фер­менты, действуя на эритроциты, «обнажают» скрытые антигены (криптан-тигены) — Т, Tk, Th, VA. Анти-Т содержится во всех сыворотках взрослых и отсутствует в большинстве сывороток пуповинной крови, что позволяет ис­пользовать последнюю в качестве реагента для дифференциальной диаг­ностики.

Полиагглютинация может быть признаком соматической мутации кро­ветворной ткани, в результате которой образуется криптантиген Тп, содер­жащий N-ацетилгалактозамин — иммунодоминантный сахар антигена А (у таких пациентов имеется риск развития лейкоза). Дифференциальная ди­агностика с подгруппами антигена А — равная агглютинация с поликло-нальными анти-А и анти-АВ, сильная агглютинация с лектином анти-А, и отсутствие агглютинации с моноклональными АВ0-типирующими реаген­тами.

Еще одной причиной полиагглютинации может быть «приобретенный» антиген В, который обнаруживают у А₁-позитивных лиц с заболеваниями дистального отдела кишечника, карциномой прямой кишки, кишечной непро­ходимостью, грамотрицательной бактериемией, гангреной нижних конечнос­тей. Одной из причин такого состояния может быть пассивная адсорбция В-подобных бактериальных полисахаридов на эритроциты пациента. Однако

Группы крови _________________249

чаще «приобретенный» В возникает вследствие деацетилирования антигена А ферментами микробов. При удалении ацетильной группы с А-иммунодо-минантного сахара N-ацетилгалактозамина образуется галактозамин, очень похожий на В-иммунодоминантный сахар — галактозу. Галактозамин слабо реагирует со многими реагентами анти-В. С аутологичными анти-В «приоб­ретенный» антиген В не реагирует. Для дифференциальной диагностики проводят типирование в кислой среде с рН 6,0 (к 1 мл анти-В добавляют 1-2 капли 1 н соляной кислоты), при этом галактозамин не реагирует с анти-В.

Пациентов с «приобретенным» В нельзя рассматривать как истинных носителей В-антигена. Поскольку анти-В присутствуют в плазме пациента, трансфузия В-позитивных эритроцитов недопустима. Следует переливать А,-совместимые эритроциты и плазму группы АВ (IV).

3.2. Ошибки, происходящие оm биологических особенностей исследуе­мой сыворотки:

— выявление антител другой специфичности при рутинном тестирова­нии является результатом предшествующей сенсибилизации. Целесообраз­но определить специфичность антител и подобрать типированные эритро­циты без антигена, к которому выявлена иммунизация. Иммунизированному реципиенту обязателен индивидуальный подбор совместимой донорской крови;

— при выявлении образования «монетных столбиков» стандартных эрит­роцитов в присутствии тестируемой сыворотки аномальный результат целе­сообразно подтвердить, используя стандартные эритроциты группы 0 (I). Для дифференцировки «монетных столбиков» и истинных агглютинатов добав­ляют 1-2 капли изотонического раствора хлорида натрия и покачивают план­шет, при этом «монетные столбики» разрушаются;

— отсутствие анти-А или анти-В-антител. Возможно у новорожденных и пациентов с угнетением гуморального иммунитета;

— агглютинация стандартных эритроцитов, в том числе группы 0 (I), при наличии исследуемой сыворотки, связана с присутствием специфических и неспецифических холодовых антител. Исчезновение агглютинации при про­ведении исследования при температуре 37 °С верифицирует неспецифичес­кие холодовые агглютинины. Если исследуемая сыворотка взаимодействует с некоторыми образцами эритроцитов группы 0 (I), то это свидетельствует о присутствии в сыворотке специфических холодовых антител. Для установ­ления специфичности антител проводят тестирование с панелью эритроцитов, типированных по системам Р, MNS и др.;

— наличие в плазме АВ-подобных субстанций (секретируемых некото­рыми опухолями), которые связываются с диагностическим реагентом, пре­пятствуя взаимодействию последнего с эритроцитом. В этом случае необхо­димо отмыть эритроциты.


250

Глава 6. Иммунологические основы переливания крови