Издательский дом Питер

• Название: Издательский дом Питер
• Анкор: Zhiburt_E_B_Transfuziologia.doc
• Дата: 31.01.2017
• Размер: 5.79 Mb.
• Имя файла: Zhiburt_E_B_Transfuziologia.doc
• Тип: Учебник; #1519
• страница: 30 из 77

6.3.2.3. Определение резус-антигенов с помощью универсальных реагентов

Стандартный реагент антирезус Rh₀(D) содержит поликлональные непол­ные анти-В-антитела. Одновременно с исследованием крови доноров произ-

260_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

водится контрольное исследование стандартных резус-положительных эрит­роцитов той же группы или группы 0 (I) и стандартных резус-отрицатель­ных эритроцитов, обязательно одногруппных с исследуемой кровью. Ход определения:

— на дно пробирки вносят 1 каплю стандартного реагента антирезус;

— добавляют каплю исследуемой крови (или эритроцитов);

— содержимое пробирки перемешивают встряхиванием;

— медленно поворачивают пробирку, наклоняя ее почти до горизонтали таким образом, чтобы содержимое растекалось по стенкам. Такое распреде­ление крови по стенкам пробирки делает реакцию более выраженной;

— агглютинация наступает в течение 1-й минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген-антитело и четко выраженной агглютинации, а также ввиду возможности замедленной реакции при наличии антигена D^u, контакт эритроцитов с реагентом при перевертывании следует проводить не менее 3 мин;

— для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора, хлорида натрия и перемеши­вают, не взбалтывая, путем 2-3-кратного перевертывания пробирки;

— оценку производят визуально.

Наличие агглютинации в виде крупных хлопьев из эритроцитов на фоне просветленной жидкости свидетельствует о резус-положительной принадлеж­ности исследуемой крови.

Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная жидкость) — признак резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.

Результат учитывается как истинный после проверки контрольных образ­цов, т. е. при положительном результате со стандартными резус-положитель­ными эритроцитами и отсутствии агглютинации со стандартными резус-от­рицательными эритроцитами, одногруппными с исследуемой кровью по сис­теме АВ0.

6.3.2.4. Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса) с помощью (неполных) анти-D антител

Параллельно с исследованием образцов тестируемой крови проводят кон­трольное исследование со стандартными резус-отрицательными эритроцита­ми.

Ход определения:

— из исследуемой крови готовят 2-5 % взвесь отмытых эритроцитов. С этой целью вносят в пробирку 5 капель (около 0,25 мл) исследуемой крови, три раза отмывают в 5-10 мл физиологического раствора; ресуспендируют оса­док эритроцитов в 2-3 мл физиологического раствора или, что предпочтитель­нее, в 2-3 мл раствора низкой ионной силы — LISS (в этом случае произой­дет более прочная и быстрая фиксация антител на эритроцитах);

Система группы крови резус____________________________261

— маркируют чистую пробирку;

— вносят в нее 1 каплю реагента анти-D;

— добавляют 1 каплю 2-5 % взвеси исследуемых эритроцитов;

— если эритроциты суспендированы в физиологическом растворе, то ин­кубируют смесь при 37 °С в течение 30-45 мин; если используют эритроциты в LISS, то 10-15 мин;

— отмывают эритроциты, используя 5-10 мл физиологического раство­ра: при использовании моноклональных анти-В-антител — однократное отмывание, а при использовании поликлональных анти-В-антител — трех­кратное. Следует иметь в виду, что сыворотка крови в разведении 1:4000 инактивирует равный объем антиглобулинового реагента, следовательно, не­достаточное отмывание может привести к инактивации антиглобулинового реагента и к ложноотрицательному результату теста;

— удаляют физиологический раствор;

— добавляют 1 каплю антиглобулинового реагента к осадку эритроци­тов и тщательно перемешивают;

— центрифугируют 15-20 с при 2000-3000 об/мин (900-1000 g);

— аккуратно ресуспендируют осадок эритроцитов и визуально опреде­ляют наличие или отсутствие агглютинации. При наличии агглютинации кровь является резус-положительной. При отсутствии агглютинации — резус-отрицательной. Слабая агглютинация возможна при экспрессии антигена D";

— записывают результаты исследования.

6.3.2.5. Агглютинация эритроцитов, обработанных протеолитическими ферментами, IgG (неполными) анти-D -антителами

Для усиления прямой агглютинации эритроцитов в солевой среде исполь­зуют предварительную обработку эритроцитов протеазами (протеолитичес­кими ферментами): бромелином, папаином, трипсином и др. При этом повы­шается чувствительность метода, в том числе и в отношении слабых форм антигена D. Метод используется в системах автоматизированного определе­ния групп крови. Особенностью этого теста, затрудняющей его применение для рутинного фенотипирования эритроцитов, является феномен «прозоны» — ингибирование агглютинации избыточным количеством антител (см. рис. 21). Для избежания феномена прозоны необходимо обеспечить стандартность об­работки эритроцитов ферментами и строго соблюдать концентрацию анти-D-антител, рекомендованную производителем.

6.3.2.6. Методический подход к определению резус-принадлежности

С целью выбора оптимального способа определения резус-принадлежно­сти крови доноров провели сравнительную оценку эффективности исполь-

262_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

зования цоликлонов анти-D-cynep и анти-D, а также универсального реаген­та антирезус Rh₀(D) для выявления антигенов D системы резус эритроци­тов.

Для исследования использовали следующие серии реагентов:

1) цоликлон анти-D-cynep — серия 40 0694;

2) цоликлон анти-D — серия 09 0694;

3) универсальный реагент антирезус Rh₀ (D) для экспресс-метода в про­бирках без подогрева, жидкий — серия 122.

Определение резус-принадлежности крови доноров проводили первично цоликлоном анти-D-cynep реакцией прямой гемагглютинации на плоскости и окончательно реагентом антирезус Rh₀(D) методом в пробирке без подо­грева.

Учитывались следующие параметры: скорость наступления агглютинации, характер агглютинации (от + до ++++), специфичность реакции, выявление слабых форм антигена D (D^u).

Исследовано 3778 образцов крови доноров. Среди них выявлено 418 (11,1 %) резус-отрицательных доноров. Из них при дальнейшем типирова-нии 42 (1,1 %) человека были отнесены к резус-положительным, так как имели фенотип D — С+.

Результаты исследования антигена D эритроцитов доноров с различны­ми типами реагентов (табл. 54) показали существенные преимущества цоли­клонов анти-D-cynep по сравнению с универсальным реагентом антирезус Rh₀ (D): возможность постановки реакции на плоскости, более высокую ско­рость наступления реакции агглютинации со всеми образцами эритроцитов, в основном крупнолепестковый характер агглютинации.

Все 418 резус-отрицательных образцов донорской крови были тестирова­ны на присутствие антигена D цоликлоном анти-D в желатиновом тесте и универсальным реагентом антирезус Rh₀ (D) методом в пробирке без подо­грева. Было выявлено 3 (0,08 %) образца донорской крови, содержащих D^u антиген. Выявляемость D^u антигена цоликлоном анти-D более достоверна, чем реагентом антирезус Rh₀ (D) в связи с тем, что использование иммунных сывороток с неполными антителами в виде «универсального реагента» осно-

Таблица 54

Результаты исследования антигена D эритроцитов доноров с различными типами реагентов

Исследуемые парамгр	Цоликлон антиВ-супер	Универсальный реагент анти-резус Rh0 (D)
Скорость наступления агглютинации	8-10 с	3-4 мин
Характер агглютинации Специфичность реакции	4+ Специфична	3+и4+ Специфична

Система группы крови резус ____ ___ __________263

вано на усилении действия неполных антител высокомолекулярным полиса-харидом полиглюкином. Такой препарат в ряде случаев может вызвать не­специфическую агглютинацию, которая затрудняет трактовку результатов. Цоликлон анти-D абсолютно специфичен и содержащиеся в нем монокло-нальные антитела класса IgG имеют высокий титр (1:512), что позволяет пра­вильно диагностировать слабые формы антигена D (D^u). В большинстве (90 %) случаев для частичного D категории VI характерен генотип CcDee. Лица с частичным антигеном D квалифицируются как резус-положительные доноры и резус-отрицательные реципиенты. Беременным женщинам с частич­ным антигеном D категории VI, когда ожидается рождение ребенка с пол­ным антигеном D, целесообразно назначение антирезусного иммуноглобули-на. С помощью высокоспецифичных моноклональных антител устанавлива­ется гетерогенность частичного D категории VI.

Представляет интерес анализ расхождений в определении резус-фактора у доноров крови. С этой целью сопоставлены результаты работы лаборато­рии станции переливания крови с использованием традиционного и усовершен­ствованного методов.

Первичное определение резус-принадлежности в апреле-октябре 1994 г. проводилось выездной бригадой по заготовке крови с использованием цоли-клонов анти-D-cynep в реакции прямой гемагглютинации на плоскости и окончательно в стационарных условиях — универсальным реагентом анти­резус Rh₀ (D) методом в пробирке без подогрева. В аналогичный период (ап­рель-октябрь 1993 г.) первичное определение резус-принадлежности прово­дилось универсальным реагентом антирезус Rh₀ (D) на выезде и окончатель­ное — пробирочным методом в стационаре. Результаты исследований пред­ставлены в табл. 55. Следует отметить, что все ошибочные определения были получены в выездных условиях при массовой заготовке крови и количестве обследованных доноров свыше 100. Также неблагоприятными факторами яв­лялись неудовлетворительное освещение рабочих мест и низкая температу­ра воздуха в помещениях. Практически пятикратное снижение количества не­правильных определений Rh-фактора на первом этапе обследования при мас­совой заготовке крови при использовании цоликлонов анти-D-cynep в реак­ции прямой гемагглютинации на плоскости позволяет рекомендовать этот метод к внедрению в широкую практику работы службы крови.

6.3.2.7. Экспресс-определение групп крови систем ДВО и резус с использованием набора эритротест-группокарт

Набор Эритротест™-Группокарт (ООО «Гематолог», Москва) предназ­начен для определения АВО и резус (RhD) групп крови человека в лабора­торных и полевых условиях. Определение проводится с использованием ре­акции прямой гемагглютинации и не требует никаких вспомогательных ре­активов и оборудования.


264

Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

Таблица 55

Сравнительная оценка эффективности традиционного и усовершенствованного метода определения резус-принадлежности

крови доноров

Показатель	Традиционный метод		Усовершенствован ный метод
	n	%	n	%
Количество обследованных образцов	2844	100	3778	100
Количество резус-отрицательных образцов крови, выявленных при первичном обследовании	348	12,2	418	11,1
Количество резус-отрицательных образцов крови с фенотипом D-C+ (резус-положительные доноры)	47	1,7	42	1,1
Количество ошибочных определений резус-принадлежности Rh(+)	18	0,6	5	0,1
Количество ошибочных определений резус-принадлежности Rh(-)	11	0,4	6	0,2
Из них с антигеном Du	Определить невозможно		3	0,1
Общее количество неправильных определений резус-фактора на первом этапе обследования при массовой заготовке крови	29	1,0	8	0,2

В состав набора входят:

— карточка Эритротест™-Группокарт;

— пипетка с дозированным объемом капли около 0,020 мл;

— стерильно упакованный скарификатор;

— палочка для смешивания крови с реагентом.

В лунках карточки находятся высушенные моноклональные реагенты анти-А, анти-В, анти-АВ и анти-D, которые немедленно растворяются при добавлении воды. Моноклональные анти-D антитела специфично выявля­ют антиген RhD, независимо от группы АВО. В последней лунке находится растворитель для постановки контроля на неспецифическую аутоагглютина-цию.

Ход определения:

— определение производят в нативной крови с консервантом, в крови без консерванта или в крови, взятой из пальца;

Менее иммуногенные антигены эритроцитов ______ 265

— вскрывают упаковку и достают карточку, не дотрагиваясь до лунок с рабочей поверхностью. Вписывают данные пациента, кроме группы кро­ви;

— в каждую лунку вносят 1 каплю воды (водопроводной или дистилли­рованной), используя вложенную в набор пипетку. Воду наносят на пятно высушенного реагента. Нельзя допускать подсыхания капли;

— вносят в каждую лунку маленькую каплю исследуемой крови. Кровь наносят рядом с каплей реагента, не касаясь его, чтобы избежать загрязнения одного реагента другим. Для взятия крови из пальца используют стериль­ный скарификатор;

— тщательно смешивают кровь с реагентом с помощью палочки, вложен­ной в набор. В каждой лунке смешивание производят только новой палоч­кой. Использование одной палочки для перемешивания в разных лунках не допустимо, так как ведет к загрязнению реагентов и ошибочному определе­нию группы крови;

— сразу покачивают пластинку. Четкая агглютинация наступает через 10-30 с, однако окончательный результат следует учитывать через 3 мин, так как в случае слабых форм антигена А реакция наступает позднее, а агг-лютинаты мельче;

— результат оценивают визуально. В квадраты под каждой лункой впи­сывают результат реакции с соответствующим реагентом (+ или -);

— вписывают группу крови. Заключение о группе крови можно делать только в случае отсутствия реакции в контроле (последняя лунка);

— отрезают по линии лунки с кровью, а карточку сохраняют.

Срок хранения набора Эритротест™-Группокарт — 2 года при темпера­туре 2-8 °С. Допускается хранение в течение 1 года без холодильника, если температура не превышает 25 °С. Хранение и использование незапаянных или поврежденных пакетов не допускается.

6.4. Менее иммуногенные антигены эритроцитов

6.4.1. Фенотипирование эритроцитов по антигенам К и с

Наиболее выраженными антигенными свойствами среди минорных антиге­нов эритроцитов обладают факторы Kell (К) и с (система резус). Фактор Kell (Келл) стоит на втором месте после фактора D в шкале трансфузионно опасных антигенов эритроцитов. Третье место занимает фактор с.

266_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

G. Mollison и соавт. (1993) приводят следующие расчетные данные по имму ногенности:

— К в 3 раза иммуногеннее с;

— К в 25 раз иммуногеннее Fy^a;

— К в 50-100 раз иммуногеннее Jk^a.

Индекс сенсибилизации населения (процент лиц с повышенным риском посттрансфузионного осложнения) к обоим указанным факторам в настоя­щее время высок.

По данным С. И. Донскова (1996), сенсибилизационный индекс населе­ния в отношении фактора К составляет условно 18 % (9 % «первичных» ре­ципиентов + 9 % «первичных» беременных) на каждый расчетный год.

В абсолютных цифрах сенсибилизационный индекс по антигену К систе­мы Kell с учетом 10 предшествующих лет составляет по расчетным данным 8-10 млн человек, т. е. примерно 6-7 % всех потенциальных реципиентов на данную точку отсчета.

С тем, чтобы избежать посттрансфузионных осложнений по антигену К, необходимо выдавать в лечебно-профилактические учреждения только К-отрицательные эритроциты. В кабинетах, отделениях и станциях перели­вания крови целесообразно производить определение антигена К как обяза­тельное у всех доноров наряду с группой и резус-фактором, после чего от­бирать К-положительные образцы крови, не допуская их к выдаче для пе­реливания. К-положительным донорам целесообразно рекомендовать другой вид донорства (плазмы, тромбоцитов, лейкоцитов и др.), но не эритроцитов.

Определение антигена К в эритроцитах производят с помощью общепри­нятых методов исследования:

1) непрямой реакцией Кумбса;

2) желатиновым методом в пробирках;

3) экспресс-методом на плоскости с сывороткой анти-К универсальной.

Для исследования экспресс-методом используют свежие (не более 2 дней хранения), неотмытые или отмытые эритроциты, взятые со дна пробирки после отстаивания от сыворотки (3-я фракция крови), плазмы с консервантом или физиологического раствора. Используют также цельную кровь, взятую из прокола пальца непосредственно перед исследованием.

Ход определения:

— на плоскость помещают 2 капли (0,05-0,06 мл) сыворотки анти-К и каплю эритроцитов в количестве ¹/₃ объема взятой сыворотки;

— капли перемешивают стеклянной палочкой и при плавном периоди­ческом покачивании пластинки наблюдают за ходом реакции в течение 5 мин.

При положительном результате агглютинация эритроцитов появляется к 30 с — 1 мин и в дальнейшем усиливается, при отрицательном результате агглютинация отсутствует. По истечении 3-4 мин в реагирующую смесь до-

Менее иммуногенные антигены эритроцитов 267

бавляют 1-2 капли физиологического раствора для снятия возможной неспе­цифической агрегации эритроцитов и продолжают наблюдение до истечения 5 мин, после чего регистрируют результат.

Распространенность антигена с (система резус) составляет около 80 %. Около 20 % людей не содержат антигена с и являются гомозиготными по ал-лельному антигену С. Соответственно, этим пациентам в 80 % случаев пере­ливают эритроциты, содержащие антиген с, что ведет к сенсибилизации и риску развития посттрансфузионного осложнения. Индекс сенсибилизации населения к антигену с составляет около 32 %.

С тем, чтобы уменьшить индекс сенсибилизации населения и избежать посттрансфузионных осложнений, обусловленных несовместимостью по это­му антигену, целесообразно у каждого резус-положительного реципиента определять с-антиген и при его отсутствии переливать реципиенту кровь до­норов, гомозиготных по антигену С, т. е. с-отрицательных. На станциях и в отделениях переливания крови целесообразно иметь резервную группу та­ких доноров или запас с-отрицательной эритроцитной массы.

Антиген с определяют со стандартной сывороткой анти-с теми же метода­ми, что и антиген D. Для выявления антигена С целесообразно использовать цоликлон «Анти-С-супер» (моноклональные анти-С-антитела). Цоликлон «Анти-С-супер" не содержит антител других специфичностей и не требует проведения контроля растворителя.