Издательский дом Питер
 Скачать 5.79 Mb.
|
|
6.5.2.3. Проба на индивидуальную совместимость крови с применением центрифугирования Ход определения: — помещают 2 капли сыворотки реципиента на дно маркированной пробирки; — добавляют 1 каплю 5 % взвеси трижды отмытых эритроцитов донора в растворе низкой ионной силы — LISS (при отсутствии LISS можно использовать физиологический раствор, в этом случае ухудшается фиксация анти- 274________________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови тел). Методика приготовления 5 % взвеси трижды отмытых эритроцитов приведена в описании постановки непрямой пробы Кумбса; — сразу после смешивания эритроцитов донора и сыворотки реципиента центрифугируют пробирку в течение 15-20 с при 2000 об/мин; — визуально определяют наличие гемолиза в надосадочной жидкости; — аккуратно покачивая пробирку, ресуспендируют клеточный осадок и визуально определяют наличие агглютинатов. Наличие гемолиза и/или аг-глютинатов может означать: 1) несовместимость по системе АВО; 2) присутствие в сыворотке реципиента полнОых холодовых антител иной специфичности (анти-М, анти-N, анти-S и др). 6.5.2.4. Проба на индивидуальную совместимость крови с использованием раствора желатина Необходимо использовать чистый, без хлопьев, прозрачный желатин, застывающий при температуре 4 °С. Желатин нельзя замораживать. Для исключения неспецифической агглютинации эритроцитов раствором желатина целесообразно проверять каждую серию желатина в контроле с несенсибилизированными эритроцитами. Ход определения: Проводят пробу на индивидуальную совместимость крови с применением центрифугирования. Если не выявлено гемолиза и эритроциты образовали гомогенную суспензию после встряхивания пробирки: — подогревают 10 % раствор желатина в водяной бане (46-48 °С) в течение 10 мин; — к смеси эритроцитов донора и сыворотки реципиента (в соотношении 1:2) добавляют 2 капли подогретого 10 % раствора желатина и тщательно перемешивают; — в течение 10 мин инкубируют пробирку при 46-48 °С на водяной бане или в течение 30 мин в термостате; — добавляют 5-8 мл физиологического раствора и аккуратно перемешивают, 1-2 раза перевертывая пробирку; — визуально определяют наличие или отсутствие агглютинации эритроцитов. При отрицательном результате переносят каплю взвеси эритроцитов из пробирки на предметное стекло и микроскопируют при малом увеличении. При выявлении агглютинации кровь донора и реципиента несовместима по антигенам эритроцитов. В качестве отрицательного контроля используют следующие пробы: — смесь эритроцитов донора с желатином и 0,9 % раствором хлорида натрия (в соотношении 1:2:2); — смесь эритроцитов и сыворотки реципиента с желатином (в соотношении 1:2:2). Проведение пробы на индивидуальную совместимость крови _____275 6.5.2.5. Проба на индивидуальную совместимость крови с использованием антиглобулинового реагента Нельзя производить повторное замораживание — оттаивание антиглобулинового реагента. Для контроля качества антиглобулинового реагента целесообразно провести антиглобулиновый тест с резус-положительными эритроцитами, сенсибилизированными IgG (неполными) анти-В-антителами. Ход определения: Проводят пробу на индивидуальную совместимость крови с применением центрифугирования, если не выявлено гемолиза и эритроциты образовали гомогенную суспензию после встряхивания пробирки; — инкубируют пробирку при 37 °С в течение 15 мин при использовании LISS либо 45 мин при использовании физиологического раствора; — центрифугируют пробирку в течение 15-20 с при 2000-3000 об/мин; — визуально определяют наличие гемолиза в надосадочной жидкости; — аккуратно покачивая пробирку, ресуспендируют клеточный осадок и визуально определяют наличие агглютинатов. Наличие гемолиза и/или аг-глютинатов свидетельствует об имеющихся у реципиента полных тепловых антител к антигенам эритроцитов донора; — при отсутствии гемолиза и агглютинации тщательно 3-4 раза отмывают эритроциты, каждый раз используя 5-10 мл физиологического раствора; — удаляют физиологический раствор; — добавляют 1-2 капли антиглобулинового реагента к осадку эритроцитов и тщательно перемешивают; — центрифугируют 15-20 с при 2000-3000 об/мин; — аккуратно ресуспендируют осадок эритроцитов и визуально определяют наличие или отсутствие агглютинации. При отрицательном результате переносят каплю взвеси эритроцитов из пробирки на предметное стекло и микроскопируют при малом увеличении. При выявлении агглютинации кровь донора и реципиента несовместима по антигенам эритроцитов. В качестве отрицательных контрольных проб используют: 1) смесь 5 % взвеси тест-эритроцитов с 0,9 % раствором хлорида натрия (в соотношении 1:2) — контроль на спонтанную агглютинацию; 2) смесь 5 % взвеси тест-эритроцитов с антиглобулиновым реагентом (в соотношении 1:2) — контроль аутосенсибилизации. Контроль активности антиглобулинового реагента (всегда положительная реакция) — смесь 5 % взвеси донорских эритроцитов группы О (I) D+, сенсибилизированных антирезусной сывороткой (содержащей анти-В-антитела класса IgG), и антиглобулинового реагента (в соотношении 1:2). Контроль специфичности антиглобулинового реагента (всегда отрицательная реакция) — смесь 5 % взвеси донорских эритроцитов группы О (I) D- 276_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови (после инкубации с антирезусной сывороткой в течение 45 мин) и антигло-булинового реагента (в соотношении 1:2). Антиглобулиновый реагент хранят замороженным при -20 °С (сухой реагент можно хранить при комнатной температуре). Недопустимо повторное замораживание — оттаивание реагента. Причины ложноположителъных результатов: — присутствие аутоантител на поверхности тест-эритроцитов; — тест-эритроциты содержат микробные примеси; — нарушение режима центрифугирования (механическое повреждение мембраны эритроцитов при чрезмерной нагрузке). Причины ложноотрицателъных результатов: — тест-эритроциты плохо отмыты или остатки белков сыворотки присутствуют на стенках пробирки; — нарушение режима отмывания или инкубации; — потеря активности сыворотки или тест-эритроцитов в процессе хранения; — низкая активность антиглобулинового реагента; — недостаточное время инкубации. 6.6. Исследование аллоантител к антигенам эритроцитов 6.6.1. Общие положения На наличие аллоантител к антигенам эритроцитов исследуется кровь доноров с гемотрансфузиями и/или беременностями в анамнезе. При обнаружении аллоантител кровь или плазма донора не должна использоваться для переливания (допускается применение отмытых или размороженных эритроцитов). Сыворотку крови аллосенсибилизированных доноров целесообразно использовать для изготовления типирующих реагентов. Исследование аллоантиэритроцитарных антител у пациентов с гемотрансфузиями и/или беременностями в анамнезе проводится перед каждым переливанием эритроцитсодержащих сред. У беременных женщин исследование сыворотки на содержание антител к антигенам эритроцитов проводят в первые 16-20 нед беременности, в случае отсутствия антител в сыворотке повторно — в 30-32 нед. При обнаружении антител или наличии в анамнезе гемотрансфузий, выкидышей, мертво-рождений, либо гемолитической болезни новорожденных исследование антител проводят в динамике ежемесячно, а также после родов. Исследование аллоантител к антигенам эритроцитов 277 При несовпадении с группой крови мужа у женщины с группой крови 0(1), А (II) или В (III) исследуют в сыворотке крови содержание иммунных анти-А- и анти-В-антител. При первичном скрининге сывороток на антитела к антигенам эритроцитов удобнее пользоваться образцами эритроцитов следующей специфичности: — эритроциты групп крови А (II) и В (III) — для выявления иммунных анти-А- и анти-В антител; — эритроциты группы крови О (I), содержащие максимальный набор антигенов систем резус и Kell (Келл) (DСсЕеКк), — для первичного поиска антител; — эритроциты группы крови О (I) фенотипа MN, MM, NN, Р — для выявления антител к антигенам систем MNS и Р. В случае отсутствия типированных консервированных эритроцитов для первичного поиска антител возможно использование смеси 5-7 образцов группы крови О (I) D+ и 5-7 образцов О (I)D-. Для установления специфичности антител, выявленных при первичном скрининге, необходимо использовать панель эритроцитов, включающую образцы: ВСсЕеКк, ССеекк, ссЕЕкк; ссееКК, ссеекк, Вссеекк. При установлении специфичности, как правило, необходимо типирование эритроцитов лица, в сыворотке которого обнаружены антитела. Клиническое значение имеют только «тепловые» (вступающие в реакцию при температуре 37 °С) аллоантитела (табл. 57). 6.6.2. Методы исследования антител к антигенам эритроцитов Первичное исследование антител в сыворотках осуществляют реакцией конглютинации с 10 % раствором желатина с образцами эритроцитов фенотипа DСсЕеКк или смесью эритроцитов 5-7 доноров группы О (I)D+ и 5-7 доноров О (I)D- с оценкой результата при микроскопировании. В том случае, когда антитела не выявились, а в анамнезе были множественные гемот-рансфузии или осложнения беременности, исследование антител повторяют в антиглобулиновом тесте. Оптимально пользоваться стандартными эритроцитами группы О (I) различного фенотипа: CcDEe, CcDee, CCDee, ccDEE, ccDee, Ccddee, ccddEe. Среди резус-положительных эритроцитов целесообразно иметь образцы гомозиготные и гетерозиготные по антигенам С и Е, т. е. содержащие и не содержащие антигены с и е. 278 Глава 6. Иммунологические основы переливания крови Таблица 57 Клиническая значимость аллоантител [G. Garratty, 1998]
Среди резус-отрицательных эритроцитов следует иметь образцы, различные по антигенам системы Даффи, Келл-Челлано, Кидд. Кроме того, все стандарты должны быть типированы по системе MNSs, Pp, Lewis и др. Если антитела к антигенам эритроцитов выявлены, специфичность их подтверждается в лаборатории, имеющей панель типированных эритроцитов, в антиглобулиновом тесте. Для получения более точных результатов целесообразнее посылать на типирование не только сыворотку, но и эритроциты лица, у которого обнаружены антитела. Ввиду того, что аллоиммунные антитела могут быть как полной, так и неполной формы, их следует выявлять, используя разные методы при различных температурных режимах. Для выявления неполных антител необходимо проводить непрямую пробу Кумбса или реакции с использованием коллоидов (желатин, полиглюкин). Для выявления полных антител проводят реакцию солевой агглютинации при разных температурах: 37°, 20°, 4°С. Заключение о наличии, а также о форме и специфичности антител делают по результатам реакции во всех методах. Если положительная реакция выявлялась с различными образцами эритроцитов только при проведении непрямой пробы Кумбса (или реакции с применением желатина, либо полиглюкина), это значит, что в исследованной сыворотке содержатся только неполные антитела. Если положительная реакция выявилась при непрямой пробе Кумбса (или в реакции с применением желатина, или полиглюкина) и одновременно в реакции солевой агглютинации, это значит, что в сыворотке содержатся как Исследование аллоантител к антигенам эритроцитов 279 неполные, так и полные антитела. Полные антитела могут быть тепловыми, тогда положительный результат выявится при температуре 37°С, или холо-довыми, давшими положительный результат при 20°С или 4°С. Если сыворотка дала положительный результат только в реакции солевой агглютинации в пробирках, это значит, что она содержит лишь полные антитела — тепловые или холодовые (в зависимости от того, при какой температуре выявилась агглютинация). Если агглютинация эритроцитов не наблюдается ни в одной из этих проб, это говорит об отсутствии как полных, так и неполных аллоиммунных антител к антигенам, содержащимся в стандартных эритроцитах, которые были использованы при этом исследовании. Тесты, применяемые в специализированных лабораториях для устранения клинически незначимых реакций антиген — антитело, в обобщенном виде представлены в табл. 58. Следует иметь в виду, что при уменьшении реактивности «нежелательных» антител может также снижаться и реактивность клинически значимых антител. Все серологические реакции важно выполнять с положительным и отрицательным контролем. Специфичность антител устанавливается в зависимости от результатов реакции со стандартными эритроцитами, содержащими разные антигены. Это заключение необходимо сделать для полных и неполных антител в отдельности. Большую роль при определении специфичности антител может сыграть определение антйгенной структуры эритроцитов самого больного. Если такое исследование было возможным, то это очень облегчило бы решение вопроса о специфичности антител, так как у больного могут быть антитела только к тем антигенам, которые не содержатся в его собственной крови. Неполные антитела в одной и той же сыворотке могут иметь как одну, так и различную специфичность. При одновременном присутствии в сыворотке неполных и полных антител они также могут быть одной или различной специфичности. Полные антитела большей частью бывают моноспецифичными. Таким образом, исследование сыворотки больного с применением разных методов при наличии стандартных эритроцитов, типированных по различным аллоантигенам, позволяет решить вопрос о характере иммунизации. Если у больного выявлены аллоиммунные антитела, то, зная их специфичность, можно обеспечить совместимость при переливании крови специальным выбором донора. Если у больного выявлены антитела, но определить их специфичность невозможно, например из-за недостаточного набора стандартных эритроцитов, совместимость переливаемой крови можно обеспечить индивидуальным подбором донора. 280 Глава 6. Иммунологические основы переливания крови Таблица 58 Способы устранения клинически незначимых реакций антиген-антитело [Reid М. Е., Ellisor S. S., 1989]
Исследование аллоантител к антигенам эритроцитов __ ___281 При обнаружении антител к антигенам эритроцитов выписывают ответ, который переносится в донорский журнал или историю болезни. В ответе обязательно указывается, что в случае необходимости гемотрансфузионной терапии индивидуальный подбор крови осуществляют с применением анти-глобулинового теста. Бланк ответа остается у донора или больного, хранится в течение всей жизни и предъявляется при госпитализации. Данные об эффективности использования различных методов определения антиэритроцитарных антител приведены в табл. 59. Метод выявления антител с применением 33 % раствора полиглюкина мало пригоден для поиска антиэритроцитарных антител: во-первых, метод не позволяет выявлять антитела любой специфичности, присутствующие в сыворотке в низком титре; во-вторых, не обеспечивает выявления антител специфичности Duffy и Kidd, а также некоторых других систем. Метод с применением желатина с учетом результата при микроскопиро-вании позволяет выявить большинство специфичностей антител, в том числе и присутствующих в сыворотках в низком титре. Однако нужно помнить, что встречаются антитела (кроме антител системы ABO, MNS, Р), взаимодействующие с эритроцитами только в антиглобулиновом тесте. Определение антител с применением 33 % раствора полиглюкина и желатина аналогично приведенному в разделе 6.5. В качестве тест-эритроцитов используют панель стандартных типированных эритроцитов или смесь эритроцитов от 4-5 доноров с резус-положительной и от 4-5 доноров с резус-отрицательной принадлежностью крови группы О (I). Тест-эритроциты не должны содержать аутоантител (прямой антиглобулиновый тест — отрицательный). Длительность и трудоемкость выполнения антиглобулинового теста в обычной постановке затрудняет возможность его широкого использования при поиске антител. Для сокращения времени проведения исследования и повышения его чувствительности целесообразно использовать модификации антиглобулинового теста: 1) с использованием раствора низкой ионной силы (LISS); 2) «спин»-метод. 6.6.2.1. Непрямой антиглобулиновый тест с использованием раствора ионной силы (LISS) Приготовление LISS: 1) 9 г глицина растворить в 250 мл дистиллированной воды, к нему по каплям добавлять 0,1 М раствор NaOH до рН 6, 7; 2) приготовить 0,15 М раствор NaH2PO4 (1,8 г соли на 100 мл дистиллированной воды; 3) приготовить 0,15 М Na2HPO4 (2,13 г соли растворить в 100 мл дистиллированной воды; 4) смешать растворы (2) и (3) до рН 6,7. Взять 10 мл смеси; 282 Глава 6. Иммунологические основы переливания крови Таблица 59 |