Издательский дом Питер
 Скачать 5.79 Mb.
|
|
Эффективность различных методов исследования для обнаружения антител к антигенам эритроцитов в сыворотке крови человека [Климова К. Н. и др., 1990] Специфичность Методы выявления
Примечание. Методы: 1 — на плоскости в солевой среде; 2 — экспресс с 33 % полиглюкином; 3 — конглютинация с желатином с микроскопированием; 4 — антиглобулиновый тест. 5) 0,89 г хлорида натрия растворить в 50 мл дистиллированной воды; 6) смешать 250 мл раствора (1), 10 мл раствора (4) и 50 мл раствора (5); 7) довести объем до 500 мл дистиллированной водой. Приготовленный таким образом раствор разливают по 50 мл во флаконы, закрывают резиновыми пробками, завальцовывают и стерилизуют 30 мин при 1,2 атм. Стерильный раствор может храниться при 4 °С в течение 2 лет. Контроль качества реактива проводится визуально: бесцветный, прозрачный раствор пригоден для использования; при появлении хлопьев раствор использовать нельзя. Проведение непрямого антиглобулинового теста с LISS Ход определения: — эритроциты отмывают 1 раз 0,9 % раствором хлорида натрия и 1 раз LISS, объем добавляемых растворов должен быть в 20 раз больше объема эритроцитов; — готовят рабочую (10-20 %) взвесь эритроцитов в LISS; — в пробирке смешивают: 1 объем взвеси стандартных эритроцитов и 2 объема исследуемой сыворотки; — в качестве отрицательного контроля используют сыворотку, заведомо не содержащую антиэритроцитарные антитела; — в качестве положительного контроля используют сыворотку, заведомо содержащую антитела к антигенам тест-эритроцитов; — опыт и контроли инкубируют 7 мин в водяной бане при температуре 46-48 °С; Исследование аллоантител к антигенам эритроцитов __________283 — после инкубации эритроциты отмывают 3-4 раза 100-кратным избытком 0,9 % раствора хлорида натрия. О правильности отмывания эритроцитов свидетельствует отрицательная проба на белок в надосадочной жидкости с 20 % раствором сульфосалициловой кислоты; — готовят 10 % взвесь отмытых сенсибилизированных эритроцитов в растворе 0,9 % хлорида натрия; — смешивают на плоскости 1 каплю 10 % взвеси эритроцитов и 2 капли антиглобулиновой сыворотки. Результат оценивают в течение 10 мин при покачивании планшета. Наличие агглютинации в опытной пробе свидетельствует о содержании в исследуемой сыворотке антител к антигенам эритроцитов. Установить специфичность этих антител можно только при использовании панели типирован-ных эритроцитов. Отсутствие агглютинации (гомогенное окрашивание капли) свидетельствует о том, что исследуемая сыворотка не содержит антител к антигенам эритроцитов. 6.6.2.2. «СПИН»-метод для оценки результатов прямого и непрямого антиглобулиновых тестов В качестве контроля в «спин»-методе используют: для непрямого анти-глобулинового теста — смесь 1 объема отмытых 4-5 раз исследуемых эритроцитов и 2 объемов антиглобулиновой сыворотки, а для прямого антиглобу-линового теста — смесь 1 объема отмытых 4-5 раз исследуемых эритроцитов и 2 объемов 0,9 % раствора хлорида натрия. Обе контрольные пробы центрифугируют в течение 1 мин при 1000 об/мин. Контроли должны быть всегда отрицательными и свидетельствовать о соблюдении режима центрифугирования. Ход определения: — смешивают в пробирке 1 объем 5 % взвеси отмытых сенсибилизированных эритроцитов и 2 объема антиглобулиновой сыворотки; — центрифугируют пробирку со смесью 1 мин при 1000 об./мин; — пробирку встряхивают и визуально оценивают результаты исследования, а при получении отрицательного результата — каплю исследуемой взвеси переносят на стекло и микроскопируют при малом увеличении. Наличие агглютинации при визуальном или микроскопическом наблюдении говорит о положительном результате: исследуемые эритроциты сенсибилизированы антителами. Отсутствие агглютинации свидетельствует об отрицательном результате: эритроциты антителами не сенсибилизированы. 6.6.2.3. Феномен «прозоны» При очень высокой степени иммунизации организма (чаще антигеном D системы резус) образующиеся резус-антитела иногда дают феномен «прозо- 284_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови ны» (в литературе также встречается синоним — феномен «зоны»). Этот феномен заключается в том, что сыворотка крови таких лиц, будучи взята неразведенной или в небольшом разведении (1:2), может не дать или дать слабую положительную реакцию при ее испытании с резус-положительными эритроцитами (см. раздел 6.2.3.5. и рис. 21). Однако, если такую сыворотку развести, то при некотором разведении (чаще всего 1:8, 1:16, иногда и более) резус-антитела в ней становятся активными и дают хорошо выраженную положительную реакцию. Реже всего феномен зоны бывает выражен в методе конглютинации с желатином или при испытании сыворотки непрямой пробой Кумбса. Поэтому, а также ввиду большей ее чувствительности, проба Кумбса служит очень ценной реакцией для выявления неполных резус-антител. Если все методы, включая непрямую пробу Кумбса, не выявляют в сыворотке резус-антител, а в анамнезе у лица, кровь которого испытывается, есть указания на сенсибилизацию к резус-антигену, то для исключения феномена зоны следует испытать эту сыворотку, взятую в разведениях. Если при наблюдении результата в каких-либо разведениях сыворотки отмечается положительная реакция, следовательно, в испытуемой сыворотке есть антитела. В этих случаях для дальнейшего исследования сыворотки ее следует развести, при этом выбрать то разведение, в котором наблюдалась наиболее выраженная положительная реакция. Для разведения применяют изотонический раствор хлорида натрия. Исследование разведенной сыворотки проводится так, как описано выше для каждого метода. При установлении высоты титра учитывается общее разведение нативной сыворотки, начиная с 1:2. В обобщенном виде способы «усиления» реакции антиген-антитело для обнаружения и идентификации антиэритроцитарных антител представлены в табл. 60. 6.6.2.4. Получение крови для приготовления стандартных эритроцитов Каждое учреждение службы крови, а также лаборатории в других лечебно-профилактических учреждениях, где производятся определение резус-принадлежности и изготовление сывороток антирезус и других антисывороток, должны иметь постоянных доноров, у которых берется кровь для приготовления стандартных эритроцитов. Стандартные эритроциты применяют в обязательном порядке при определении группы крови АВ0, резус-принадлежности, выявлении антиэритроцитарных антител, а также как контроль при изготовлении стандартных сывороток, предназначенных для определения группы крови АВ0, сывороток антирезус, различных тест-сывороток для обнаружения антигенов эритроцитов. Виды стандартных эритроцитов 1. При определении группы крови необходимо иметь контрольные эритроциты трех групп: 0, А (подгруппа А,) и В. 285 Исследование аллоантител к антигенам эритроцитов Таблица 60 Способы «усиления» реакции антиген-антитело [Reid М. Е., Ellisor S. S., 1989]
286 Глава 6. Иммунологические основы переливания крови 2. При приготовлении стандартных изогемагглютинирующих сывороток следует использовать кровь доноров, указанных в пункте 1, и дополнительно иметь доноров подгрупп А2, Аз, Ах, А2В, АВ2. 3. При определении резус-принадлежности необходимы контрольные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты. 4. При изготовлении стандартных сывороток антирезус и при выявлении резус-антител необходимо иметь контрольные эритроциты доноров, указанные в пункте 3, и дополнительно подобрать доноров групп О, А, В, АВ так, чтобы среди образцов крови было по одному резус-положительному и одному резус-отрицательному образцу. Эти доноры должны быть исследованы дополнительно и, в зависимости от наличия у них различных антигенов резус, число доноров должно быть пополнено за счет доноров группы 0(1) так, чтобы на эритроцитах доноров этой группы обязательно имелись антигены резус D, С, Е, с, е, Cw порознь или в различных сочетаниях, а также антигены систем Kell, Duffy и других систем групп крови. 5. При изготовлении тест-сывороток различной специфичности необходимо иметь контрольные эритроциты доноров, указанные в пунктах 3 и 4 и типи-рованные по антигенам различных эритроцитарных систем: гомозиготные, гетерозиготные и отрицательные по различным антигенам. Кровь для приготовления стандартных эритроцитов берут у доноров из пальца или из вены не чаще 3 раз в неделю (в зависимости от потребности). Каждый донор, у которого берут кровь малыми дозами для приготовления стандартных эритроцитов, должен находиться на учете отделения донорских кадров, где на него должен быть заведен донорский журнал. Если лаборатория, для которой донор дает кровь малыми дозами, не входит в состав учреждения службы крови, донор находится на учете непосредственно в этой лаборатории. При зачислении в доноры (в дальнейшем каждые 4 мес) донор должен быть осмотрен врачом-терапевтом, у него проверяется содержание гемоглобина и число эритроцитов. Взятие крови допускается при условии содержания гемоглобина не менее 120 г/л для женщин и 130 г/л — для мужчин. В лабораториях, где у доноров берут кровь для приготовления стандартных эритроцитов, должна быть заведена книга учета взятия крови по следующей форме: Имя Отчество Фамилия __________ _______ Группа крови ___________ Фенотип по различным системам эритроцитов
Исследование аллоантител к антигенам эритроцитов 287 Взятие крови количественно подытоживается за 1,5-2 мес. Итог подписывается руководителем лаборатории или отдела, для нужд которого бралась кровь. Руководитель лаборатории или отдела на основании записи в книге учета взятия крови дает донору справку, в которой должен указать количество взятой крови и за какой период времени взята кровь. Справку подписывает руководитель лаборатории или отдела. Принимая во внимание многократность и характер процедуры взятия крови у доноров, компенсацию за взятую у них кровь устанавливают в тройном размере по сравнению с суммой компенсаций, установленной для доноров, дающих кровь для переливания больным. На доноров, у которых берут кровь малыми дозами для приготовления стандартных эритроцитов, распространяются все льготы как для доноров, дающих кровь для переливания больным, согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов Федерации. Выходной день предоставляется донору за суммарное взятие крови в количестве не менее 100 мл. 6.6.2.5. Рациональный подход к определению аллоантиэритроцитарных антител у доноров и реципиентов гемокомпонентов Аллосенсибилизация антигенами эритроцитов служит одной из причин тяжелых посттрансфузионных реакций и осложнений в лечебных учреждениях. Для обеспечения безопасности гемотрансфузионной терапии важное значение имеет своевременное выявление алллоантиэритроцитарных антител у доноров и реципиентов гемокомпонентов. В то же время определение антител требует значительных затрат труда и реактивов, поэтому необходим рациональный подход к проведению такого скрининга. Целью исследования явилось сопоставление различных методов определения аллоантиэритроцитарных антител для оптимизации мониторинга аллоиммунизации доноров и реципиентов гемокомпонентов. Материалом для исследования служили 166 образцов сыворотки крови доноров гемокомпонентов и 64 образца сыворотки крови больных (32 кар-диохирургических, 18 гематологических пациентов и 14 пострадавших с глубокими ожогами) после проведения гемотрансфузионной терапии. В среднем пациентам переливали 10-12 доз отмытых эритроцитов или эритроцитного концентрата. Скрининг полных аллоантиэритроцитарных антител проводили методом агглютинации в солевой среде. Неполные аллоантитела определяли экспресс-методом с применением 33 % раствора полиглюкина (ЭМП) , методом конглютинации с применением 10 % раствора желатина и с микро-скопированием проб на этапе оценки результатов исследования (МКЖ), а также в непрямом антиглобулиновом тесте (HAT). Использовали 3 вариан- |