Издательский дом Питер

• Название: Издательский дом Питер
• Анкор: Zhiburt_E_B_Transfuziologia.doc
• Дата: 31.01.2017
• Размер: 5.79 Mb.
• Имя файла: Zhiburt_E_B_Transfuziologia.doc
• Тип: Учебник; #1519
• страница: 31 из 77

6.4.2. Фенотипирование эритроцитов по антигенам системы Lewis

Выявление Lewis-антигенов Le% Le^b ферментным методом с использованием неполных стандартных антител анти-Lе(а), анти-Le(b) состоит из приготов­ления рабочего ферментного раствора, обработки (энзимирования) этим ра­створом исследуемых и стандартных (контрольных) эритроцитов и постанов­ки реакции агглютинации энзимированных эритроцитов.

Ход определения состоит из двух процедур.

1. Приготовление рабочего ферментного раствора:

— для приготовления рабочего ферментного раствора обычно использу­ют протеазу С (комплекс протеаз, продуцируемый культурой Arc. chrysogenum);

— возможно также использование любой другой серологически активной протеазы микробного (субтилизин, проназа) или растительного (папаин, бро-мелин) происхождения;

— необходимый объем 0,1 % ферментного раствора готовят путем раство­рения в течение нескольких минут при комнатной температуре навески ис-

268_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

пользуемого ферментного препарата в физиологическом растворе хлорида натрия (например, 10 мг фермента растворяют в 10 мл физиологического раствора). Раствор микробных протеаз готов для использования сразу же после растворения фермента. Для развития ферментативной активности ра­створа папаина его выдерживают 1 ч при комнатной температуре после ра­створения препарата. Годность приготовленного раствора микробной проте-азы (протеазы С), сохраняемой при 4-8 °С, — 1 нед, раствора папаина — 48 ч. Порошкообразные ферментные препараты при 4-8 °С сохраняют свою актив­ность в течение нескольких лет.

2. Энзимирование эритроцитов:

— исследуемые и стандартные (Le^a+b-, Le^a-b+) эритроциты дважды отмы­вают физраствором путем центрифугирования;

— к 1 объему осадка отмытых эритроцитов добавляют 5 объемов фер­ментного раствора (например, к 3 каплям эритроцитов добавляют 15 капель ферментного раствора);

— эритроциты и ферментный раствор перемешивают;

— пробирки с ингредиентами помещают в суховоздушный термостат с температурой 37 °С на 45 мин или на 30 мин в водяную баню с той же темпе­ратурой;

— после энзимирования эритроциты дважды отмывают от ферментного раствора;

— готовят 5-7,5 % рабочую взвесь энзимированных эритроцитов в фи­зиологическом растворе хлорида натрия.

.?. Постановка реакции агглютинации энзимированных эритроцитов:

— для каждого образца исследуемых и стандартных (контрольных) эрит­роцитов на плоскость помещают по 1 капле сыворотки анти-Ье(а) и анти-Le(b);

— к помещенным на плоскость реагентам добавляют по 1 капле энзими­рованных эритроцитов;

— реагенты перемешивают;

— инкубируют (в покое) 10 мин при комнатной температуре;

— учитывают результаты реакции агглютинации энзимированных эрит­роцитов невооруженным глазом или с помощью 4-кратной лупы (при хоро­шем естественном или достаточном искусственном освещении при осторож­ном покачивании плоскости) по наличию или отсутствию агглютинации.

Результат учитывается как истинный после проверки контрольных проб, т. е. при наличии агглютинации с положительным контролем и ее отсутствии с отрицательным контролем.

Распространенность фенотипов системы Lewis у доноров на северо-запа­де России Le^a-^b- - 20 %, Le^a+b- - 3-5 %, Le^a-b+ - 70 %, Le^a+b+ - встречается редко.

Менее иммуногенные антигены эритроцитов___________________269

6.4.2.1. Система антигенов Lewis как маркер риска ишемической болезни сердца

Связь эритроцитарного фенотипа с предрасположенностью (или резис-тентностью) к различным патологическим процессам общеизвестна и в пер­вую очередь относится к антигенным системам АВО и резус. В последнее время привлекает к себе внимание система Lewis, антигены которой в отличие от других систем эритроцитарных антигенов не синтезируются эритроидными клетками-предшественниками, а абсорбируются из плазмы. Антигены систе­мы Lewis Le^a и Le^b представляют собой гликосфинголипиды и экспрессиру-ются во многих тканях организма, в частности на эпителии дыхательных, мо-чевыводящих путей, желудочно-кишечного тракта, слюнных желез и т. д. Количество антигенов Lewis на одном эритроците — 4500-7300 молекул. Для сравнения: на одном эритроците экспрессировано 8х10⁵-2х10^б антигенов си­стемы АВО и 2x10⁶ антигенов системы резус.

Система Lewis названа по фамилии женщины, в крови которой впервые были обнаружены aнти-Le-антитела. Антигены системы Lewis — продукт гена FUT3, расположенного на коротком плече 19-й хромосомы (19 р 13.3) и коди­рующего сс-1, 3/4-фукозилтрансферазу. Три главных фенотипа (Le^a+b-, Le^a-b+ и Le^a-b-) — результат взаимодействия двух генетически независимых локу-сов: FUT3 и системы секреции(5есге1х>г, Se-se). Ген Seрасположен на длин­ном плече 19-й хромосомы и кодирует сс-1,2-фукозилтрансферазу. Частич­ный ген Se (Se^w) может приводить к фенотипу Le^a+b+. Подробно структур­но-функциональный анализ системы Lewis проведен в работе S. Henry и со-авт. (1995), которые связывают полиморфизм систем Le и Se с различными видами преимущества при адаптации к факторам окружающей среды. Рас­пространенность фенотипов Lewis имеет существенные региональные особен­ности. В большинстве стран Западной Европы антиген Le^a встречается у 20 % населения, в Латинской Америке — у 11 %, на юге Китая — у 15 %. У 20-25 % жителей островов Тихого океана встречается фенотип Le^a+b+, редкий в Ев­ропе и Америке.

В первые десятилетия изучения антигенов Lewis четкой связи с заболева­ниями не было установлено. Однако в последние годы установлено, что ан­тигены Lewis участвуют в воспалительном процессе, связывая с эндотелием нейтрофилы и моноциты, которые затем мигрируют через эндотелий во вне-сосудистые очаги воспаления. Le^a является контррецептором к Р-селектину и, возможно, L-селектину. Лица с фенотипом Le^a-b- могут иметь дефект внут­риклеточного синтеза фукозилтрансфераз, а соответственно — дефект про-тивоинфекционной резистентности, так как GDP-фукоза — важный компо­нент липополисахаридов клеточной стенки бактерий.

Известно, что антиген Le^b способствует связыванию Helicobacterpyloriс эпителием желудка, а отсутствие этого антигена сочетается с рецидивами

270_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

мочеполовых инфекций у женщин. При раке легких смертность наиболее низ­ка у пациентов с фенотипом Le^a-b+. Антиген Le^a — рецептор Candidasp., В. pertussis(токсин), 5. aureus(адгезин) [Carton J. P., Colin Y., 2001].

Особый интерес для внутренней медицины представляет выявление свя­зи фенотипа Le^a-b- с повышенным риском ишемической болезни сердца (ИБС). У мужчин с фенотипом Ье^а-b- зарегистрировано повышение индек­са массы тела, увеличение частоты диабета и гипертензии, высокий уровень сы­вороточных триглицеридов и снижение содержания липопротеидов высокой плотности.

Фенотип Le^a-b- у белых мужчин с группами крови А, В и АВ сочетается с повышенным содержанием фактора VIII и фактора Виллебранда и рассмат­ривается в качестве маркера риска будущей атеротромботической болезни.

Обсуждается вопрос возможных генетических связей системы Lewis с ре-зистетностью к инсулину. Есть данные о том, что умеренные дозы алкоголя имеют значение в профилактике ишемической болезни сердца у мужчин с фенотипом Le^a-b-.

Представляет интерес оценить распространенность антигенов и феноти­пов системы Lewis среди здоровых доноров в Санкт-Петербурге, а также у пациентов с ишемической болезнью сердца.

Обследовано 60 доноров крови (42 мужчины и 18 женщин, средний воз­раст 22,3±1,4 лет) и 74 пациентов с ишемической болезнью сердца (48 муж­чин и 26 женщин, средний возраст 59,5±1,6 лет). Фенотип Lewis определяли с использованием специфических сывороток (Гемостандарт, Москва). 86 об­разцов параллельно тестировали с использованием реагентов DiaMed (Швей­цария). Расхождений результатов не выявлено.

При обработке результатов частоту встречаемости фенотипов Lewis вы­ражали в процентах. Достоверность различий в распределении фенотипов оп­ределяли по критерию с². Величину относительного риска, определяющую во сколько раз вероятность заболевания выше для носителя данного антигена, чем для других членов популяции, определяли по формуле: RR=ad/bc, где величины а, b, с, d соответствуют таковым при построении сетки 2г2. Также определяли этиологическую фракцию (EF), биологический смысл которой зак­лючается в определении части носителей фенотипа, у которых разовьется заболевание, и протективную фракцию (PF) — части носителей фенотипа без риска развития ИБС.

Результаты исследования представлены в табл. 56. Обращает на себя вни­мание достаточно редкая распространенность фенотипа Le^a+b- в обеих иссле­дуемых группах. Фенотип Le^a-b- встречается у больных ИБС втрое чаще, чем у здоровых доноров. Напротив, распространенность фенотипа Le^a-b+ среди пациентов значительно снижена.

Полученные результаты позволяют констатировать наиболее выраженную связь антигенов Lewis с предрасположенностью /резистентностью развития


271

Проведение пробы на индивидуальную совместимость крови

Таблица 56 Фенотип Lewis у больных ИБС (п=74) и здоровых доноров (п=60)

Фенотип	Контроль		Пациенты		X2	Р	RR	EF	PF
	%	абс.	%	абс.
Lea-b-	20,3	14	67,5	50	25,9	<0,0001	6,8	0,584	_
Lea+b-	3,3	2	2,7	2	-	-	-	-	-
Lea-b+	73,3	44	24,3	18	32,0	<0,0001	0,11	-	0,663
Lea+b+	0	0	5,4	4	0,367	>0,5	-	-	-

ИБС по сравнению с другими иммуногенетическими маркерами эритроци-тарных систем.

Таким образом, при определении риска ИБС целесообразно исследовать фенотип Lewis. Фенотип Le^a-b- — маркер повышенного риска развития ИБС. Фенотип Le^a-b+ — маркер относительной устойчивости к развитию ИБС. Перспективны исследования связи системы Lewis с патогенетическими меха­низмами заболеваний внутренних органов.

6.5. Проведение пробы на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента

6.5.1. Общие положения

Целью пробы на индивидуальную совместимость является предотвраще­ние трансфузий несовместимых эритроцитов. Тестирование сыворотки реци­пиента с эритроцитами предполагаемого донора — наиболее надежный спо­соб выявления антител, способных вызвать повреждение перелитых эритро­цитов, посттрансфузионные реакции, в том числе и гемолитические. Проведе­ние такой пробы позволяет:

1) подтвердить АВО-совместимость донора и реципиента;

2) выявить все антитела в сыворотке реципиента, направленные против антигенов эритроцитов донора.

Для получения сыворотки у больного берут 4-5 мл крови в сухую про­бирку, на которой надписывают фамилию и инициалы реципиента, группу его крови и дату. При этом врач должен лично убедиться в том, что надписи

272_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

на пробирке сделаны правильно и относятся к тому больному, у которого взята эта кровь.

Через 1-2 мин пробирку с кровью сильно встряхивают для отделения свертка от стенок пробирки или обводят его сухой стеклянной палочкой. После ретракции свертка от него отделяется сыворотка, которая и служит для про­бы на совместимость.

Если необходимо ускорить отделение сыворотки, пробирку с кровью цен­трифугируют около 5 мин при 2000-3000 об/мин.

Могут возникнуть трудности в получении сыворотки у пациентов с пони­женной свертываемостью крови или получающих гепарин. Свертывание образца может быть достигнуто путем добавления раствора тромбина (50 ед./мл): 1 кап­лю на 1 мл образца крови. Можно использовать сухой тромбин — вносить на кончике предметной палочки. Для нейтрализации гепарина к 4 мл цельной крови добавляют 1 (при необходимости больше) каплю 1 % раствора про-тамин-сул ьфата.

Кровь донора получают из контейнера, который подготовлен для пере­ливания. Для этого кровь выпускают через иглу в небольшом количестве (5-10 капель) в пробирку или на пластинку, на которой будет производиться проба. На пробирке (пластинке) надписывают фамилию, инициалы донора, группу его крови и номер контейнера. При этом врач должен лично убе­диться в том, что на пробирке (пластинке) правильно написаны все сведения о доноре, имеющиеся на контейнере, из которого получена эта кровь.

6.5.2. Методы проб на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента

6.5.2.1 Проба на индивидуальную совместимость крови по антигенам системы АВО

Ход определения:

— на чистую сухую поверхность планшета или пластинки при комнат­ной температуре наносят и смешивают в соотношении 10:1 сыворотку реци­пиента и кровь донора;

— периодически покачивая планшет, наблюдают за ходом реакции;

— при отсутствии агглютинации в течение 5 мин кровь совместима. На­личие агглютинации указывает на несовместимость крови реципиента и до­нора. Такую кровь переливать нельзя. В сомнительных случаях результат пробы контролируют под микроскопом: при наличии монетных столбиков, исчезающих после добавления теплого (37 °С) 0,9 % раствора хлорида на­трия, кровь совместима; если в капле смеси видны агглютинаты, не расходя­щиеся при добавлении теплого 0,9 % раствора хлорида натрия, кровь не со­вместима.

Проведение пробы на индивидуальную совместимость крови__________273

6.5.2.2. Проба на совместимость крови по антигенам системы резус с применением 33 % раствора полиглюкина

Поскольку чувствительность этой пробы низкая, применять ее в стацио­нарных лечебных учреждениях не рекомендуется. Допускается выполнение пробы на совместимость с применением 33 % раствора полиглюкина при не­обходимости проведения переливания крови в экстремальных условиях.

Приготовление 33 % раствора полиглюкина:

1) путем упаривания 6 % раствора полиглюкина до 18% (1/5,5) исход­ного объема;

2) растворяя сухой порошок полиглюкина.

Для получения 1000 мл 33 % раствора в мерную колбу помещают 330 г сухого порошка полиглюкина и растворяют в 700 мл дистиллированной воды в условиях водяной бани при температуре 50-60 °С. Добавляют 49,5 г сухо­го хлорида натрия. Охлаждают раствор до комнатной температуры и дис­тиллированной водой доводят до 1000 мл. Для консервирования 33 % раствора полиглюкина применяют борную кислоту из расчета 3 г на 100 мл.

Проба на совместимость по антигенам системы резус не заменяет, а допол­няет пробу на совместимость по антигенам системы АВО.

Ход определения:

— на дно маркированной пробирки вносят 2 капли сыворотки больного, 1 каплю донорской крови и 1 каплю 33 % раствора полиглюкина;

— перемешивают содержимое пробирки встряхиванием;

— медленно поворачивают пробирку так, чтобы содержимое растекалось по стенкам пробирки. При этом увеличивается выраженность реакции агг­лютинации;

— через 5 мин добавляют 2-3 мл физиологического раствора;

— перемешивают содержимое, 2-3 раза аккуратно перевертывая пробир­ку, не взбалтывая;

— наличие агглютинации в пробирке указывает, что кровь донора несов­местима с кровью пациента и поэтому не может быть ему перелита. Если содержимое пробирки остается равномерно окрашенным и не наблюдается признаков агглютинации эритроцитов — кровь совместима.