Издательский дом Питер
 Скачать 5.79 Mb.
|
|
288 Глава 6. Иммунологические основы переливания крови та HAT: традиционную методику на плоскости с применением полиспецифической антиглобулиновой сыворотки, «спин»-метод (СМ) с применением реактива анти-IgG и гелевый тест (ГТ) с использованием типирующей диагностической системы DiaMed (DiaMed AG, Швейцария). Для скрининга антител использовали консервированные тест-эритроциты, содержащие максимальный набор антигенов системы резус и Kell (DCcEeKk). При определении антител традиционными методами (ЭМП, МКЖ, HAT и СМ) использовали также смеси нативных эритроцитов 7-10 образцов группы крови О (I) Rh+ и 7-10 образцов группы крови О (I) Шт. Для выполнения HAT в традиционном варианте 10 мкл отмытых тест-эритроцитов смешивали с 150 мкл исследуемой сыворотки и инкубировали 45 мин при температуре 37 °С, затем тест-эритроциты отмывали 4 раза стерильным физиологическим раствором в течение 5 мин при 1000 об/мин и готовили 5 % взвесь эритроцитов. 50 мкл полученной взвеси клеток смешивали на белой пластинке с 50 мкл антиглобулиновой сыворотки. Инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин и оценивали наличие агглютинации. При выполнении СМ тест-эритроциты готовили таким же способом. 50 мкл 5 % взвеси тест-эритроцитов смешивали со 100 мкл реактива анти-IgG и центрифугировали в течение 1 мин при 1000 об/мин. Каплю этой смеси переносили на предметное стекло и оценивали результат путем микроскопирова-ния по наличию или отсутствию реакции агглютинации. Все исследования проводили с одновременной постановкой контрольных (положительной и отрицательной) проб. Для выявления антител в ГТ (из трех доступных вариантов) как наиболее подходящие для скрининга выбрали ID-карты LISS/Coombs с 6 микропробирками, содержащими гель с полиспецифическим антиглобулином (анти-IgG кролика и моноклональный C3d). В каждую микропробирку помещали 50 мкл тест-эритроцитов, добавляли 25 мкл исследуемой сыворотки, инкубировали 15 мин при температуре 37 *С и центрифугировали (центрифуга ID-6S, входит в комплект оборудования DiaMed, стандартный заданный режим центрифугирования — 10 мин) (табл. 61 и 62). Таблица 61 Антигенный профиль стандартных эритроцитов ID-Diacell I+II+III и ID-DiaCell I+II+III-P
289 Исследование аллоантител к антигенам эритроцитов Таблица 62 Характеристика методов скрининга антител с использованием стандартных эритроцитов ID-DiaCell
Скрининг неполных аллоантиэритроцитарных антител у доноров проводили МКЖ с применением микроскопирования. Данный метод позволяет выявлять антитела различной специфичности (АВО, резус, Kell, Lewis, P, MN и др.), в том числе присутствующие в сыворотках в низком титре. Для исследования сыворотки крови больных на наличие неполных аллоантител к антигенам эритроцитов использовали не менее двух методов для каждого образца (всего 156 определений: МКЖ — 54, ЭМП — 31, HAT — 28, СМ - 26, ГТ - 17). Аллоиммунизация антигенами эритроцитов обычно связана с гемотранс-фузиями или беременностями, поэтому на первом этапе работы по организации скрининга аллоантиэритроцитарных антител проводили разделение доноров на две группы с помощью специальных карт опроса. Контроль аллоиммунизации осуществляли только в группе «потенциально опасных» доноров, т. е. лиц, имевших в анамнезе гемотрансфузии и/или беременности. Для Центра крови и тканей Военно-медицинской академии доля этой группы составляет всего 2,5-3 %. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности избирательного мониторинга аллоиммунизации доноров гемокомпонентов. Одним из важнейших мероприятий по организации мониторинга аллоиммунизации доноров и реципиентов гемокомпонентов является правильный выбор методов определения аллоантител, поскольку от этого в значительной мере зависит качество исследований. На втором этапе работы была проведена сравнительная оценка эффективности различных методов определения неполных антител к антигенам эритроцитов (табл. 63). Результаты проведенных исследований показали преимущество ГТ перед традиционными методиками. ГТ имеет наибольшую чувствительность: титр антител контрольной 290 Глава 6. Иммунологические основы переливания крови Таблица 63 Эффективность различных методов диагностики аллоиммунизации антигенами эритроцитов
* Титр в ступенях разведения контрольной сыворотки. ** Наличие неспецифических реакций. сыворотки, определенный данным методом, составил 1:128 (7-я ступень разведения сыворотки). Чувствительность СМ также является достаточно высокой (6-я ступень разведения контрольной сыворотки), однако трудоемкость данного метода и высокая стоимость реактива анти-IgG ограничивают возможности широкого применения СМ в клинической практике. При определении аллоантител в контрольной сыворотке другими традиционными методами титр был на 3 ступени ниже, чем в гелевом тесте. Наименее чувствительным оказался ЭМП: титр антител контрольной сыворотки, определенный данным методом, не превышал 1:2. Сравнение чувствительности методов, приведенное в табл. 63, дано на примере одной контрольной сыворотки, содержащей неполные антитела к антигену D системы резус. Выявленная закономерность в различиях чувствительности указанных методов сохранялась и при тестировании других контрольных сывороток (14 образцов), содержащих антитела к антигенам систем резус и Kell. Таким образом, проведенные исследования показали, что наиболее эффективным методом диагностики аллоиммунизации является ГТ с применением типирующей системы DiaMed. Это высокочувствительный и специфичный метод, дающий возможность контроля качества исследований и документации результатов скрининга аллоантител. Кроме того, ГТ обеспечивает значитель- 291 Исследование аллоантител к антигенам эритроцитов ную экономию времени по сравнению с другими вариантами HAT и позволяет использовать минимальное количество исследуемой сыворотки крови (25 мкл) и тест-эритроцитов (50 мкл 1 % взвеси) для проведения исследования (см. табл. 63). Фактором, затрудняющим широкое использование ГТ, является высокая стоимость типирующей системы DiaMed, поэтому для первичного скрининга аллоантител у доноров и реципиентов целесообразно использовать более доступные для ординарных лечебных учреждений традиционные методы. Наиболее эффективным из используемых в настоящее время рутинных методов является МКЖ с применением микроскопирования на этапе трактовки результатов исследования. Большое количество исследований, проведенных данным методом, показало, что микроскопирование проб позволяет повысить чувствительность этого метода в 10-15 раз при сохранении его достаточно высокой специфичности. Методы с повышенной чувствительностью (СМ и ГТ) целесообразны при обследовании гематологических больных, беременных и т. д., а также доноров компонентов крови для специальных контингентов реципиентов с высоким риском аллоиммунизации. На третьем этапе исследований разработанная система обеспечения мониторинга была опробована при изучении частоты аллоиммунизации доноров и реципиентов гемокомпонентов. Под наблюдением находились 3 группы лиц (табл. 64): 1) реципиенты гемокомпонентов — больные гематологическими и хирургическими заболеваниями, а также с термическими поражениями; 2) кадровые доноры плазмы — контрольная группа; 3) доноры-родственники — лица, имевшие гемотрансфузии и/или беременности. В результате проведенных исследований в сыворотках крови 5 кардио-хирургических и 2 гематологических больных были выявлены иммунные аллоантитела к антигенам эритроцитов. Частота аллоиммунизации реципиентов составила 10,9 %. В группе «потенциально опасных» доноров частота аллоиммунизации составила 1,7 %. В контрольной группе доноров аллоантитела к антигенам эритроцитов не обнаружены. Высокая частота аллоиммунизации реципиентов свидетельствует о том, что необходимо учитывать возможность иммунного конфликта по антигенам эритроцитов у больных, Таблица 64 Частота аллоиммунизации доноров и реципиентов гемокомпонентов антигенами эритроцитов
292_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови получающих гемотрансфузии. Поэтому необходимо своевременное выявление аллоиммунизации у таких больных. Проведение гемотрансфузии аллоиммунизированным реципиентам должно осуществляться только по индивидуальному подбору с учетом антигенного состава эритроцитов. Обязателен также мониторинг аллоиммунизации доноров, имевших гемотрансфузии или беременности. В случае обнаружения аллоантиэритроцитарных антител цельная кровь или плазма таких доноров должна исключаться из числа гемотрансфузионных сред и использоваться только для изготовления диагностических реактивов. Таким образом, разработанная и опробованная система обеспечения мониторинга аллоиммунизации доноров и реципиентов гемокомпонентов позволяет с минимальными затратами обеспечить безопасность гемотрансфузион-ной терапии в лечебных учреждениях. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||