Издательский дом Питер

• Название: Издательский дом Питер
• Анкор: Zhiburt_E_B_Transfuziologia.doc
• Дата: 31.01.2017
• Размер: 5.79 Mb.
• Имя файла: Zhiburt_E_B_Transfuziologia.doc
• Тип: Учебник; #1519
• страница: 38 из 77

6.10.2.1. Характеристика идентификационных карт

Идентификационные карты (ID-карты) DiaMed представляют собой пластиковые карточки, в которые встроено по 6 микропробирок. В 5 пробир­ках содержится смесь геля и антисывороток. Каждая карточка имеет 6-ю контрольную пробирку, содержащую нейтральный гель без антител (ctl). Маркировка пробирок в ID-карте осуществляется по выявляемым антигенам, например A-B-AB-D-CDE-Ctl или C-c-E-e-K-Ctl. Идентификационные карты для выявления антител к антигенам эритроцитов имеют некоторые отличия, например карты «Coombs/Enzyme Test»: в 3 пробирках, расположенных слева, находится гель, содержащий антитела к глобулинам человека (моно­специфические анти-IgG или полиспецифические — к иммуноглобулинам различных классов), т. е. реакция Кумбса. В следующих трех пробирках со­держится только нейтральный гель, предназначенный для выявления анти­тел к антигенам эритроцитов в солевой среде.

6.10.2.2. Оборудование и реактивы

ID-карты для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител;

308_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

ID-центрифуга для центрифугирования карт; термостат 37°С; штатив для пробирок и карт; пробирки вместимостью 5 и 10 мл;

пипетки полуавтоматические одноканальные (10, 25, 50 мкл); перчатки резиновые хирургические; раствор для разведения 1 (раствор бромелина); раствор для разведения 2 (раствор низкой ионной силы — LISS); 0,9 % раствор хлорида натрия;

стандартные типированные, эритроциты человека для выявления антител и проведения перекрестной реакции.

6.10.2.3. Общие правила использования идентификационных карт

1. Идентификационные карты должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 18-25 °С. Срок годности указан в паспорт­ной части каждой карты и на упаковочных коробках. Срок годности карт — 18 мес. Срок годности реагентов — 2 года.

2. Растворы для приготовления суспензии эритроцитов, а также стандар­тные сыворотки и стандартные ID-эритроциты, использующиеся в отдельных исследованиях, должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 2-8 °С. Срок годности указан на этикетке каждого флакона и упаковочной коробке.

3. Во избежание получения ложных результатов исследований, запреща­ется использование любых реагентов и карт с истекшими сроками годности, а также высохших, содержащих пузырьки газа, или с повреждением оболоч­ки.

4. Заготовка крови осуществляется с применением современных флебо-томических методик, а также может быть использована артериальная, капил­лярная и пуповинная (без отмывания) кровь. Для исследований пригодны как образцы цельной крови (взятые в чистую, сухую пробирку), так и образ­цы крови, взятые на консервантах и стабилизаторах.

5. Результаты исследования сохраняются в неизменном виде:

— 48 ч при комнатной температуре;

— три нед в холодильнике (при 2-8 °С) при заклеенной липкой лентой верхней части ID-карты.

6. Нижнее поле ID-карты можно отклеить или отрезать и использовать как документ в истории болезни или в картотеке.

7. Не допускается применение ID-карт с признаками высохшего геля, пузырьками в его толще или повреждением защитной фольги.

8. Перед использованием образцы и реагенты должны быть выдержаны до комнатной температуры.

Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов 309

6.10.3. Типирование антигенов эритроцитов

ID-карты DiaMed предназначены для одновременного определения группы крови по системе АВО и резус-принадлежности эритроцитов доноров и реци­пиентов (включая их слабые варианты антигенов), а также для типирования других антигенов эритроцитов. ID-карты DiaMed можно использовать вза­мен или параллельно с изогемагглютинирующими сыворотками, реагентами анти-D, анти-DCE, цоликлонами анти-А, анти-В, анти-D и анти-D Супер.

6.10.3.1. Алгоритм проведения исследований

Начальный этап выполняется по-разному, в зависимости от вида исполь­зуемых ID-карт, содержащих поликлональные (см. ниже п.1а) или монокло-нальные (см. п. 16) антитела:

1а) Приготовить взвесь исследумых эритроцитов в растворе для разведе­ния 1 (ID-карты, содержащие поликлональные антитела), для чего:

— выдержать раствор для разведения 1 до достижения им комнатной температуры;

— промаркировать чистые пробирки;

— приготовить 5 % суспензию исследуемых эритроцитов в растворе для разведения 1, поместив в пробирку 0,5 мл раствора для разведения 1 и 50 мкл исследуемой цельной крови или 25 мкл эритроцитной массы;

— аккуратно смешать и инкубировать 10 мин при комнатной температу­ре;

— использовать не позднее 15 мин после инкубации. 16) Приготовить взвесь исследуемых эритроцитов в растворе для разве­дения 2 (ID-карты, содержащие моноклональные антитела), для чего:

— выдержать раствор для разведения 2 до достижения им комнатной температуры;

— промаркировать чистые пробирки;

— приготовить 5 % суспензию исследуемых эритроцитов в растворе для разведения 2, поместив в пробирку 0,5 мл раствора для разведения 1 и 50 мкл исследуемой цельной крови или 25 мкл эритроцитной массы.

Дальнейшие действия

1. Промаркировать ID-карту (№ исследуемого образца сыворотки или Ф.И.О. пациента).

2. Снять защитную фольгу с пробирок ID-карты.

3. В каждую пробирку ID-карты внести по 10 мкл исследуемых эритро­цитов, приготовленных в соответствии с п.1а, или по 50 мкл исследуемых эритроцитов, приготовленных в соответствии с п. 16.

4. Установить ID-карты в ротор ID-центрифуги (с обязательным урав­новешиванием другими ID-картами, возможно, неиспользованными).

310_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

5. Центрифугировать ID-карты (время и скорость центрифугирования постоянны и заданы автоматически).

6. Оценить результат исследования.

Результат в контрольной микропробирке «ctl» должен быть всегда отри­цательным. Положительная реакция в «контроле» может быть вызвана при­сутствием аутоантител и неспецифическими плазменными белками. Если «контроль» положителен — определение недостоверно, его необходимо по­вторить после однократного отмывания образца эритроцитов 0,9 % раствором хлорида натрия или раствором для разведения 2.

7. Результаты определения каждого антигена внести в соответствующую графу ID-карты (на белом поле внизу под каждым антигеном).

8. Идентифицировать результат по следующей схеме (табл. 69-71).

6.10.3.2. Используемые ID -карты

При определении групп крови и резус-принадлежности применяют по-ликлональные (табл. 72) и моноклональные (табл. 73) реагенты. Наиболее частое применение на практике вследствие экономической целесообразности находят моноклональные сыворотки.

Определение группы крови АВО и резус-принадлежности проводят пу­тем идентификации специфических антигенов и антител (двойная или пере­крестная реакция) (табл. 74).

Для углубленного обследования используют другие карты (табл. 75, 76).

По современной классификации лица с ослабленным вариантом антиге­на D, способные вырабатывать анти-О-антитела, подразделяются на несколько категорий (табл. 77). Наибольшую частоту встречаемости и практическое значение имеет категория VI, эритроциты которой несут только эпитоп Z ан­тигена D. Лица категории VI (резус-отрицательные реципиенты, но резус-положительные доноры!) могут вырабатывать антитела к неизмененному D и частичному D всех остальных категорий. Для подтверждения группы кро­ви используют различные ID-карты: D(VI) — для реципиентов, D(VI⁺) — для доноров.

В антигене D установлено наличие 30 легко распознаваемых эпитопов, но для практической работы достаточна модель антигена D, состоящая из 9 эпи­топов. Панель моноклональных анти-D реагентов может быть использована для точного определения вида частичного D-антигена.

Набор ID-Partial Rh D-Typing состоит из 6 моноклональных анти-D сывороток, которые предназначены для более точной характеристики антиге­на D после рутинного определения группы крови по системы резус. Сыво­ротки позволяют различать следующие категории антигена D: II, IV, V, VI, VII, DFR, DBT и R₀^Har. Термин «категория I» в настоящее время не исполь­зуется, и эритроцит категории III реагирует со всеми анти-D сыворотками,


311

Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов

Таблица 69

Результаты исследования антигенов группы крови АВ0 и резус-принадлежности в ID-карте AB0/Rh

Выявляемые антигены					Заключение
А	В	АВ	D	CDE
+	+	+	+	+	AB Rh+
+	+	+	—	—	AB Rh-
+	-	+	+	+	A Rh+
+	-	+	-	-	A Rh-
-	+	+	+	+	B Rh+
-	+	+	-	—	B Rh-
—	—	—	+	+	0 Rh+
-	-	-	-	-	0 Rh-

Примечание. Специфичность исследования подтверждается по отрицательному результату в пробирке с контролем ID-карты.

Таблица 70

Определение антигенов эритроцитов системы АВО

Группа крови	Результаты исследования с сыворотками
	анти-А	анти-В	анти-АВ
0(1)	-	-	-
А ЦП)	++++	-	++++
А2(П)	+++/++++	-	+++/++++
АЗ(П)	++/+++	-	++/++++
Ах(11)*	-/++	-	±/++
В(Ш)	-	++++	++++
ВЗ(Ш)	-	+/+++	+/+++
ВХ(Ш)*	-	-/++	-/++
AIB(IV)	++++	++++	++++
А2В (IV)	+++/++++	++++	++++

* Определение очень слабых вариантов антигенов А и В требует дальнейших исследований.

но может отличаться от нормальных D-положительных эритроцитов присут­ствием алло-анти-D антител в сыворотке.

Интерпретация результатов исследования с набором ID-Partial Rh D-Typing представлена в табл. 78.

Частичный D^VI антиген по-прежнему остается наиболее важной категори­ей для определения. Клинически, пациенты с частичным D^VI антигеном дол­жны лечиться так же как D-отрицательные пациенты и при гемотрансфузи-ях, и при беременности D-положительным плодом для предотвращения про­дукции анти-D антител к отсутствующим эпитопам.

312

Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

Таблица 71

Определение резус-принадлежности (D, CDE)

Резус-принадлежность	Результаты исследования с сыворотками
	Анти-D	Анти-CDE
D-положительная	++++	++++
D-отрицательная	-	-
D-отрицательная, С,Е-положительная *	—	От +++ до ++++
Слабоположительная (Du)	От + до +++	От +++ до ++++

* Положительная реакция с сывороткой анти-CDE при отрицательной реакции с сывороткой анти-D свидетельствует о наличии антигенов С, Е и требует дальнейшего типирования с использованием ID-карт: C-c-E-e-K-ctl или C-C^w-c-E-e-K.

Таблица 72

ID-карты, содержащие поликлопальные сыворотки

ID-карты	Конфигурация
ABO / Rh	A-B-AB-D-CDE-ctl
ABD-Confirmation (подтверждение)	A-B-D/A-B-D
ABO/RhforNewborns	A-B-AB-D-ctl/DAT

Таблица 73

ID-карты, содержащие моноклональные реагенты

ID-карты	Конфигурация
AB0/Rh for patients	A-B-AB-D(VI)-CDE-ctl
AB0/Rh for donors	A-B-AB-D(VI+)-CDE-ctl
ABD-Confirmation for patients	A-B-D(VF)/A-B-D(Vr)
ABD-Confirmation for donors	A-B-D(VI+)/ A-B-D(VI+)
AB0/ Rh for Newborns	A-B-AB-D(VI+)-ctl / ahg

Таблица 74

ID-карты для определения группы крови АВО и резус-принадлежности перекрестным методом (двойной реакцией)

Ш-карты	Конфигурация
AB0/ D+ Reverse Grouping	A-B-D-ctl / a1 -B
DiaClon ABO/D Reverse Grouping (моно-)	A-B-D(VI-)-ctl/A1-B

313

Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов

Таблица 75 ID-карты для типирования системы резус и Kell-принадлежности

ID-карты	Конфигурация
Rh subgroups + К	C-c-E-e-K(KELl)-ctl
DiaClon Rh subgroups + К	C-c-E-e-K(KELl)-ctl
Rh subgroups + Cw + К	C-Cw-c-E-e-K(KELl)
Rh D + Phenotype	C-c-D-E-e-ctl
DiaClon Rh subgroups	c-E/c-E/c-E

Таблица 76 ID-карты для типирования других антигенов эритроцитов

ID-карты	Конфигурация
Anti- D(human) DiaClon anti-Dvi pos DiaClon anti-Dvi neg Anti -Cw ID-anti-D for D weak confirmation Anti-K (KEL1) DiaClon anti-K (KEL1) Anti-k (KEL2) Anti-M Anti-N Anti-P1 Anti-Lea Anti-Leb Anti-Jka Anti-Jkb Anti-Kpa Anti-Kpb Anti-Lua Anti-Lub	6xD 6xD(vi+) 6xD(vi-) 6xCw Vial (флакон) бхК(КЕL1) бхК(КЕL1) 6xk(KE2) 6xM 6xN 6xP1 6xLea 6xLeb 6xJka 6xJkb 6xKpa 6xKpb 6xLua 6xLub

6.10.4. Выявление антиэритроцитарных антител

6.10.4.1. Принцип метода

Исследуемые сыворотки и стандартные эритроциты для выявления анти­тел добавляются в верхнюю часть микропробирок. После инкубации и цен­трифугирования агглютинированные эритроциты остаются в верхней части пробирки, так как не проходят через гель из-за большого размера агглюти-натов (положительный результат). При отсутствии антител к антигенам тест-эритроцитов агглютинаты не образуются. Неагглютинированные эритроци-

314

Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

Таблица 77

Характеристика антигена D

Варианты	Характеристика	Отсутствующие эпитопы
D1	В настоящее время термин устарел
DII	Сочетается с антигенами С, е	4,9
Dm	D- положительная реакция с анти-D	Все присутствуют
DIVa	Сочетается с антигенами с, е	1,2,3,9
	Go (a+). (В)
DlVb	Сочетается с антигенами С, е	1,2,3,4,9
	Go (a-). (W)
DVa	Эритроциты Dw+	1,5
DVb	Эритроциты Dw- (только в одной семье)
DVI	Сочетается с антигенами С, е	1, 2, 5, 6/7, 8
DVII	Сочетается с антигенами С, е. Таг +	8
DFR	Сочетается с антигенами С, е	8
	Французский вариант
HMi/ii	Сочетается с антигенами с, Е	8 ( ii ? 2, 5, 9 )
RoHar	Нет анти-D в сыворотке. Rh33	Возможно:
	Возможны количественные изменения	1,2,3,4,8,9

ты легко проходят через гель и оседают на дне пробирки (отрицательный результат). Характер агглютинации при выявлении антител к эритроцитам зависит от титра антител, их активность оценивается от 4+ до +.

В качестве консерванта для приготовления стандартных эритроцитов оптимально применять стабилизирующий раствор ID-Cell Stab. При этом суспензию стандартных эритроцитов готовят с трижды отмытыми (физиоло­гическим раствором) эритроцитами в соотношении: 1 часть эритроцитов на 3 части ID-Cell Stab. При соблюдении условий стерильности и хранения (тем­пература 2-8 °С) эритроциты сохраняют свою антигенную структуру (с не­изменной экспрессией) в течение не менее 2 мес со дня приготовления сус­пензии.

6.10.4.2. Алгоритм проведения исследований

Типированные эритроциты перед исследованием необходимо предваритель­но дважды отмыть от консерванта 0,9 % раствором хлорида натрия, а затем выполнить следующие действия:

— выдержать раствор для разведения 2 до достижения комнатной тем­пературы;

— промаркировать пробирки;

315

Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов

Таблица 78

Интерпретация результатов исследования с набором ID-Partial Rh D-Typing

Ожидаемые реакции для частичногоВ-антигена
Анти-D	DII	D III	D IVa	D IVb	D V	D VI	D VII	DFR	DBT	RoHar
1	+	+	_	—	+	+	+	+	_	—
.2	-	+	—	—	+	+	+	+	—	-
3	+	+	—	—	—	—	+	_	—	_
4	+	+	+	+	+	—	—	—	+	-
5	+	+	+	+	+	_	+	+	—	_
6	+	+	+	+	+	-	+	-	+	+/-

Примечания. 1) Эритроциты не должны быть сенсибилизированы IgG invitro: отрицательная прямая проба Кумбса должна подтвердить результаты, полученные в ID-карте «Partial Rh-Typing».

2) Слабый D-фенотип, обусловленный минимальным количеством антигенов на эритроцитах, может не давать положительную реакцию с IgM в анти-D сыворотке № 6.

3) Часть эритроцитов с D^VI могут не давать реакцию с антителами №1. Это может быть связано с cDE гаплотипом (I фенотипом D^VI) и обусловлено меньшим количеством Rh D протеина на эритроцитах, чем у D^VIII и III типов.

4) Часть образцов R₀^Har могут реагировать с анти-D № 6.

5) Существует много других типов частичного D. Поэтому, если эритроциты четко не идентифицируются в приведенной таблице, образцы должны быть подвергнуты углубленному исследованию в специализированной лаборатории.

6) Некоторые образцы D^weak могут реагировать гораздо слабее с антителами № 3 и № 6.

— приготовить 0,8 % взвесь типированных эритроцитов в растворе для разведения 2, поместив в пробирку 1,0 мл раствора для разведения 2 и 10 мкл крови;

— снять защитную фольгу с ID-карты;

— промаркировать ID-карту (номер исследуемого образца сыворотки или Ф.И.О. пациента);

— добавить по 50 мкл стандартных эритроцитов в микропробирки;

— добавить по 25 мкл сыворотки или плазмы исследуемого образца в каждую микропробирку;

— инкубировать 15 мин при температуре 37 °С;

— центрифугировать ID-карты в ID-центрифуге (время и скорость цен­трифугирования постоянны и заданы автоматически).

Примечание. Стандартные эритроциты панели ID-DiaCell I-II-III и ID-DiaCell I-II-IH Р фирмы DiaMed, как и клетки, стабилизированные раствором ID-Cell Stab,

316_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

готовы к применению без предварительного отмывания и обработки раствором для разведения 2.

Интерпретация результатов

Положительная реакция означает наличие в исследуемом образце иммун­ных антител.

Если имеет место положительная реакция со всеми эритроцитами панели ID-DiaCell, рекомендуется выполнять аутоконтроль для исключения аутоан-тител в исследуемом образце.

Если с одним или более видом эритроцитов панели ID-DiaCell реакция остается отрицательной, специфичность антител может быть установлена с помощью сопроводительного листа — таблицы антигенных профилей, при­лагаемой ко всем упаковкам ID-DiaCell. При этом убедитесь в том, что но­мера панели ID-DiaCell и сопроводительного листа совпадают.

Если данная панель не позволяет установить специфичность антител, ре­комендуется продолжить идентификацию, используя расширенную панель эритроцитов ID-DiaPanel и/или ID-DiaPanel P (в зависимости от первона­чально использованной методики).

6.10.4.3. Скрининг и идентификация антител

Скрининг антител выполняется как в нейтральном геле, так и в геле, со­держащем антиглобулиновый реагент (табл. 79 и 80). В первом случае для исследования используются обработанные ферментом эритроциты, во втором — суспензия эритроцитов в растворе низкой ионной силы. Скрининг и иденти­фикация антител производятся с помощью стандартной панели эритроцитов. При оценке эффективности гелевого теста для скрининга и идентификации антител была установлена его более высокая чувствительность по сравнению с традиционными методиками.

6.10.4.4. Методы исследования антител к антигенам эритроцитов

Антиглобулиновый тест (непрямая реакция Кумбса)

Непрямой антиглобулиновый тест (HAT) используется для выявления антиэритроцитарных антител. Обычно HAT выполняется в два этапа: 1) ин­кубация эритроцитов и сыворотки (фиксация антител) с последующим от­мыванием для удаления несвязавшихся глобулинов; постановка непрямого антиглобулинового теста в гелевом тесте не требует отмывания эритроцитов! 2) инкубация отмытых эритроцитов с античеловеческим глобулином (АЧГ). Агглютинация свидетельствует о наличии в сыворотке антител, связавшихся с антигенами эритроцитов invitro. HAT используется для: 1) определения в сыворотке реципиента антител к эритроцитам донора — при постановке пробы на совместимость; 2) при скрининге «неожиданных» антиэритроцитарных антител; 3) при исследовании антиэритроцитарных антител у беременных;

Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов 317

Таблица 79 ID-карты, используемые для скрининга антител

ID-карты	Конфигурация
ID-DiaScreening LISS Coombs+Enzyme test LISS/ Coombs Coombs anti-IgG NaCl, Enzyme test and cold aggl.	4 AHG tests/ 2 enzyme tests 3 AHG tests/ 3 enzyme tests 6 AHG tests 6 AHG anti-lgG tests 6 enzyme tests (or 6 NaCl tests)

Таблица 80 ID- карты, используемые для идентификации антител

ID-карты	Конфигурация
LISS/ Coombs NaCl, Enzyme test and cold aggl. Coombs anti-lg G	6 AHG tests 6 enzyme tests (or 6 NaCl tests) 6 AHG anti-lgG tests

4) при исследовании антител в сыворотке больных аутоиммунной гемолити-ческой анемией.

Ход определения:

— внести в три пробирки ID-карты, расположенные слева, по 50 мкл взвеси типированных эритроцитов;

— добавить в пробирки по 25 мкл исследуемой сыворотки;

— инкубировать в течение 15 мин при температуре 37 °С;

— центрифугировать ID-карты в течении 10 мин;

— оценить результат исследования. Вписать полученный результат в ID-карту.

Результаты определения:

— положительный результат свидетельствует о наличии иммунных (алло) антител в исследуемой сыворотке или плазме (для выяснения специфичнос­ти антител используйте таблицу, прилагаемую к стандартным эритроцитам);

— отрицательный результат свидетельствует об отсутствии иммунных ан­тител в исследуемой сыворотке или плазме.

Ферментный метод

Обработка протеолитическими ферментами повышает агглютинабельность эритроцитов.

Ход определения:

— внести в расположенные справа три пробирки ID-карты по 50 мкл взвеси стандартных типированных эритроцитов;

318_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

— добавить в пробирки по 25 мкл раствора для разведения 1;

— добавить в пробирки по 25 мкл исследуемой сыворотки.

Примечание. Раствор для разведения 1 не добавляется, если для исследова­ния используются стандартные типированные эритроциты, предварительно обрабо­танные протеолитическим ферментом (например, ID-DiaCell I-II-III Р фирмы DiaMed).

— инкубировать в течение 15 мин при температуре 37 °С;

— центрифугировать ID-карты в ID-центрифуге в течение 10 мин (па­раметры установлены автоматически);

— оценить результат исследования;

— вписать полученный результат в ID-карту.

Результаты исследования:

— положительный результат свидетельствует о наличии аллоантител в исследуемой сыворотке или плазме (для выяснения специфичности антител используйте таблицу, прилагаемую к стандартным эритроцитам);

— отрицательный результат свидетельствует об отсутствии аллоантител в исследуемой сыворотке или плазме.

Метод холодовой агглютинации

Ход определения:

— выдержать раствор для разведения 2, типированные эритроциты и ID-карты в течение 30 мин при температуре 2-8 °С;

— обработать типированные эритроциты раствором для разведения 2, для чего:

а) промаркировать пробирку;

б) приготовить 0,8 % взвесь типированных эритроцитов в растворе для разведения 2, поместив в пробирку 1,0 мл раствора для разведения 2 и 10 мкл крови;

Примечание. Стандартные эритроциты DiaCell I-II-III (фирма DiaMed) гото­вы к использованию и не требуют разведения.

— внести в три пробирки ID-карты, расположенные справа, по 50 мкл взве­си типированных эритроцитов, обработанных раствором для разведения 2;

— добавить в эти пробирки по 25 мкл исследуемой сыворотки;

— инкубировать в течение 30 мин при температуре 2-8 °С;

— центрифугировать ID-карты в ID-центрифуге в течение 10 мин (па­раметры установлены автоматически);

— оценить результат исследования;

— вписать полученный результат в ID-карту.

Результаты исследования:

— положительный результат свидетельствует о наличии холодовых антител в исследуемой сыворотке или плазме (для выяснения специ-

Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов 319

фичности антител используйте таблицу, прилагаемую к стандартным эритроцитам);

— отрицательный результат свидетельствует об отсутствии холодовых ан­тител в исследуемой сыворотке или плазме.

Рекомендации

При наличии в исследуемой сыворотке холодовых или тепловых аутоан-тител могут наблюдаться ложноположительные результаты. Для исключения таких ложноположительных результатов необходимо поставить аутоконт-роль:

— приготовить 0,8 % взвесь эритроцитов исследуемой крови в растворе для разведения 2, добавив к 1,0 мл раствора для разведения 2 10 мкл цельной крови;

— внести по 50 мкл приготовленной взвеси эритроцитов в пробирку ID-карты, расположенную слева (для реакции Кумбса), или в пробирку ID-карты, расположенную справа (для ферментного метода и холодовой агглю­тинации);

— в пробирки ID-карты внести по 25 мкл исследуемой сыворотки (для ферментного метода необходимо внести в пробирки еще по 25 мкл раствора для разведения 1);

— карты инкубировать 15 мин при температуре 37 °С (для реакции Кумбса и ферментного метода) или при температуре 2-8 °С (для постановки ауто-контроля холодовой агглютинации).

Положительный результат в аутоконтроле свидетельствует о присутствии в исследуемой сыворотке аутоантител.

6.10.5. Определение совместимости крови донора и реципиента

Целью пробы на индивидуальную совместимость является предотвраще­ние трансфузий гемокомпонентов, несовместимых по антигенам эритроцитов. Тестирование сыворотки реципиента с эритроцитами предполагаемого доно­ра — наиболее надежный способ выявления антител, способных вызвать по­вреждение перелитых эритроцитов, посттрансфузионные реакции и осложне­ния гемолитического типа. Проведение такой пробы позволяет:

— подтвердить АВО-совместимость донора и реципиента;

— выявить антитела в сыворотке реципиента, направленные против ан­тигенов эритроцитов донора.

Тестирование на индивидуальную совместимость крови донора и реци­пиента по антигенам эритроцитов (табл. 81) не заменяет обязательное имму-ногематологическое исследование (типирование антигенов эритроцитов сис­тем АВ0, резус, Kell, выявление антиэритроцитарных антител, поиск и иден­тификацию аллоантиэритроцитарных антител), а лишь дополняет его.

320_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

Таблица 81 ID-карты, используемые для проведении пробы на совместимость

ID-карты	Конфигурация
Complete Crossmatch DiaClon Complete Crossmatch LISS Coombs Coombs anti-lg G NaCl Enz test and cold aggl ABD-Confirmation DiaClon ABD-Confirmation	A-B-D enz 2 x AHG A-B-D(VI+) enz 2 x AHG 6 AHG tests 6 AHG anti-lg G tests 6 enz tests (or 6 NaCl tests) ABD ABD А-В-О(УГ) A-B-D(VI-)

Ввиду того, что сенсибилизация может появиться даже после трансфу­зий индивидуально подобранных гемокомпонентов, для проведения проб на совместимость необходимо использовать каждый раз свежую сыворотку па­циента, полученную после последней трансфузии гемокомпонентов.

Ход определения:

— выдержать раствор для разведения 2 до достижения комнатной тем­пературы (20-24 °С);

— промаркировать ID-карты и пробирки (Ф.И.О. донора и реципиента);

— приготовить 0,8 % суспензию эритроцитов донора и реципиента в ра­створе для разведения 2, для чего в две маркированные пробирки внести по 1 мл раствора для разведения 2, добавить по 10 мкл крови донора и реципи­ента соответственно;

— смешать;

— снять защитную фольгу с соответствующей ID-карты;

— добавить по 50 мкл приготовленной суспензии эритроцитов донора в микропробирки ID-карты 1, 2, 3, 4, 5;

— добавить по 50 мкл приготовленной суспензии эритроцитов реципиен­та в микропробирки ID-карты 4, 5, 6;

— добавить по 25 мкл сыворотки или плазмы реципиента в микропро­бирки ID-карты 1, 2, 3, 6;

— добавить 25 мкл раствора для разведения 1 в микропробирку ID-кар­ты 4 (ферментный тест);

— инкубировать 15 мин при температуре 37 °С;

— центрифугировать (время и скорость центрифугирования постоянны и заданы автоматически);

— оценить результат исследования.

Совместимость по антигенам А, В, D (микропробирки 1, 2, 3):

— четкий положительный или отрицательный результат указывает на соответствие антигенов А, В, D эритроцитов крови донора и реципиента;

Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов_____321

— если наблюдается двойная популяция эритроцитов (в одной микро­пробирке положительный и отрицательный результаты), антигены А, В, D донора и реципиента не идентичны!

— определение совместимости по антигенам А, В, D действительно толь­ко при отрицательной реакции в б-й микропробирке (аутоконтроль).

Результаты пробы на совместимость (микропробирки 4, 5):

— положительный результат в микропробирках ID-карт 4, 5 при отри­цательном контроле (микропробирка 6) свидетельствует о несовместимости крови донора и реципиента по антигенам эритроцитов;

— отрицательный результат в микропробирках ID-карт 4, 5, б свидетель­ствует о совместимости крови донора и реципиента по антигенам эритроци­тов;

— положительная реакция в микропробирке ID-карты б (аутоконтроль) требует дальнейшего определения ауто- и аллоантител в сыворотке (плазме) реципиента.

Проба на совместимость должна быть проведена для каждого образца крови донора!

Ограничения:

— определенные лекарственные средства могут вызывать ложноположи-тельную реакцию Кумбса;

— при некоторых патологических состояниях у больных может наблю­даться положительная реакция Кумбса;

— бактериальное или другое загрязнение используемого материала мо­жет вызывать ложноположительный или ложноотрицательный результат;

— остатки фибрина в исследуемых образцах могут связывать неагглю­тинированные клетки и после центрифугирования образовывать собой тон­кую розовую линию на поверхности геля, тогда как большинство клеток будут локализоваться на дне микропробирки;

— суспензии эритроцитов, имеющие чрезмерную концентрацию, могут вызывать ложноположительные реакции.

6.10.6. Заключение к разделу 6.10

Гелевый тест является простым, воспроизводимым, быстрым и очень чув­ствительным методом, позволяющим сразу выявлять слабые варианты анти­генов эритроцитов. Тест оценивается только макроскопически. После корот­кого обучения персонала, необходимого для правильного выполнения теста, сводятся к минимуму затраты рабочего времени и ошибки, встречающиеся при использовании традиционных методик. Гелевый тест позволяет стандартизи­ровать лабораторные методики, дать объективную оценку результатов реак­ции гемагглютинации. Стабильность результатов теста позволяет перепрове-

322_____________Глава 6. Иммунологические основы переливания крови

рять полученные данные, что необходимо для контроля. Результаты теста могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве или для обучения в сложнодиагностируемых случаях. Для теста используется небольшое ко­личество сыворотки или эритроцитов, что чрезвычайно важно для педиатри­ческих клиник.

Использование гелевой системы позволяет снизить риск заражения пер­сонала даже при работе с потенциально инфицированными образцами. Ге-левый тест может быть использован для проведения проб на совместимость по антигенам эритроцитов перед переливанием крови. Для этого использу­ются непрямой антиглобулиновый тест и одностадийный ферментный метод. Гелевый тест выполняется и оценивается по вышеприведенным правилам. Отсутствие этапов отмывания эритроцитов при выполнении непрямого анти-глобулинового теста позволяет более эффективно использовать рабочее вре­мя, а также благодаря стабильности результатов теста контролировать все полученные данные.