Ответы к экзамену по иммунологии. Клеточный иммунитет введение
 Скачать 0.63 Mb.
|
|
Клеточный иммунитет: введение Термин клеточный иммунитет (иммунитет, опосредованный клетками) первоначально служил для обозначения местных реакций (обычно на внутриклеточно локализующиеся возбудители), осуществляемых лимфоцитами и фагоцитами без участия антител - эффекторов гуморального иммунитета . В настоящее время этот термин используется в более широком смысле для описания такого противоинфекционного или противоопухолевого иммунного ответа, в котором антителам принадлежит не ведущая, а вспомогательная роль. Основу клеточного иммунитета составляют лимфоциты, которые для своего созревания переселяются из костного мозга в другой центральный орган лимфоидной системы - тимус (вилочковая железа). Эта ветвь лимфоцитов получила название тимус-зависимые, или Т-лимфоциты. В организме человека Т-лимфоциты многократно покидают лимфоидные органы, попадая сначала в лимфу, затем в кровь, а из крови снова возвращаются в органы. За свою жизнь лимфоцит может проходить более 100 километров. Благодаря интенсивной циркуляции, лимфоциты, когда в них возникает потребность, быстро появляются в "горячих точках". В тимусе формируются разные виды Т-клеток. Одни из них участвуют в регуляции развития В-клеток и образования антител, другие взаимодействуют с фагоцитами, помогая им разрушать поглощенные микробные клетки. Некоторые Т-лимфоциты обладают способностью разрушать клетки, содержащие чужеродный антиген, их назвали цитотоксическими или "киллерами". Другая разновидность лимфоцитов - Т-хелперы - первыми распознают чужеродные вещества. Т-хелперы не способны вырабатывать антитела и убивать клетки-мишени, но, распознавая чужеродный антиген, они реагируют на него выработкой различных факторов, которые необходимы для размножения и созревания В-клеток и Т-киллеров. Существуют еще Т-супрессоры, которые подавляют активность иммунного ответа, когда необходимость в нем отпадает. Если иммунные клетки будут продолжать работать, то будут поражаться собственные здоровые клетки организма, что приведет к развитию различных болезней (их называют аутоиммунными). Центральная роль в клеточном иммунитете принадлежит Т-хелперам, координирующим работу всех клеток, задействованных в иммунной реакции. Именно Т-хелперы распознают антигены и влияют на деятельность других типов Т-клеток, оказывают помощь В-клеткам в образовании антител. По их командам иммунная система направляет Т-лимфоцитов-киллеров, задача которых убивать зараженные клетки. Для того, чтобы "киллеры" нашли и уничтожили противника, им надо отличить нормальные клетки от пораженных. Опознание происходит за счет антигена, расположенного на поверхности клетки. Подобно В-лимфоцитам, каждая T-клетка имеет специфический рецептор, распознающий антиген. С помощью рецепторов T-лимфоциты-киллеры вступают в контакт со своей мишенью. Прикрепившись, они выделяют в просвет между собой и мишенью белок, "продырявливающий" мембрану клетки-мишени, в результате чего клетка гибнет. Затем они открепляются от мишени и переходят на другую клетку, и так несколько раз. Для различения популяций лимфоидных клеток используются специфические белки на поверхности каждой из них. Такие белки-метки получили название CD (групповой маркер). Известно около 200 маркеров. Например, маркером для Т-клеток-хелперов служит белок, названный CD4. Т-лимфоциты способны выполнять свои функции только при определенных условиях и поддержке других клеток, таких как В-лимфоциты и различные фагоцитирующие клетки, в первую очередь макрофаги - большие по размерам клетки, поглощающие и переваривающие микробы и другие погибшие клетки. Существенную роль в работе иммунной системы играют так называемые дендритные (ветвистые) клетки, часть которых находится непосредственно под кожей и слизистой оболочкой человека. Такие клетки (антигенпредставляющие) захватывают микробы и вирусы, проникающие через слизистую, а затем переносят в лимфоузлы, где "представляют" их В- и Т- лимфоцитам, которые их атакуют. Полностью разделить клеточный иммунитет и гуморальный невозможно: в инициации образования антител участвуют клетки, а в некоторых реакциях клеточного иммунитета важную связующую функцию выполняют антитела. Более того, не существует, по-видимому, клеточного иммунитета без образования антител, которые способны различными путями модифицировать опосредованный клетками иммунный ответ. Вообще, при скоординированном иммунном ответе происходит многосторонний обмен сигналами между различными типами вступающих в него лейкоцитов и тканевыми клетками . Реакции цитотоксических T-лимфоцитов При вирусной инфекции, опухолевом росте, отторжении трансплантата основными эффекторными клетками являются цитотоксические T-лимфоциты (CD8 T-клетки, T-киллеры) . Этапы цитолитического действия CD8 Т-клеток включают: - распознавание антигена предшественниками, - пролиферацию и дифференцировку T-клеток до зрелых эффекторов, - собственно процесс лизиса измененных своих вирусинфицированных и раковых клеток или чужеродных клеток трансплантированной ткани. Изучение клеточных и молекулярных механизмов, действующих на каждом этапе, было проведено, главным образом, в опытах in vitro. Приемы экспериментальной работы достаточно просты. Например, к суспензии клеток-мишеней, зараженных вирусом и меченных хромом-51, добавляют примированные к антигенам вируса лимфоциты, которые выделяют от мышей, предварительно иммунизированных данным вирусом. После определенного времени совместной инкубации (4-24 часа), в течение которого происходит лизис клеток-мишеней и выход в супернатант хрома-51, культуральные пробирки центрифугируют и определяют количество метки в супернатанте, являющееся эквивалентом числу разрушенных клеток-мишеней ( рис. 9.1 ). Процесс лизиса чужеродных клеток состоит из нескольких этапов ( рис. 9.2 ). Первый этап - специфическое связывание примированных CD8 T-клеток с поверхностным чужеродным антигеном (пептидами вирусных антигенов, трансплантационных антигенов, раковых антигенов). Взаимодействие антигенраспознающих рецепторов цитотоксических Т-клеток с чужеродным антигеном усиливается дополнительными неспецифическими молекулярными структурами клеточной поверхности, которые обеспечивают наиболее эффективную динамическую адгезию между клетками. Второй этап, получивший название "летального удара", представляет собой основное событие, предопределяющее гибель клетки-мишени. Механическое разобщение эффектора и клетки-мишени на этом этапе не спасает последнюю от гибели. Происходит характерное повышение проницаемости клеточной мембраны, нарушение баланса натрий-калиевого насоса . Механизм, лежащий в основе "летального удара", недостаточно ясен. Одним из факторов, повреждающих мембрану клетки, выступает лимфотоксин (бета-фактор некроза опухолей) . Третий этап, приводящий к лизису клетки-мишени, характеризуется увеличением ее объема за счет все большего проникновения молекул воды через поврежденную мембрану. В результате этих процессов происходит разрыв мембраны клетки-мишени и ее гибель. Эффекторная клетка сохраняется и способна к дальнейшему цитолитическому действию. Стволовые кроветворные клетки: общие сведения любая клетка, обладающая по меньшей мере двумя свойствами, а именно, способностью к самоподдержанию и способностью к дифференцировке (не важно, в одном или в нескольких направлениях) является стволовой клеткой любой обновляющейся ткани (кроветворная система, кожа, кишечник и др.). Стволовые клетки способны восстанавливать кроветворение у облученных животных (радиозащитное действие), длительно поддерживать кроветворение и образовывать колониеобразующие единицы селезенки (двенадцатидневные селезеночные колонии), дающие начало гранулоцитарным, моноцитарным, эритроидным, мегакариоцитарным и лимфоидным колониям. Все клетки гемопоэтического происхождения образуются из примитивных стволовая кроветворная клеток (пСКК), локализованных в костном мозге и дающих начало клеткам четырех основных направлений дифференцировки: - эритроидного ( эритроциты ), - мегакариоцитарного ( тромбоциты ), - миелоидного ( гранулоциты и моноядерные фагоциты ) и - лимфоидного ( лимфоциты ). Дивергенция общего стволового элемента происходит на самом раннем этапе костномозговой дифференцировки. Антигенпрезентирующие клетки в основном, но не исключительно, развиваются из миелоидных клеток-предшественников. Клетки миелоидного и лимфоидного ряда наиболее важны для функционирования иммунной системы. Лимфопоэтическая своловая клетка определяет две самостоятельные линии развития, приводящие к образованию Т-клеток и В-клеток . Первая образующаяся из ГСК клетка-предшественник представляет собой колониеобразующуюся единицу (КОЕ) , которая определяет линии развития, приводящие к образованию гранулоцитов , эритроцитов , моноцитов и мегакариоцитов . Созревание этих клеток происходит под влиянием колониестимулирующих факторов (КСФ) и ряда интерлейкинов , в том числе ИЛ-1 , ИЛ-3 , ИЛ-4 , ИЛ-5 и ИЛ-6 . Все они играют важную роль в положительной регуляции (стимуляции) гемопоэза и продуцируются, главным образом, стромальными клетками костного мозга , но также и зрелыми формами дифференцированных миелоидных и лимфоидных клеток. Другие цитокины (например, ТРФ-бета ) могут осуществлять понижающую регуляцию (подавление) гемопоэза). У всех клеток как лимфоидного, так и миелоидного ряда время жизни ограничено, и все они непрерывно образуются. Плюрипотентные стволовые клетки дают начало коммитированным клеткам-предшественницам, которые уже необратимо определились как предки кровяных клеток одного или нескольких типов. Полагают, что коммитированные клетки делятся быстро, но ограниченное число раз, при этом делятся они под воздействием факторов микроокружения: соседних клеток и растворимых или мембраносвязанных цитокинов . В конце такой серии делений клетки эти становятся терминально дифференцированными, обычно больше не делятся и погибают через несколько дней или недель. Гемопоэтическая стволовая клетка развивается следующим образом. У эмбриона гемопоэз начинается в желточном мешке, но по мере развития эта функция переходит к печени плода и, наконец, к костному мозгу , где и продолжается в течение всей жизни. Гемопоэтическая стволовая клетка, дающая начало всем элементам крови, плюрипотентна и заселяет другие гемо- и лимфопоэтические органы и самовоспроизводится, превращаясь в новые стволовые клетки. Животное можно спасти от последствий облучения в летальных дозах введением клеток костного мозга, которые заселяют его лимфоидную и миелоидную ткани. Во взрослом организме гемопоэтические стволовые клетки находятся главным образом в костном мозге, где они в норме довольно редко делятся, производя новые стволовые клетки (самообновление). Клетку-предшественницу, дающую в культуре клеток начало колонии эритроцитов, называют колониеобразующей единицей эритроидного ряда , или КОЕ-Э , и она дает начало зрелым эритроцитам после шести или даже меньшего числа циклов деления. КОЕ-Э еще не содержит гемоглобин . СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ Клетки, являющиеся исходными при образовании специализированных дифференцированных клеток . Существует иерархия стволовых клеток. Тотипотентные стволовые клетки могут далее давать в процессе последовательных превращений все множество типов клеток организма. Такими клетками являются эмбриональные стволовые клетки . Плюрипотентные стволовые клетки характерижуются способностью давать множество разных типов дифференцированных клеток в определенном типе ткани. К таким клеткам относятся клетки костного мозга, из которых образуются все зрелые клетки крови. Иногда стволовые клетки - родоначальники всех клеток определенной ткани также называют тотипотентными. Унипотентные стволовые клетки способны образовывать только один тип дифференцированных клеток. В отличие от истинно тотипотентных клеток плюрипотентные и унипотентные клетки детерминированы. Это означает что они могут давать только строго определенные типы конечных дифференцированных клеток. Стволовые клетки теоретически способны к неограниченному делению. При делении стволовых клеток часть из дочерних клеток остается стволовыми, другая начинает процесс дифференцировки. Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки. Первичные культуры этих клеток получают из бластоцисты (внутренней клеточной массы) или из первичных половых клеток ранних постимплантационных зародышей. ЭСК, введенные в бластоцель (полость бластоцисты), сохраняют свою тотипотентность и могут участвовать в формировании эмбриональных зачатков и органов развивающегося зародыша. В результате образуется животное - химера - состоящее из клеточных клонов двух разных типов: клеток исходного родительского генотипа и ЭСК. Клетки, осуществляющие иммунный ответ Многие виды клеток различного происхождения предназначены для выполнения специализированных функций в иммунном ответе. Центральная роль всегда принадлежит лейкоцитам . Это лимфоциты , фагоциты и ряд вспомогательных клеток. Две главные популяции лимфоцитов названы B-клетками и T-клетками . Обе популяции специализированы по функциям. B-клетки образуют антитела . Цитотоксические T-лимфоциты уничтожают клетки, инфицированные вирусами. Хелперные T-лимфоциты координируют иммунный ответ путем контактных межклеточных взаимодействий и выделения в межклеточную среду цитокинов , осуществляющих межклеточную передачу сигналов, в том числе помогая B-клеткам в образовании антител. Обе популяции (B- и T-клетки) экспрессируют на своей поверхности антигенраспознающие рецепторы и другие молекулы ( маркеры клеточной поверхности ), с помощью которых осуществляют разнообразные функции. Лимфоциты третьей популяции, имеющие морфологию больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ) , не экспрессируют антигенраспознающие рецепторы и названы нормальными (естественными) клетками-киллерами (НК) . Подобно лимфоцитам, фагоциты также представлены двумя популяциями: мононуклеарными фагоцитами ( моноцитами / макрофагами ) и полиморфноядерными гранулоцитами , часто называемые просто нейтрофилами . К вспомогательным клеткам относятся базофилы , тучные клетки , тромбоциты . Предшественниками всех клеток иммунной системы служат плюрипотентные гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) . Клеточные – это фагоциты. Гуморальные факторы неспецифического иммунитета разнообразны: система комплемента, неспецифические глобулины, С-реактивный белок, интерфероны, цитокины и др. Специфическими факторами иммунитета являются антитела и Т-лимфоциты. Аллерген-специфическая иммунотерапия при аллергии и бронхиальной астме. Вакцинация от аллергии и бронхиальной астмы. Прерогативой врачей аллергологов является метод лечения аллергии, который называется аллерген-специфической иммунотерапией (АСИТ, аллерговакцинацией). С помощью этого метода и пытаются воздействовать на нарушенный (измененный) иммунный ответ. В настоящее время существует множество терминов, обозначающих этот метод лечения - специфическая иммунотерапия (СИТ), аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ), специфическая десенсибилизация, специфическая гипосенсибилизация, иммунотерапия аллергенами, аллерговакцинотерапия, аллерговакцинация. Аллерген-специфическая иммунотерапия обладает рядом преимуществ перед лекарственным лечением. Это традиционный и единственный метод лечения аллергии и бронхиальной астмы, который влияет на иммунологическую природу аллергического воспаления. То есть устраняет, а не подавляет основную причину симптомов аллергии и астмы. Показания к проведению аллерген-специфической иммунотерапии. АСИТ проводится пациентам от 5 до 50 лет, если доказана роль IgE-опосредованной аллергии в течении заболевания. Это прежде всего респираторная аллергия - например, аллергия на пыльцу, аллергия к плесневым грибам, клещам домашней пыли и другим бытовым аллергенам, которая имеет следующие нозологические проявления: поллиноз, сезонный аллергический ринит и/или конъюнктивит; круглогодичный аллергический ринит и/или конъюнктивит; атопическая бронхиальная астма. АСИТ очень эффективна в качестве профилактики серьезных аллергических реакций на жала ос и пчел (при инсектной аллергии). Особым видом специфической иммунотерапии является вакцинотерапия бактериальными аллергенами при инфекционно-аллергической бронхиальной астме. АСИТ эффективна при гормонозависимой бронхиальной астме. Доказана возможность снижения доз применяемых кортикостероидных гормонов и даже полная их отмена после проведения этого метода лечения. АСИТ оказывается эффективной и значительно облегчает течение как основного, так и сопутствующих заболеваний у больных при сочетании астмы с заболеваниями ЛОР-органов, эндокринными, сердечно-сосудистыми, гастроэнтерологическими заболеваниями и неврозами. Механизмы аллерген-специфической иммунотерапии. Так как аллергия - иммунологическая болезнь, то, изменив реактивность иммунной системы, можно ликвидировать и болезнь. Этот метод уменьшает или полностью устраняет симптомы аллергии через "исправление" нарушений в иммунной системе. Гипосенсибилизация - это снижение чувствительности организма к аллергену. Это является одной из целей АСИТ. Снижается чувствительность к аллергенам - уменьшаются или устраняются симптомы аллергии. Механизмы АСИТ многообразны - это перестройка характера иммунного и цитокинового ответа, выработка "блокирующих" антител, снижение выработки IgE, тормозящее влияние на медиаторный компонент аллергического воспаления. АСИТ тормозит как раннюю, так и позднюю фазы немедленной аллергической реакции, угнетает клеточную картину аллергического воспаления, неспецифическую и специфическую гиперреактивность бронхов при бронхиальной астме. Как проводят аллерген-специфическую иммунотерапию. Эффекты аллерген-специфической иммунотерапии. АСИТ предупреждает расширение спектра аллергенов, к которым формируется повышенная чувствительность. Это имеет ОГРОМНОЕ ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ и ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Приостанавливается естественное развитие атопической болезни, которая без курсов АСИТ заканчивается полисенсибилизацией (множественная чувствительность к аллергенам). АСИТ предупреждает утяжеление течения аллергического заболевания и переход более легких клинических проявлений (аллергический ринит) в более тяжелые (бронхиальная астма). После курса АСИТ уменьшается потребность в противоаллергических и противоастматических лекарственных препаратах. Сокращается частота использования симптоматических лекарств и препаратов неотложной помощи - антигистаминные препараты, бронхолитики и т.п. Снижается необходимая потребность в препаратах базисной противовоспалительной терапии, в том числе гормональных средств. После проведения полноценного курса АСИТ отмечается длительная ремиссия аллергического заболевания. При проведении предсезонной аллерговакцинации при поллинозе (перед сезоном аллергии на пыльцу) высока вероятность, что Вы не будете испытывать никаких проблем в работе, отдыхе и спорте в период вашего обычного обострения поллиноза. Эффективность аллерген-специфической иммунотерапии. Примерно у 90% людей с аллергическим ринитом или поллинозом, кто прошел полный курс АСИТ, отмечается ОТЛИЧНЫЙ или ХОРОШИЙ эффект. АСИТ по-прежнему считается основным методом лечения бронхиальной астмы, который воздействует на иммунологическую причину аллергического воспаления в бронхах, и является, пожалуй, единственным методом терапии, обеспечивающим длительную ремиссию бронхиальной астмы. Вероятность ремиссии заболевания в течение 20 лет после окончания 3-летнего курса лечения оценивается в 70%. Главными моментами, которые определяют конечную эффективность курса АСИТ, являются изначальный ВЫБОР ЛЕЧЕБНОГО АЛЛЕРГЕНА (АЛЛЕРГОВАКЦИНЫ) и СХЕМЫ ЛЕЧЕНИЯ. Врачебные ошибки на этапе выбора лечебного аллергена (аллерговакцины) - это самая частая причина неэффективности или малой эффективности АСИТ (аллерговакцинации). Именно здесь должны максимально проявиться искусство и опыт врача-аллерголога. Важным моментом, определяющим эффективность АСИТ, является СУММАРНАЯ ДОЗА лечебного аллергена (аллерговакцины) за курс лечения, которая должна быть значительной. При использовании распространенных "укороченных" схем (обычно в госпитальных условиях) доза лечебного аллергена низкая, а как следствие страдает эффективность. В ряде сложных случаев положительный эффект АСИТ можно усилить с помощью одновременного иммуномодулирующего лечения. СИТ не рекомендуют проводить: у больных активной формой туберкулеза любой локализации при заболеваниях жизненно важных органов (печень, почки, сердце, мозг) с нарушением их функции при психических заболеваниях при заболеваниях эндокринной системы (гипофиз, щитовидная железа, надпочечники) при беременности в возрасте моложе 7 лет и старше 60 лет при заболеваниях с сердечно-сосудистой недостаточностью в фазе обострения заболевания Анафилактический шок. Диагностика. Принципы терапии неотложных состояний 3. Каковы основные механизмы развития анафилаксии? Два основных механизма вызывают активацию тучных клеток и базофилов и, следовательно, анафилаксию. Анафилаксия чаще всего обусловлена иммунными процессами. Неиммунные механизмы приводят к анафилаксии значительно реже, и этот синдром называется анафилактоидной реакцией. По существу, разницы в лечении нет, но распознавание механизма позволяет лучше понять потенциальные причины и способствует более быстрому установлению диагноза. 4. Каков патофизиологический механизм иммунной (классической) анафилаксии? При первом контакте чувствительных особей с антигеном продуцируется иммуноглобулин Е (IgE), который связывается с поверхностными рецепторами эффекторных клеток (тучные клетки, базофилы). При повторном воздействии антигена комплекс антиген-антитело вызывает ток кальция в эффекторную клетку и внутриклеточный каскад реакций, приводящий к дегрануляции ранее синтезированных медиаторов и образованию новых медиаторов. Эти медиаторы ответственны за патофизиологические реакции при анафилаксии. У собак самые ранние признаки анафилаксии — возбуждение с рвотой, дефекацией и мочеиспусканием. По мере прогрессирования реакции угнетается или нарушается дыхание, развивается коллапс, связанный с мышечной слабостью, и сердечно-сосудистый коллапс. Смерть может наступить быстро (примерно в течение 1 ч). На аутопсии обнаруживается тяжелый застой в печени с портальной гипертензией, поскольку печень — главный орган-мишень у собак. Провести соответствующее исследование печени перед смертью, чтобы выявить этот симптом, удается редко. У кошек самый ранний признак анафилаксии — зуд, особенно на морде и голове. Типичные проявления анафилаксии у кошек — бронхоспазм, отек легких и, как следствие, тяжелый дыхательный дистресс. Другие симптомы включают отек гортани и обструкцию верхних дыхательных путей, обильную саливацию, рвоту и потерю координации. Тяжелое нарушение дыхательной и сердечной деятельности приводит к коллапсу и смерти. Анафилактический шок — это терминальная фаза анафилаксии, развивающаяся вследствие нейрогенных и эндотоксических изменений многих органных систем, особенно сердечно-сосудистой и легочной. Первичные и вторичные медиаторы вызывают изменения микроциркуляции, что приводит к скоплению в периферическом русле 60-80 % объема крови. Важный фактор при анафилаксии — повышение проницаемости сосудов и выход жидкости из сосудов. Медиаторы также вызывают гиповолемию, аритмии, снижение сократимости миокарда и легочную гипотензию, которые, в конце концов, приводят к тканевой гипоксии, метаболическому ацидозу и гибели клеток. Клинические признаки анафилактического шока не патогномоничны; они сходны с симптомами тяжелого сердечно-легочного коллапса, возникающего по любой другой причине. 12. Как диагностировать системную анафилаксию? Диагноз основывается на анамнезе, физикальном осмотре и клинической картине. Постоянная настороженность в отношении анафилаксии необходима для быстрой диагностики и начала лечения. Ключевым моментом в диагностике системной анафилаксии являются быстрое прогрессирование клинических признаков поражения органов-мишеней у животных каждого вида и данные анамнеза о недавнем контакте животного с веществом, вызывающим анафилаксию. 14. Каково начальное лечение системной анафилаксии? Неотложное лечение анафилаксии включает обеспечение доступа к дыхательным путям и сосудам, интенсивную жидкостную терапию и введение адреналина. В зависимости от тяжести состояния респираторная помощь охватывает мероприятия от оксигенотерапии через лицевую маску до оротрахеальной интубации; иногда требуется выполнение трахеостомии. В искусственной вентиляции могут нуждаться животные с тяжелым поражением дыхательных путей, отеком легких и бронхоспазмом. Для введения растворов и лекарственных препаратов важно обеспечить сосудистый доступ, лучше — центральный венозный. Инфузионную терапию назначают на основании выраженности шока, но ветеринарный врач должен быть готов к введению шоковых доз изотонических кристал-лоидных растворов и, возможно, коллоидных. Использование адреналина — краеугольный камень в лечении анафилаксии, так как устраняет бронхоспазм, поддерживает артериальное давление, тормозит дальнейшую дегрануляцию тучных клеток, увеличивает сократимость миокарда и частоту сердечных сокращений и улучшает коронарный кровоток. Рекомендуемая доза — 0,01-0,02 мг/кг внутривенно. Это соответствует 0,01-0,02 мл/кг 1 : 1000 раствора гидрохлорида адреналина. Если обеспечить венозный доступ не удалось, удвоенную дозу можно ввести интратрахеально. В тяжелых случаях при устойчивой гипотензии и сужении бронхов дозу повторяют каждые 5-10 мин или вводят адреналин путем постоянной инфузии со скоростью 1-4 мкг/кг/мин. 15. Какова вспомогательная терапия при системной анафилаксии? Вспомогательная терапия при анафилаксии включает использование антигистамин-ных средств, глюкокортикоидов и (при необходимости) дополнительных поддерживающих мероприятий для лечения гипотензии, отека легких, бронхоконстрикции и аритмий. Хотя антигистаминные и глюкокортикоидные препараты действуют достаточно медленно и не могут быть полезны в начальный период лечения анафилаксии, они играют важную роль в предупреждении поздних реакций и осложнений, вызванных вторичными медиаторами. Наиболее часто применяемый антигистаминный препарат — дифенгидрамин (5-50 мг/кг, внутривенно медленно 2 раза в день). Некоторые авторы рекомендуют конкурентное использование Н2-антагонистов (например, циметидин 5-10 мг/кг внутрь каждые 8 ч). Из глюкокортикоидов чаще всего назначают дексаметазона натрия фосфат (1-4 мг/кг внутривенно) и преднизолона натрия сукцинат (10-25 мг/кг внутривенно). Кдопамину (2-10 мкг/кг/мин) нередко прибегают для поддержки артериального давления и функции сердца. Аминофил-лин (5-10 мг/кг внутримышечно или внутривенно медленно) рекомендуется в случаях стойкой бронхоконстрикции. Противоопухолевый иммунитет Рак начинается с мутации ДНК одной или нескольких клеток, что приводит к их бесконтрольному делению. В нормальных клетках процесс деления жестко контролируется на всех уровнях. Поэтому для возникновения злокачественной опухоли обычно нужна не одна, а целая серия мутаций. Сначала опухоли растут очень медленно. Это значит, что перед иммунной системой стоит задача узнать буквально несколько десятков поврежденных клеток среди триллионов нормальных. Иначе, иммунитет призван не только осуществлять антиинфекционную защиту, но главным образом обеспечивать генетическую целостность соматических клеток организма в течение его индивидуальной жизни. Среди всех иммунологических факторов, принимающих участие в защите организма от неоплазм (опухолей), главная роль принадлежит клеточной форме защиты. Наиболее активными клетками в разрушении опухоли являются CD8 Т-клетки, Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) или Т-киллеры и Т-хелперы. Если ЦТЛ выполняют прямую киллерскую функцию, то Т-хелперы способствуют её успешной реализации через секрецию цитокинов (интерферон-g, стимулирующий макрофаги и увеличивающий активность НК-клеток). Активность ЦТЛ проявляется в результате распознавания комплекса – пептид опухолевого антигена+молекула 1 класса МНС. Механизм действия ЦТЛ на опухолевую клетку следующий: в т.н. «тёмных органеллах» внутри Т-киллера содержится белок–полимер перфорин, который в момент контакта ЦТЛ с клеткой–мишенью выбрасывается на поверхность оболочки клетки мишени, полимеризуется в присутствии ионов Са+, образуя поры-т.н. «перфориновые дыры». В результате, вода и соли через эти поры проходят легко, а белки задерживаются, осмотическое давление снаружи и внутри выравнивается и клетка гибнет. В-клетки. Участие В-клеток в противоопухолевом иммунитете может проявлятся несколькими способами: разрушение опухолевых клеток антителами, фиксирующими комплемент; накопление НК-клеток, имеющих на своей поверхности цитофильные антитела; Натуральные киллеры. Они относятся к лимфоидным клеткам, но при этом лишены маркеров Т- и В-лимфоцитов. Набор клеток, подвергающихся литическому действию НК, достаточно широк. Это — ряд вирусинфицированных и опухолевых клеток, клеток, на поверхности которых представлены цитофильные антитела, эмбриональные клетки. Несмотря на то что НК морфологически напоминают лимфоциты или лимфобласты, их гистогенетическая связь с Т- или В-лимфоцитами не установлена. НК относятся к самостоятельной линии дифференцировки, хотя на самых ранних этапах развития у них имеется общий с лимфоцитами предшественник. В отличие от лимфоцитов, НК не имеют антигенраспознающих рецепторов, не увеличиваются количественно после взаимодействия с чужеродным (например, вирусным) антигеном и не способны к формированию иммунологической памяти. При этом их активность повышается под влиянием цитокинов Т-клеток и интерлейкина-γ. Макрофаги. В исследованиях установлено, что макрофаги, активированные цитокинами Т-клеток, оказывают определенное противоопухолевое действие. Оно может быть связано как с явлением прямого фагоцитоза опухолевых клеток, так и с процессом, опосредованным Фактором Некроза Опухоли. Иммунологические методы диагностики инфекционных заболеваний .А. РИА — высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген—антитело, один из компонентов которой несет радиоактивную метку. Метод позволяет обнаруживать как антигены, так и антитела и определять их концентрацию в исследуемой пробе. Б. Иммунофлюоресцентный анализ также применяют для выявления как антигенов, так и антител. Этот метод основан на использовании реагентов, меченных флюоресцентным красителем. Антитела чаще всего метят флюоресцеина изотиоцианатом. Меченые антитела связываются с антигеном, образуя комплексы, которые можно выявить с помощью флюоресцентной микроскопии. Существуют три модификации иммунофлюоресцентного анализа. 1. Метод прямой иммунофлюоресценции применяют для выявления антигенов. Он основан на непосредственном связывании антигена, сорбированного на твердой подложке, с мечеными антителами. Реакцию оценивают с помощью флюоресцентного микроскопа. 2. Метод непрямой иммунофлюоресценции позволяет выявить антитела к известному антигену. Антиген, сорбированный на твердой подложке, связывается с немечеными антителами. Комплексы антиген—антитело выявляются с помощью меченых антител к иммуноглобулинам. 3. Метод конкурентной иммунофлюоресценции основан на связывании стандартного меченого и присутствующего в исследуемой пробе немеченого антигенов с антителами, сорбированными на твердой подложке. Поскольку меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в исследуемой пробе. В. Методы, основанные на реакции преципитации. При взаимодействии растворимых антигенов с антителами образуются высокомолекулярные комплексы антиген—антитело, которые выпадают в виде осадка в растворе или откладываются в виде полос преципитации в геле. Использование очищенных антигенов позволяет определить концентрацию антител в исследуемой пробе. 1. Преципитация в растворе. При добавлении антигена в возрастающей концентрации к одному и тому же количеству антител выпадает разное количество преципитата. Можно построить график — кривую преципитации, — который отражает зависимость между концентрацией антигена и количеством преципитата: при избытке антител количество преципитата возрастает с увеличением концентрации антигена, в зоне эквивалентности (количество антигена примерно равно количеству мест связывания на антителах) образуется максимальное количество преципитата, при избытке антигена количество преципитата уменьшается с увеличением концентрации антигена. 2. Иммунодиффузия — наиболее распространенный из всех методов, основанных на реакции преципитации (см. гл. 20, пп. I.Б—В). а. Простая радиальная иммунодиффузия. Суть метода заключается в следующем: 1) в тонком слое геля, содержащего антитела в известной концентрации, вырезают лунки; 2) антиген, помещенный в эти лунки, диффундирует в гель; 3) вокруг лунок образуются кольца преципитации, диаметр которых пропорционален концентрации антигена. Метод обычно применяется для определения концентрации иммуноглобулинов. б. Двойная радиальная иммунодиффузия. Суть метода заключается в следующем: 1) в тонком слое геля вырезают лунки для антигена и антител; 2) антиген и антитела диффундируют навстречу друг другу, образуя линии преципитации на некотором расстоянии от лунок. По расстоянию от лунки с антигеном до линии преципитации можно определить концентрацию антигена. 3. Электрофорез а. Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание двух методов — иммунодиффузии и зонального электрофореза. Иммуноэлектрофорез применяется в основном для исследования сывороточных белков. Суть метода заключается в следующем: 1) в лунку, вырезанную в тонком слое геля, помещают исследуемую сыворотку; 2) проводят электрофоретическое разделение белков сыворотки; 3) в геле вырезают бороздку, параллельную направлению миграции белков при электрофорезе, и заполняют ее смесью антител к сывороточным белкам; 4) разделенные при электрофорезе белки (антигены) и антитела диффундируют навстречу друг другу. В местах связывания антител с антигенами образуются дуги преципитации (см. гл. 20, п. I.А). б. Встречный электрофорез. Суть метода заключается в следующем: 1) исследуемые антигены и смесь антител помещают в лунки, расположенные на противоположных концах пластины с гелем; 2) вдоль линии, соединяющей лунки, пропускают постоянный электрический ток; 3) в электрическом поле антитела и антигены быстро перемещаются по направлению друг к другу; 4) в месте связывания антигенов с антителами образуются линии преципитации. Встречный электрофорез применяют в тех случаях, когда антигены и антитела обладают разной электрофоретической подвижностью. Этот метод позволяет быстро определить антигены или антитела в исследуемой пробе и применяется в экспресс-диагностике инфекционных заболеваний. Г. Методы, основанные на реакции агглютинации, довольно чувствительны и применяются для выявления антигенов на поверхности клеток или частиц и полуколичественного определения антител к этим антигенам. Суть методов заключается в следующем: при связывании клеток или частиц, покрытых антигеном, с антителами образуются крупные агрегаты. Для определения титра антител к поверхностным антигенам клеток или к антигенам, сорбированным на поверхности частиц, смешивают известное количество клеток или частиц, покрытых антигеном, с разными разведениями исследуемой пробы, например сыворотки. 1. Реакция прямой агглютинации применяется для выявления поверхностных антигенов микробов или клеток крови и антител к этим антигенам. Суть метода заключается в следующем: серийные разведения исследуемой пробы (например, сыворотки) смешивают с клетками, за титр антител принимают величину, обратную максимальному разведению сыворотки, которое вызывает агглютинацию. Этот метод более чувствителен, чем методы, основанные на преципитации, поскольку при равной концентрации антигена объем агглютината больше объема преципитата. Реакция агглютинации не зависит от температуры, если только не обусловлена холодовыми агглютининами, которые более эффективны при температуре ниже 37°C. 2. Реакция непрямой агглютинации основана на агглютинации эритроцитов, других клеток или частиц (например, латекса или бентонита), покрытых антигеном. Для определения титра антител серийные разведения сыворотки в физиологическом растворе смешивают с известным количеством покрытых антигеном клеток или частиц. Реакция непрямой агглютинации — чувствительный метод, позволяющий определять растворимые антигены в низких концентрациях. Д. Реакция связывания комплемента. Суть метода заключается в следующем: 1) антиген смешивают с антителами; 2) к образовавшимся комплексам антиген—антитело добавляют известное количество комплемента, который связывается с этими комплексами; 3) количество несвязанного комплемента оценивают в реакции гемолиза с эритроцитами барана. Е. Твердофазный ИФА — надежный, экономичный и высокочувствительный метод. Он основан на использовании стандартных препаратов очищенных антигенов или антител, ковалентно связанных с ферментом. Эти препараты сохраняют и иммунологические свойства, и ферментативную активность, которую можно измерить при добавлении субстрата данного фермента (см. гл. 20, п. I.Е). Определение жизнеспособности может проводиться различными методами. Наиболее простым является добавление специальных красителей, которые проникают внутрь клетки только при повреждении её оболочки. Таким образом, окрашенные клетки признаются не жизнеспособными. Естественно, краситель добавляется не в весь полученный материал, а только в его образец с последующим расчетом уровня жизнеспособности всех забранных клеток. Более сложные и точные методики оценки жизнеспособности сводятся к определению возможности клеток осуществлять свои функции. Для этого в первичной культуре вычисляют уровень содержания специфических веществ, которые вырабатываются клетками в нормальном состоянии. Снижение концентрации этих веществ указывает на то, что внешне неповреждённая клетка может оказаться функционально неполноценной, то есть не пригодной для дальнейшего использования. Хорошие биотехнологические лаборатории (в частности, МЦБ «Биостэм») способны получить в первичной культуре до 70-80% жизнеспособных клеток. После определения жизнеспособности производят подсчёт количества живых клеток в специальных камерах либо с использованием лазерного цитометра. МЦБ «Биостэм» для этой цели применяет проточный лазерный цитофлюориметр фирмы "Becton Dickinson". Ещё одним важным аспектом является идентификация полученных клеток, то есть определение какие конкретно клетки получены. Для этого используют специальные реактивы (моноклональные антитела), которые могут связываться только с определёнными типами клеток (см. также раздел «сепарация»). Серологические реакции.
АГ + АТ меченные флюорохромом. Дают контакт 30 минут при 37 С, затем производят тщательный отмыв в физрастворе. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом.
АГ + АТ с ферментом. Контакт, отмыв, затем добавляют субстрат, который при контакте с АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию.
АГ + АТ + комплемент. Контакт. Затем добавляют гем-систему (гемолизин + эритроциты барана). Контакт. Если гемолиза не происходит, значит АГ и АТ связали комплемент. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная.
АГ + АТ (диффузия в агаровом геле). Метод обнаружения – образование контура преципитации.
Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов.
Вирус + АТ. Контакт. Ввод в чувствительную к вирусу систему. Метод обнаружения – нейтрализация инфекционной активности вируса. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА, РСК (Complement fixation test) В основе ее лежит способность комплемента, многофункционального белкового фактора сыворотки теплокровных животных, связываться комплексом антиген-антитело; несвязавшийся комплемент достаточно легко определяется по лизису бараньих эритроцитов, предварительно сенсибилизированных специфическими гемолизинами. При подборе соответствующих концентраций комплемента он будет выявляться только в том случае, когда взаимодействия антигена и антител в испытуемой (или опытной) системе не происходит. На ранних этапах изучения гепатита В она использовалась как метод обнаружения поверхностного антигена вируса гепатита В и антител к нему. В реакции связывания комплемента удавалось титровать антитела к вирусу гепатита А , когда в качестве антигена бралась взвесь вирусных частиц, полученная в результате сложной многоступенчатой экстракции из печени зараженных обезьян. После появления твердофазных иммунологических тестов интерес к использованию реакции связывания комплемента был полностью утрачен. (РНГА; син. реакция пассивной гемагглютинации) метод обнаружения и идентификации антигенов или антител, основанный на возникающем в их присутствии феномене агглютинации эритроцитов, на поверхности которых были предварительно адсорбированы соответствующие специфические антитела или антигены. ГНОТОБИОНТЫ [от греч. gnotos — известный, определенный и бионт (ы)], безмикробные животные и животные, выращенные в стерильных условиях в период постнатального развития. Обычно Г. получают путем кесарева сечения и содержат в спец. боксах, в к-рых отсутствуют микробы (подаются стерильный воздух, пища, вода). Г. не подвержены воздействию сапрофитной или патогенной микрофлоры воздуха, вследствие этого, в отличие от обычных животных, их реакции на воздействие факторов окружающей среды более выражены. Трансгенных животных получают в результате искусственного введения - трансгеноза - чужеродного генетического материала, представляющего из себя фрагмент гена или иную последовательность ДНК, в оплодотворенную яйцеклетку или в ранние зародыши млекопитающих. Подобные модели являются идеальными экспериментальными системами для исследования молекулярно- генетических основ онтогенеза, для изучения функции чужеродного гена, оценки его биологического действия на организм, а также для производства различных манипуляций со специфическими клеточными клонами in vivo. Трансгенные животные являются удобным объектом для анализа роли отдельных элементов гена в регуляции его работы. Так, сопоставление характера экспрессии введенного гена у животных, различающихся по длине фланкирующих последовательностей инъецированной ДНК, дает возможность обнаружить элементы гена, контролирующие его работу в разных типах тканей. Для облегчения анализа регуляторных последовательностей гена часто вводят генетические конструкции, сочетающие эти элементы с геном- репортером, экспрессия которого выражается в появлении известной и легко определяемой ферментативной активности. Использование для трансгеноза рекомбинантных молекул ДНК, представляющих собой различные комбинации регуляторных элементов и кодирующих последовательностей, ведет к более глубокому пониманию молекулярных механизмов активации генов в разных типах тканей. Путем скрещивания мышей различных линий получают оплодотворенные зиготы. Перед слиянием мужского и женского пронуклеусов в зиготу в мужской пронуклеус (он больше) путем микроинъекции вводят ДНК, которую хотят внедрить в геном.Обработанные таким образом зиготы инкубируют в СО2 инкубаторе. Зиготы подсаживают в матку ложнобеременной (Да! их получают скрещиванием с вазэктомированными самцами) самке мыши. Она приносит потомство, которое может оказаться трансгенным, если микроинъецированная ДНК встроилась в геном путем рекомбинации. (Всегда необходимо доказать трансгенность, для этого существуют разные пути, см. Трансгеноз: трудности идентификации трансгенности ) Трансгенных потомков (они гетерозиготны по введенному гену) скрещивают с гомозиготными мышами и получают генерацию F1, среди которой, как и положено, половина гетерозигот. Скрещивают между собой гетерозигот поколения F1 и получают гомозиготных по введенному гену мышей. Если есть желание, чтобы ген не только встроился, но еще и экспрессировался , его нужно снабдить подходящими регуляторными элементами - промоторами, энхансерами и т.п., но об этом позже. Сейчас важно, что мы ввели требуемую генетическую информацию в геном животного, и она наследуется. Парасексология восторжествовала. ДНК в геном животного можно вводить и другими способами. аннтитела моноклональные Гибридомы - это бессмертные клеточные клоны, продуцирующие антитела одной специфичности. При этом, естественно, все молекулы иммуноглобулинов , продуцируемые определенной гибридомой, идентичны: они относятся к одному классу и одному аллотипу , имеют одинаковые вариабельные области , структуру, идиотип , аффинность и специфичность к данному эпитопу . Однако моноклональные антитела иногда совершенно неожиданно связываются с посторонними антигенами, тем не менее эти трудности могут быть преодолены при использовании набора моноклональных антител с топографически перекрывающимися детерминантами, или же набора антител к нескольким детерминантам одного антигена. Области применения моноклональных антител: - идентификация субпопуляций лимфоцитов человека ,истощение клеточных популяций ,выделение клеток ,установление функций молекул клеточной поверхности ,определение группы крови , диагностика опухолей ,локализация опухолей ,иммунорадиометрический анализ, анализ сложных смесей антигенов , анализ эмбрионального развития ,моноклональные мутантные антитела ,квадромы ,анализ иммунного ответа ,искусственные ферменты. Перспективы использования гибридомной техники поражают воображение. Особенно ценными станут гибридомы, продуцирующие человеческие моноклональные антитела, которые можно будет применять для терапевтических целей. олучение моноклональных антител Как образуются антитела? Иммунный ответ - сложный процесс межклеточных взаимодействий различных типов лимфоидных клеток с участием специальных гормонов, в результате чего В-лимфоциты начинают активно синтезировать и выделять в кровь специфические антитела против данного антигена. На поверхности В-лимфоцитов существуют рецепторы, аналогичные антителам, взаимодействие которых с антигеном в сложном межклеточном комплексе служит стимулом для начала биосинтеза антител. Получение антител для нужд человека начинается с иммунизации животных. После нескольких инъекций антигена в присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. Антитела выделяют из сыворотки в виде g-глобулиновой фракции, осаждая сыворотку крови сульфатом аммония, спиртом, ПЭГ и другими веществами. Полученные антитела содержат много примесных белков. Высокоочищенные антитела выделяют с помощью ионообменной хроматографии. Стандартные препараты получить довольно сложно, так как состав их зависит от вида животного, его индивидуальных особенностей, цикла иммунизации, других малоконтролируемых факторов. В то же время, для современного биохимического анализа очень важна специфичность, то есть способность выделить данное вещество в сложных многокомпонентных средах, таких, как сыворотки крови, сок растений, ферментная среда. Такое возможно при использовании иммунохимического метода, использующего антитела, взаимодействующие узко специфично по принципу "антиген - антитело". Для проведения такого анализа необходимы абсолютно идентичные антитела, синтез которых обычными способами не приемлим. Решение проблемы было предложено в 1975 году английскими учеными Георгом Кёлером и Цезарем Мильштейном. Они разработали методику получения клеточных гибридов - гибридом. Гибридомы образуются в результате слияния лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, с клетками миеломы костного мозга, культивируемыми in vitro. Животное иммунизируют, в ответ на введение антигена в организме мыши активизируются продуцирующие антитела В-лимфоциты. Эти клетки могут жить только в организме хозяина, при переводе на искусственную питательную среду они гибнут. Если слить иммунную клетку с опухолевой, образуются гибридные клетки, способные неограниченно долго жить в искусственных средах. Одновременно они сохраняют способность синтезировать антитела. Гибридомы, синтезирующие определенные виды антител, отбирают на селективных ростовых средах. Затем их помещают в культуральную жидкость, в которой они размножаются и образуют много родственных клеток (клон). Такие клоны могут синтезировать антитела, получившие название моноклональных (МКА). МКА - антитела, однородные по структуре и специфичности, которые можно производить в неограниченных количествах. Другой метод получения антител основан на инъекции полученной гибридомы в брюшную полость мышки. Там гибридома реплицируется и вызывает образование асцитной опухоли (скопления клеток, плавающих в жидкости, заполняющей брюшную полость). Асцитная жидкость, выделенная из этой мыши, представляет суспензию, содержащую антитела. Клетки и белки, не относящиеся к МКА, удаляются. Оставшийся материал, представленный преимущественно антителами, используют. Этот метод позволяет получать высококонцентрированные препараты антител. Но массовое производство требует одновременного использования нескольких тысяч мышей. Кроме того, получаемый материал требует доочистки. Это дорого и трудоемко, поэтому в настоящее время предпочтение отдается первому способу, с использованием культуры клеток. |