ЛЕКЦИИ Регуляция метаболизма Курс лекций. Е.А. Николайчик. Курс лекций Минск 2002 II
 Скачать 2.61 Mb.
|
|
1.1 Оперонная организация бактериальных генов Исторически сложилось так, что первые работы по регуляции метаболизма были сделаны при изучении утилизации лактозы бактериями Escherichia coli. Для описания лактозного метаболизма Жакоб и Моно в 1961 г. ввели термин "оперон". Оперон, как вы помните, представляет собой группу из двух или более структурных генов (иногда говорят и о моноцистронных, т.е. содержащих один ген, оперонах), кодирующих тесно связанные между собой функционально белки, совместно транскрибируемых и находящихся под общим контролем. Такой контроль осуществляется продуктом регуляторного гена, действие которого осуществляется через оператор находящийся в непосредственной близости к промотору. Как промотор, так и оператор являются короткими (пару десятков нуклеотидов) последовательностями ДНК, предшествующими контролируемым структурным генам. Рассмотрим структуру абстрактного оперона подробнее. Он состоит из следующих элементов: 1. Промотор - участок ДНК, с которым происходит связывание РНК-полимеразы и который определяет точку начала транскрипции. Типичный пример - TTGACA - 17 bp - TATAAT. В зависимости от типа промотора (а точнее, от типа распознающей его сигма - субъединицы РНК полимеразы) конкретная последовательность промотора варьирует. 2. Operator - участок связывания регуляторного белка. Размер - около 20 bp. Располагается в непосредственной близости к промотору или же перекрывается с ним. В случае негативных регуляторов, или репрессоров, оператор, как правило, располагается непосредственно за промотором, или перекрывается с ним. В случае позитивных регуляторов (активаторов) оператор обычно располагается перед промотором. В любом случае связывание регуляторного белка с оператором меняет частоту инициации транскрипции. У многих (возможно, у большинства) оперонов имеется не один, а несколько сайтов связывания с регуляторными белками, которые не обязательно располагаются рядом и могут вообще находиться по разные стороны от промотора. В этих случаях термин "оператор" в классическом смысле становится неудобным, в связи с чем сейчас чаще просто говорят о сайтах связывания регуляторов. 3. Структурные гены. Кодируют белки, непосредственно производящие фенотипический эффект. Именно для контроля их экспрессии, собственно, и существуют оперонные структуры вместе со своими регуляторами. 4. Терминатор транскрипции. Здесь заканчивается синтез мРНК. Не входит в оперон, но является необходимой частью регуляторной системы ген-регулятор, кодирующий регуляторный белок, связывающийся с оператором. Ген-регулятор может находиться рядом с контролируемым им опероном, но часто располагается совсем в другом участке хромосомы. Почти всегда у гена-регулятора свой промотор и терминатор. В регуляции участвуют, как правило, и низкомолекулярные вещества-эффекторы, являющиеся либо индукторами, либо корепрессорами структурных генов. В зависимости от влияния на их работу низкомолекулярных молекул-эффекторов различают индуцибельные и репрессибельные (-руемые) опероны. В зависимости от эффекта связывания регуляторного белка с оператором опероны могут иметь негативный или позитивный контроль. Т. о., можно выделить четыре типа оперонов: (ТИПЫ ОПЕРОНОВ) (принципы работы в каждом случае) lac оперон lacZ - гидролиз до глю и гала lacY - галактозидпермеаза - 3 - lacA - галактозидтрансацетилаза без лактозы - следовые колич трех белков с лактозой к-во стр белков увеличивается в 1000 раз. ген-регулятор лактозного оперона - lacI, - кодирует белок-репрессор. В активной форме это тетрамер. Клетки с инактивацией lacI конститутивны по синтезу всех трех ферментов. Если в клетке появляется индуктор, он конкурирует с оператором за молекулы репрессора. Связывание индуктора с репрессором освобождает оператор и позволяет РНК-полимеразе начать транскрипцию. В качестве индуктора может выступать лактоза (вернее, аллолактоза) и еще несколько сахаров и их неметаболизируемых аналогов. Даже в отсутствие индуктора базовая активность галактозидпермеазы достаточна, чтобы обеспечить транспорт индуктора в клетку. Однако одно только снятие репрессии недостаточно для обеспечения наблюдаемого тысячекратного увеличения транскрипции генов оперона. Как оказалось, lac-оперон находится также и под влиянием позитивной регуляции. Непосредственно перед промотором lac-оперона располагается сайт связывания с активаторным белком CAP (Catabolite Activator Protein, CRP) или БАК (БРЦ). Связывание этого белка со своим оператором приводит к усилению транскрипции оперона. CAP является апоиндуктором, и для связывания с ДНК должен образовать комплекс с цАМФ. Комплекс CAP-cAMP играет роль в явлении, называемом катаболитной репрессией или глюкозным эффектом. Суть этого явления, которое мы будем более детально рассматривать позднее, заключается в том, что в присутствии глюкозы утилизация целого ряда источников углерода (в т.ч. и лактозы) ингибируется. Причиной этого является снижение концентрации цАМФ, и следовательно, комплекса CAP-cAMP, активирующего транскрипцию. Диауксия 1.2 Как работают регуляторные белки? Связывание регуляторных белков с ДНК Чтобы понять действие регуляторного механизма, необходимо знать, как происходит взаимодействие белка-регулятора с оператором. Вспомните структуру ДНК. - большой и малый желобки - Атомы, лежащие вдоль краев пар оснований "смотрят" в эти желобки. Каждой паре оснований соответствует свой набор химических групп, который может узнавать белок. (это не те группы, которые участвуют в комплементарном спаривании оснований). Все ДНК-связывающие белки имеют выступы, встраивающиеся в большой (как правило) желобок и "читающие" последовательность оснований ДНК. 1. Оператор. Все о. почти симметричны (палиндромы). Разные сайты, взаимодействующие с одним и тем же белком, сходны, но не идентичны. Различия в последовательности обеспечивают различное сродство белков к различным операторным сайтам. 2. Репрессор. Репрессор обязан иметь ДНК-связывающий домен. В одном из наиболее распространенных случаев его основу составляют две α-спирали, расположенные под углом друг к другу т.о., что одна из спиралей ложится в большую бороздку ДНК. Кроме того, часть белков имеет на N-конце гибкую "руку", охватывающую молекулу ДНК со стороны, противоположной узнающей спирали. Т.о., белок может прочно связаться с ДНК только в том случае, если имеется соответствие между боковыми цепями АК узнающей альфа-спирали и функциональными группами ДНК, экспонированными в большой желобок. Очень часто ДНК-связывающие белки имеют второй домен, отвечающий за димеризацию белка. При наличии таких доменов сила связывания репрессора с ДНК резко возрастает. Именно поэтому операторы имеют структуру палиндрома - с каждой половиной оператора взаимодействует одна молекула белка, причем связывание одной молекулы ускоряет - 4 - связывание второй, в результате сила связывания регуляторного белка с оператором возрастает. Такое явление называется кооперативностью. Более того, зачастую операторные сайты располагаются рядом, и тогда связывание одного димера белка может кооперативно способствовать связыванию второго димера. Результатом кооперативного связывания является сигмоидная кривая зависимости эффективности транскрипции от концентрации репрессора (или активатора). Это обеспечивает легкость переключения регуляторной системы из одного состояния в другое. Каков же результат связывания регуляторного белка с оператором? В случае репрессоров такое связывание либо создает стерическое затруднение для связывания РНК-полимеразы с промотором либо препятствует дальнейшему продвижению РНК-полимеразы в тех случаях, когда оператор расположен после промотора. В случае активаторов возможны несколько механизмов: - непосредственное взаимодействие активатора с полимеразой, обеспечивающее более сильное связывание с промоторной областью; облегчение локального расплетания ДНК в области промотора (необходимого для инициации транскрипции) либо за счет внесения изгиба в ДНК либо за счет увеличения отрицательной суперскрученности. Тщательный анализ ряда оперонов E. coli показал, что часть белков, первоначально описанных как репрессоры, может работать и активаторами (и наоборот). Два классических примера – cI и БАК. Различный эффект связывания одного и того же белка с промоторной областью объясняется просто. Репрессия происходит при связывании белка там, где он может предотвратить связывание РНК-П или активатора. Для оказания же активаторного действия белок должен обладать способностью связываться с РНК-П (обычно это слабое, но специфическое связывание) и иметь сайт связывания с ДНК в непосредственной близости к промотору. Lac репрессор тетрамер кооперативное связывание с двумя операторами 10 копий на клетку 4000 мутантов JH Miller'a Gal репрессор димер похож на LacI, но короче с С-конца (участвующего в формировании тетрамера у LacI) для репрессии необходимо связывание двух димеров Gal репрессора и гистоноподобного белка HU между ними. Почему димер? 1.3 Взаимодействие регуляторных белков с РНК-полимеразой Бактериальные промоторы содержат специфические элементы, распознаваемые холоферментом РНК-полимеразы. Гексамеры –10 и –35 распознаются специфическими поверхностями областей 2 и 4 σ- субъединицы РНК-полимеразы. Как правило, одних этих гексамеров оказывается недостаточно. Расположенные выше элементы входят в контакт с карбокси-концом α-субъединицы РНК-полимеразы. Некоторые промоторы, к тому же, имеют расширенный –10 элемент, контактирующий с дополнительным районом области 2 σ-субъединицы РНК-полимеразы. Разные промоторы имеют различные комбинации этих элементов, и в ряде случаев узнавания этих дополнительных последовательностей оказывается достаточно для полноценного связывания РНК-полимеразы, но в большинстве случаев для нормальной инициации транскрипции необходимо присутствие активатора. Активатор может быть необходим для начального связывания РНК-полимеразы с промотором, для ее изомеризации из закрытого в открытый комплекс, либо для освобождения промотора (начала собственно транскрипции). Две модели были предложены для объяснения действия активаторов. В соответствии с первой из них активатор вступает в непосредственный контакт с РНК-П. Вторая модель предполагает отсутствие непосредственного контакта с РНК-П; по этой модели активатор изменяет конформации промоторной ДНК, облегчая инициацию транскрипции. Вторая модель довольно часто привлекалась для объяснения - 5 - механизма действия БАК, но в настоящее время большинство фактов свидетельствует в пользу первой модели даже для этого белка. В соответствии с местом контакта активатора с РНК- П активаторы можно подразделить на следующие группы (Рис. 1.1.) Контактирующие с карбокси-концом α-субъединицы РНК-П ( αCTD) Наиболее изученным представителем этого класса является БАК. Сайт связывания для этого белка располагается перед –35 последовательностью. Интересно, что сайты связывания активаторов этого класса располагаются на различных расстояниях от промотора. Это объясняется структурой αCTD. Эта субъединица РНК- полимеразы состоит из двух доменов, соединенных между собой гибким линкером. N-концевой домен контактирует с другими субъединицами РНК-полимеразы и поэтому жестко зафиксирован, тогда как αCTD достаточно подвижен и поэтому может контактировать с активаторами, удаленными на различное расстояние. Естественно, это возможно, только если активатор контактирует с ДНК с той же стороны, что и РНК-П. Поэтому БАК может активировать транскрипцию, связываясь с ДНК в области –61 (как у lac промотора), либо в позициях –71, -81, -91. Какова же роль αCTD в этих процессах? Эксперименты с замещением аминокислотных остатков показывают, что для активации необходима ДНК- связывающая поверхность, а также некоторые основания, необходимые для взаимодействия с конкретным активатором. Какова же роль такого взаимодействия? В экспериментах по замещению αCTD карбокси-концевым доменом репрессора фага λ (cI) было показано, что такая гибридная cI- α субъединица способна обеспечивать активацию промотора при взаимодействии с полноразмерным cI на промоторе с сайтом связывания с cI. Поскольку структура cI совершенно отлична от таковой αCTD, это свидетельствует о том, что любой дополнительный контакт с промоторной областью способен усиливать транскрипцию, не изменяя локальной структуры ДНК. Активаторы, контактирующие с σ 70 -субъединицей РНК-полимеразы А точнее, с ее областью 4. Наиболее изучен пример белка cI бактериофага λ. В качестве активатора этот белок связывается с сайтом, перекрывающимся с –35 элементом промотора P RM . В отличие от предыдущего класса активаторов позиция сайта связывания в данном случае определяется достаточно жестко (поскольку позиция σ 70 по отношению к промотору тоже жестко фиксирована). Активаторы, контактирующие с другими областями РНК-полимеразы Принцип действия рассмотренных выше примеров активаторов основан на стабилизации уже существующих контактов с ДНК двух поверхностей РНК-П. Это наиболее простой путь, но имеются примеры и контактов активаторов с другими участками ( и субъединицами) РНК-П. Тот же БАК контактирует с N-концевым доменом α-субъединицы в тех случаях, когда сайт связывания перекрывается с областью –35 промотора. Белок DnaA активирует промотор P R фага λ за счет контактов с β' субъединицей РНК-П. Активаторы, имеющие два контакта с РНК-П. -35 -10 b / b ' σ 70 a CT D a NTD R NAP (a) -35 сайт связывания активатора -10 b / b ' a CT D a NTD (b) -35 -10 b / b ' a CT D a NTD (c) -35 -10 b / b ' a CT D a NTD (d) AA AA AA Region 4 Region 4 s 70 s 70 s 70 Рис. 1.1. Контакты активатора транскрипции с РНК-полимеразой - 6 - В тех случаях, когда активатор связывается с областью –35 промотора, αCTD не может образовать контакт с ДНК в обычном месте и смещается выше. В некоторых случаях в такой позиции возможно образование дополнительного контакта αCTD с активатором. Примером активатора, образующего такой двойной контакт, является FNR (активатор экспрессии фумарат редуктазы и нитрат редуктазы). В случае этого белка одна субъединица его димера контактирует с σ-фактором РНК-П, а другая субъединица контактирует со смещенным αCTD. Таким образом, каждая субъединица FNR контактирует со своей областью РНК-П. Такая же ситуация характерна для части тех БАК-зависимых промоторов, у которых сайт связывания БАК перекрывается с областью –35. Как уже говорилось выше, в таких случаях одна субъединица БАК контактирует с N-концевым доменом α-субъединицы РНК-П. Другая же субъединица БАК может образовывать дополнительный контакт с αCTD. Активаторы, действующие путем изменения конформации промотора. Примером такого активатора является белок MerR транспозона Tn501. Димер этого белка связывается с сайтом, расположенным между –10 и –35 областями промотора. Связывание ионов ртути вызывает конформационное изменение, заключающееся в раскручивании ДНК-мишени, что приводит к правильному расположению –10 и –35 областей промотора и соответственно позволяет связаться РНК- полимеразе. Еще одним примером такого регулятора является SoxR (регулятор окислительного стесса, который мы будем рассматривать позднее). К этому же классу относятся активаторы, связывание которых с ДНК вводит в структуру последней резкий изгиб. Нет полной ясности с механизмом работы таких активаторов транскрипции. Здесь возможны два варианта – контакт с «обратной» стороной РНК- П и конформационное изменение структуры ДНК. Наконец, существуют промоторы, зависящие от двух (и более) активаторов. Такая множественная зависимость обычно привязывает активность промотора к различным физиологическим сигналам. В таких ситуациях возможны 4 механизма совместного действия двух регуляторов: • связывание с ДНК одного активатора может зависеть от другого (и наоборот). Несмотря на простоту, примеров такого рода для прокариот не описано (описаны для эукариот); • связывание одного активатора может приводить к перемещению другого активатора из пассивной позиции в положение, из которого он может взаимодействовать с РНК-П. Пример – БАК и MalT на malK промоторе: - связывание БАК перемещает MalT • активаторы могут образовывать независимые контакты с РНК-П. В таких случаях один активатор связывается в районе –35 области и контактирует с σ, а другой – upstream, и контактирует с αCTD. • роль второго активатора может заключаться в предотвращении действия репрессора. Promoter occlusion 1.4 Арабинозный оперон В качестве примеров систем с более сложным контролем рассмотрим ara оперон E. coli. Рассмотренный ранее lac оперон можно считать примером “простой” регуляции. Хотя в случае lac оперона действуют два белка-регулятора, а именно осуществляющий негативный контроль репрессор LacI и активатор транскрипции БАК, действие этих белков друг от друга не зависит, и мы фактически имеем две простых регуляторных системы. В ara опероне один и тот же белок (продукт гена araC) может выполнять как репрессорную, так и активаторную функции. Всего за утилизацию арабинозы отвечает 6 генов – пять структурных и один регуляторный (araC). Три гена образуют оперон, araBAD, который и регулируется продуктом гена araC. Ген araC располагается перед опероном araBAD, но отделен от него 147 парами оснований и считывается в противоположном направлении. Еще два гена, araE и araF не сцеплены ни друг с другом, ни с кластером araCBAD, т.е. располагаются в совершенно другом районе хромосомы. Тем не менее, эти два гена подвержены той же системе регуляции, т.е. в их промоторной области имеются сайты связывания продукта araC. Такая организация называется регулоном. Иными словами, регулон – группа генов и (или) оперонов, как правило, необходимых для выполнения одной физиологической функции, не сцепленных между собой, но находящихся под общим контролем. Генетическое изучение арабинозного оперона указывало на то, что ген araC должен кодировать как репрессор, так и активатор транскрипции. Оказалось, что непосредственно продукт является репрессором, но присоединение индуктора (арабинозы) не только инактивирует репрессор, но и - 7 - превращает его в индуктор. Эти две формы продукта araC называются соответственно C rep и C ind . Две формы белка C имеют разные сайты связывания в области между генами araC и araB. Кроме того, в этой же области располагается сайт связывания БАК и, конечно же, промоторы гена araC и оперона araBAD. Эта область ДНК организована следующим образом Сайт связывания БАК располагается между двумя промоторами, причем связывание комплекса БАК-цАМФ необходимо для инициации транскрипции в обоих направлениях. Сайт связывания C rep перекрывается с промотором гена araC, поэтому связывание C rep ингибирует транскрипцию своего собственного гена. Таким образом, в отсутствие индуктора транскрипция гена araC поддерживается на очень низком базальном уровне, достаточном только для обеспечения собственной репрессии. Появление индуктора (арабинозы) вызывает отсоединение репрессора и связывание его с активаторным сайтом, располагающимся между сайтом связывания БАК и промотором оперона araBAD. Таким образом снимается репрессия с araC и обеспечивается синтез больших количеств его продукта, который, связываясь с арабинозой, активирует транскрипцию оперона araBAD. Т.о., в случае транскрипции “влево” мы имеем точную копию модели регуляции lac оперона. Репрессор C rep ингибирует транскрипцию araC фактически так же, как LacI ингибирует транскрипцию lac оперона. И точно так же добавление индуктора, в данном случае арабинозы, снимает репрессию. Также аналогично действует и активирующий комплекс БАК-цАМФ по отношению к транскрипции “влево”. Однако, в случае транскрипции “вправо” ситуация более сложная, поскольку здесь действуют уже два активаторных белка, тот же БАК-цАМФ и C ind . Сайт связывания C ind расположен таким образом, что, связавшись с ДНК, этот белок может непосредственно контактировать с РНК- полимеразой, что и вызывает активацию транскрипции. Но поскольку сайт связывания C ind расположен между промотором и БАК-связывающим сайтом, комплекс БАК-цАМФ располагается слишком далеко, чтобы непосредственно контактировать с РНК-полимеразой, собирающейся читать вправо. Как же БАК осуществляет регуляцию в данном случае? Дело в том, что пример с ara опероном не является исключением. БАК имеет два типа расположения относительно промотора. Первый – стандартный для активаторов транскрипции – прямо перед промотором (например, в положении -72...- 50 у lac оперона или -50...-23 у gal оперона), что позволяет белку непосредственно контактировать с РНК-полимеразой. Но у многих промоторов сайт связывания БАК располагается значительно дальше. В случае ara оперона БАК связывается в положении -107...-78. Есть и другие опероны с удаленным расположением БАК-связывающего сайта. Вопрос о том, как действует БАК, остается открытым. Существуют две модели. Первая объясняет действие БАК через белковые взаимодействия. В принципе, даже не очень сильное взаимодействие между двумя белками может оказаться достаточным для существенного усиления связи РНК-полимеразы с промотором. Проблемой здесь является то, что даже в случае gal и lac промоторов взаимодействие должно происходить по-разному, а в случае ara промотора должны взаимодействовать три белка. Вторая модель предполагает, что эффект БАК определяется целиком его связыванием с ДНК. В соответствии с этой моделью РНК-полимераза не может сама обеспечить первоначальное плавление ДНК в области промотора, в пользу чего говорит тот факт, что ни один из БАК-зависимых промоторов не имеет “хорошей”, то есть близкой к канонической, -35 последовательности. Экспериментально установлено, что связывание белка БАК с ДНК вносит в нее изгиб почти под прямым углом, что возможно только в случае серьезного изменения структуры ДНК в этом районе. Предполагается, что это изменение структуры облегчает плавление ДНК в промоторной области и, следовательно, инициацию транскрипции. |