ЛЕКЦИИ Регуляция метаболизма Курс лекций. Е.А. Николайчик. Курс лекций Минск 2002 II
 Скачать 2.61 Mb.
|
|
17. Регуляция стабильности мРНК Синтез определенного количества матричной РНК не обязательно гарантирует продукцию пропорционального количества белка. Сила экспрессии определенного гена зависит не только от эффективности его транскрипции, но в значительной мере от того, что происходит с транскриптом после его синтеза. Сразу после синтеза транскрипт приобретает определенную вторичную структуру, от чего в значительной степени будут зависеть его стабильность и скорость процессинга (у эукариот), а также эффективность трансляции. Дополнительные возможности регуляции имеются у эукариот в связи с наличием сложного процессинга первичных транскриптов. Наконец, эффективность экспрессии гена очень сильно зависит от стабильности его мРНК. Так, у прокариот время полужизни различных мРНК варьирует в пределах от 20 секунд до более чем 20 минут. Стабильность мРНК обычно не зависит напрямую от ее размера, а определяется многими факторами, основными из которых являются ее вторичная структура, элементы первичной последовательности (сайты узнавания для специфических рибонуклеаз) и эффективность трансляции. Наличие элементов вторичной структуры, как правило, стабилизирует РНК, поскольку препятствует работе многих РНКаз (Рис. 17.1). Большинство мРНК имеют на своем нетранслируемом 3' конце достаточно стабильные шпилечные структуры. Это в первую очередь терминаторы, однако имеются и другие элементы вторичной структуры. Так, у E. coli имеется около 500 так называемых REP (repetitive extragenic palindromes) элементов – палиндромов, способных образовывать достаточно крупные шпилечные структуры на 3' концах матричных РНК. В некоторых случаях шпилечные структуры могут присутствовать и на 5' концах мРНК. - 85 - Немаловажным для стабильности мРНК является наличие хорошего рибосомсвязывающего сайта (на надлежащем расстоянии перед старт-кодоном). Рибосома, транслирующая мРНК, защищает 35-50 нуклеотидов от атаки рибонуклеаз, которые могут разрушить РНК. Если мРНК эффективно транслируется, она фактически полностью будет покрыта рибосомами, что существенно уменьшит вероятность ее деградации рибонуклеазами. Даже во время трансляции мРНК может выступать субстратом для рибонуклеаз. Уже один разрыв в молекуле мРНК с большой вероятностью ее инактивирует. Если в результате разрыва оказывается удален рибосомсвязывающий сайт, такая мРНК, естественно, не может транслироваться. Если же разрыв произойдет где-то посередине кодирующей последовательности, трансляция будет происходить, однако белок окажется укороченным и почти наверняка нефункциональным. Кроме того, клетка, скорее всего, повесит на такой укороченный белок ярлык, направляющий его на протеолиз (напр., при помощи ssrA РНК у E. coli). Кроме того, обычно, если деградация мРНК уже началась, процесс ее разрушения завершается очень быстро. Деградация мРНК у E. coli осуществляется совместно эндо- и экзорибонуклеазами. Две экзонуклеазы, РНКаза II и полинуклеотидфосфорилаза (ПНФаза, PNPase), разрушают РНК в направлении 3'->5'. Похожие экзорибонуклеазы широко распространены как у про-, так и у эукариот. РНКаза II – гидролитический фермент, дающий при расщеплении РНК нуклеотидмонофосфаты. ПНФаза использует при гидролизе неорганический фосфат, генерируя нуклеотиддифосфаты. Инактивация обоих экзорибонуклеаз приводит к накоплению в клетке промежуточных продуктов деградации мРНК и является летальной. 3' концы многих мРНК (в первую очередь образовавшиеся в результате ρ-независимой терминации) образуют стабильные шпилечные структуры, которые защищают РНК от деградации экзорибонуклеазами. Расщепление мРНК "в середине" при помощи эндорибонуклеазы может убрать шпильку, образуя незащищенный 3' конец, доступный для экзорибонуклеаз. Эндорибонуклеаза E (РНКаза E, RNAse E), первоначально идентифицированная как необходимая для процессинга рибосомной 5S РНК, также определяет стабильность многих мРНК. Эндонуклеазное расщепление РНК менее важно у эукариот, где основная деградация мРНК обеспечивается экзонуклеазами. У дрожжей описано два 5' Стабилизирующий элемент RBS 5' 3' сайты действия рибонуклеаз REP последовательность Терминатор транскрипции старт трансляции конец трансляции Рис.17.1. Факторы, влияющие на стабильность прокариотической мРНК Protected 3 ′ end 3 ¢ Endonuclease 5 ¢ 3 ¢ 5 ¢ Exonuclease 3 ¢ 5 ¢ (a) 5 ′–3 ¢ pathway Deadenylation and decapping 5 ¢ Gppp 3 ¢ 5 ¢ 3 ¢ (b) 3 ¢ –5 ¢ pathway Deadenylation 5 ¢ Gppp 5 ¢ Gppp 3 ¢ 3 ¢ AAAA AAAA AAAA AAAA AAAA AAAA PAB PAB PAB PAB PAB PAB Рис.17.2. Деградация мРНК прокариот Рис.17.3. Деградация мРНК эукариот - 86 - экзонуклеолитических механизма, работающих в направлениях 5'->3' и 3'->5'. Эукариотические мРНК защищены от деградации кэпом на 5' конце и поли(А) хвостом в комплексе с поли(А)-связывающим белком (PAB) на 3' конце, и декэпирование и деаденилирование являются необходимыми предпосылками для деградации. У дрожжей в 5'->3' пути деградации декэпирование зависит от деаденилирования, и а мРНК деградируется экзонуклеазой XRN1. 3'->5' путь деградации обеспечивается мультибелковым комплексом – экзосомой. Интересно, что E. coli не имеет 5'->3' экзонуклеазного пути. 5' конец мРНК у прокариот не кэпирован, а 5'->3' экзорибонуклеазы не известны, однако структура, подобная кэпу, все же имеется. На 5' конце эубактериальных мРНК , как правило, находится трифосфат, и его присутствие ингибирует действие эндорибонуклеаз. После первого расщепления мРНК эндорибонуклеазой на вновь образованном 5' конце РНК остается монофосфат, уже неспособный блокировать дальнейшее эндонуклеолитическое расщепление. Именно поэтому первая атака эндорибонуклеазой является лимитирующей по времени, а дальнейшее расщепление мРНК при помощи эндонуклеаз и 3'->5' экзонуклеаз (для последних первое расщепление мРНК также обеспечивает незащищенный 3' конец) происходит очень быстро. Бактериальные РНКазы, участвующие в деградации мРНК РНКаза Е Описана у E. coli. Кодируется геном rne. Продукт гена – крупный белок (1061 аминокислотный остаток). активен в виде гомодимера. Белок можно разделить на три домена. В центре расположен богатый аргинином РНК-связывающий домен. N-концевой каталитический домен имеет слабую гомологию с рибосомным белком S1. Имеется также некоторая гомология между РНКазой Е и миозином. Специфичность РНКазы Е по отношению к субстрату не очень четкая. В качестве консенсус- последовательности сайта предпочтительного узнавания был предложен пентануклеотид (A/G)AUU(A/U), однако по другим данным единственным ограничением по отношению к последовательности РНК является разрезание "слева" от динуклеотида AU в однонитевых участках молекулы. Еще одним ограничением является то, что РНКаза Е наиболее активно действует только в непосредственной близости от свободного 5' конца, причем это должен быть конец с монофосфатом. Наконец, двухцепочечная РНК резистентна к деградации РНКазой Е. Таким образом, для успешного расщепления субстрата РНКаза Е должна распознать специфический внутренний сайт и свободный 5' нуклеозидмонофосфат. Экспрессия РНКазы Е находится под негативным контролем, причем регулятором является сама РНКаза Е, и контроль осуществляется за счет ее собственной РНКазной активности. В условиях эксперимента можно добиться 40-кратного различия в количествах rne-транскрипта за счет изменения клеточной концентрации функциональной РНКазы Е. РНКаза III РНКаза III (кодируемая геном rnc) была обнаружена у E. coli как эндорибонуклеаза, разрезающая двухцепочечные молекулы РНК. Разрез может быть одно- или двунитевым, что частично зависит от степени спаренности оснований вокруг сайта разрезания. Специфичность по отношению к конкретной последовательности контролируется негативно, т.е. присутствие ряда оснований в определенных позициях сильно ингибирует разрезание. РНКаза III участвует в процессинге рРНК и деградации ряда мРНК, хотя стабильность большинства клеточных мРНК не изменяется у мутанта по РНКазе III. Инактивация rnc летальна у B. subtilis, но не летальна у E. coli. РНКаза III - гомодимер из субъединиц размером 25.4 кДа. Фермент содержит четко выраженные РНК-связывающий и РНКазный домен. Экспрессия rnc авторегулируется (как и в случае РНКазы Е , каталитическая активность РНКазы III напрямую участвует в авторегуляции). Активность РНКазы III регулируется также и на посттрансляционном уровне путем фосфорилирования. Полинуклеотидфосфорилаза Кодируется геном pnp. Гомотример из субъединиц размером 77.1 кДа. Катализирует обратимый фосфоролиз полирибонуклеотидов с освобождением нуклеозиддифосфатов. Содержит два РНК- связывающих домена – один гомологичен некоторым эукариотическим гяРНК, а второй – рибосомному белку S1. Фермент широко распространен у бактерий. Экспрессия полинуклеотидфосфорилазы, как и описанных выше РНКаз, находится под автоконтролем. - 87 - РНКаза II Кодируется геном rnb. Как и полинуклеотидфосфорилаза, процессивно деградирует однонитевую РНК с 3' конца, однако делает это путем гидролиза, а не фосфоролиза мРНК, освобождая нуклеозидмонофосфаты. Мономер с молекулярной массой 72.3 кДа. Содержит карбоксиконцевой РНК- связывающий S1 домен. Экспрессия РНКазы II находится в обратной корреляции с уровнем полинуклеотидфосфорилазы, что предполагает участие этих двух РНКаз в деградации матричных РНК друг друга Активность обеих экзорибонуклеаз ингибируется элементами вторичной структуры, однако полинуклеотидфосфорилаза к такому ингибированию значительно менее чувствительна. Мультибелковые комплексы деградации РНК. При очистке РНКазы Е из E. coli был обнаружен крупный мультибелковый комплекс – РНК- деградосома. Основными компонентами этого комплекса являются РНКаза Е, ПНФаза и РНК-хеликаза RhlB (Рис. 17.4). Ассоциация РНКазы Е с ПНФазой в одном комплексе дает прямое доказательство их кооперации при деградации мРНК. В составе комплекса также выделяется енолаза (гликолитический фермент) и (в субстехиометрических количествах) полифосфаткиназа PPK и шапероны DnaK и GroEL; роль этих компонентов в деградации мРНК неясна. РНКаза Е – крупный мультидоменный белок. Эндонуклеазная активность связана с N-концевым доменом. Этот же домен обладает дополнительной активностью, отвечающей за деградацию поли(А) и поли(U) хвостов. C-концевая половина белка взаимодействует с тремя основными компонентами деградосомы, RhlB, PNPазой и енолазой. Таким образом, РНКаза Е – сложный мультидоменный белок, N-конец которого является каталитическим, а C-конец выполняет роль каркаса, на котором собираются остальные компоненты деградосомы. Несколько мультибелковых РНК- деградирующих комплексов, структурно и функционально гомологичных бактериальной РНК-деградосоме, описано у эукариот. Все эти комплексы отвечают за деградацию РНК в 3'->5' направлении. Комплекс, содержащий гомологи PNPазы и РНКазы Е, участвует в процессинге и деградации мРНК в хлоропластах шпината. Еще два комплекса описаны у дрожжей. Комплекс mtEXO, содержащий экзонуклеазу, сходную с РНКазой II из E. coli, деградирует интроны мРНК в митохондриях Saccharomyces cerevisiae. Экзосома S. cerevisiae, участвующая как в процессинге рибосомной РНК, так и в деградации мРНК, содержит пять 3'->5' экзорибонуклеаз, четыре из которых гомологичны РНКазе II или PNPазе из E. coli. Человеческий гомолог дрожжевой экзонуклеазы Rpr4p был обнаружен в составе большого комплекса, что свидетельствует в пользу наличия экзосомы и в клетках животных. РНК-хеликазы в деградации РНК Идентификация РНК-хеликазы RhlB в составе бактериальной деградосомы явилась первым свидетельством активной роли РНК-хеликаз в деградации РНК. RhlB принадлежит к классу DEAD-бокс белков. Это семейство АТФ-зависимых РНК-хеликаз, имеющих 8 консервативных мотивов, включая аминокислоты аспартат (D), глутамат (E), аланин (A) и опять аспартат (D). Белки-члены этого семейства участвуют в разнообразных процессах, включая сборку рибосом, инициацию трансляции и сплайсинг РНК. В экспериментах in vitro функция RhlB в составе деградосомы была четко показана. Элементы вторичной структуры в РНК часто создают препятствия для продвижения таких ферментов, как ПНФаза. Показано, что присутствие RhlB в составе деградосомы стимулирует в АТФ-зависимой манере деградацию при помощи ПНФазы субстрата с выраженной вторичной структурой. RhlB "раскручивает" Рис.17.4. Прокариотическая РНК-деградосома - 88 - двухцепочечные участки РНК, что позволяет экзорибонуклеазе продвинуться дальше по субстрату. RhlB сильно активируется взаимодействием с C-концевой частью РНКазы Е. Дрожжевые экзосома и комплекс mtEXO также имеют в своем составе хеликазы, подобные RhlB. Полиаденилирование оказывает противоположный эффект на стабильность бактериальных и эукариотических мРНК. Поли(А)-полимераза I (PAP I) из E. coli кодируется геном pcnB (plasmid copy number), который был первоначально идентифицирован по его действию на копийность плазмид с ColEI репликоном. PAP I участвует в деградации РНК I – небольшой регуляторной РНК, которая взаимодействует с РНК II – праймером, инициирующим репликацию ДНК ColEI. РНК I, время полужизни которой составляет 2 минуты, первоначально укорачивается РНКазой Е на 5 нуклеотидов с 5' конца. Время полужизни полученного интермедиата (РНК I -5 ) возрастает в 10 раз в pcnB штамме (у которого отсутствует PAP I активность). E. coli имеет еще один белок с поли(A)-полимеразной активностью (PAP II). Инактивация обеих поли(A)-полимераз летальна. PAP I из E. coli гомологичен эукариотическим поли(A)- полимеразам. Степень полиаденилирования бактериальных мРНК невысока, и у E. coli только небольшой процент всех транскриптов полиаденилирован. Однако, несмотря на низкую степень полиаденилирования, оно выполняет существенную функцию при деградации РНК. Добавление поли(А) способствует деградации РНК, чьи концы защищены от действия экзонуклеаз вторичной структурой. Такие экзорибонуклеазы, как ПНФаза и РНКаза I, нуждаются в одноцепочечном "хвосте", за который можно "ухватить" 3' конец мРНК и начать ее деградацию. Полиаденилирование 3' конца как раз и создает сайт связывания для экзорибонуклеаз. Открытие дестабилизирующего влияния 3' поли(А)-хвостов на мРНК у бактерий явилось сюрпризом, поскольку у эукариот функция полиаденилирования противоположная (стабилизирующая). Такое отличие объясняется тем, что поли(А)-хвосты эукариот значительно длиннее и, кроме того, защищены особым белком PAB (poly(A)-binding). Короткие не связанные с белком поли(А) последовательности и у эукариот оказывают дестабилизирующее действие на мРНК. Литература: 1. M. Grunberg-Manago. Messenger rna stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages Annu. Rev. Genet. 1999. 33:193–227 |