ЛЕКЦИИ Регуляция метаболизма Курс лекций. Е.А. Николайчик. Курс лекций Минск 2002 II
 Скачать 2.61 Mb.
|
|
Адаптация к анаэробиозу. Основные регуляторы - FNR (fumarate and nitrate reduction) и ArcA (aerobic respiratory control) Оба белка являются транскрипционными факторами, активирующимися в анаэробных условиях и инактивирующихся при взаимодействии с кислородом. FNR детектирует кислород непосредственно через редокс-чувствительный Fe-S кластер, входящий в его структуру, тогда как активность ArcA зависит от его фосфорилирования, контролируемого мембранной гистидинкиназой ArcB. В отличие от FNR ArcB не детектирует содержание кислорода непосредственно, а реагирует на общее состояние клетки. В связи с этим два регулятора реагируют на различные концентрации кислорода и контролируют разные, но частично перекрывающиеся наборы генов. Это позволяет бактерии быстро и эффективно приспосабливаться к широкому диапазону концентраций кислорода. FNR как сенсор кислорода FNR – глобальный регулятор, контролирующий экспрессию более 120 генов у E. coli. Белок был идентифицирован путем изоляции мутантов, неспособных восстанавливать нитрат и фумарат. Позже было показано, что белок отвечает за индукцию в анаэробных условиях таких ферментов цикла Кребса как сукцинат дегидрогеназа, фумараза, изоцитрат дегидрогеназа, участвующих в производстве энергии Рис.9.3. Активация транскрипции белком OxyR - 46 - путем окислительного фосфорилирования. FNR также активирует экспрессию ферментов анаэробного дыхания, которые используют альтернативные конечные акцепторы электронов, такие как DMSO, фумарат или нитрат. Помимо активации экспрессии необходимых в анаэробных условях белков FNR также репрессирует такие аэробные респираторные ферменты как цитохромоксидаза и NADH дегидрогеназа. Интересно то, что по аминокислотной последовательности FNR похож на БАК. Mеханизм активации транскрипции обеими белками тоже одинаков - оба активируют транскрипцию, контактируя с α-субъединицей РНК-полимеразы. Единственным существенным отличием FNR является дополнительный участок на амино-конце этого белка, несущий ферредоксинообразный кластер из четырех цистеиновых остатков (Cys-X3-Cys-X2-Cys-X5-Cys), что привело к предположению о детекции кислорода при помощи железо-серных кластеров. При взаимодействии с кислородом два [4Fe-4S] 2+ кластера димера FNR быстро (за пару минут) превращаются в два [2Fe-2S] 2+ кластера, причем железо остается связанным с окисленным FNR, скорее всего в виде сульфида (Рис. 9.4). Если клетку быстро вернуть в анаэробные условия, [2Fe-2S] 2+ центры быстро возвращаются в исходное [4Fe-4S] 2+ состояние. Однако более продолжительная инкубация в присутствии кислорода ведет уже к необратимому разрушению центров [2Fe-2S] 2+ , давая апобелок, полностью лишенный железа. FNR активен как транскрипционный фактор только в форме гомодимера, для образования которого необходимо присутствие интактных [4Fe-4S] 2+ кластеров. Преобразование кубической структуры [4Fe-4S] 2+ в плоскую [2Fe-2S] 2+ при окислении белка в аэробных условиях оказывается достаточным для внесения существенных конформационных изменений, вызываэщих диссоциацию димера FNR на мономеры, что предотвращает связывание белка с ДНК. Широкий диапазон концентраций кислорода детектируется клетками E. coli. Анаэробное дыхание у этой бактерии происходит в диапазоне концентраций кислорода 1-5 µМ (при наличии соответствующих акцепторов электронов), при более низкой концентрации бактерия переключается на брожение. Именно в этом диапазоне концентраций и происходит переход FNR из неактивной в активную форму. ArcB реагирует на изменения концентрации кислорода на границе микроанаэробной и анаэробной зоны (5-10 µМ). Этот белок скорее всего реагирует на изменения электронтранспортной цепи (трансмембранного протонного потенциала или же степени окисления какого-то переносчика электронов). Вторым сигналом, на который может реагировать ArcB, является концентрация анаэробных метаболитов. ArcB работает в паре с РО ArcA (Рис. 9.5). На сегодняшний день регулон ArcA насчитывает более 30 генов, кодирующих ферменты цикла Кребса (флавопротеиновые дегидрогеназы, цитохромоксидазы и т.д.), глиоксилатного шунта и деградации жирных кислот. Регуляция в основном заключается в репрессии при анаэробиозе синтеза ферментов аэробного дыхания, хотя ArcA также активирует несколько генов в микроанаэробных условиях. ArcB имеет существенное сходство с компонентами сенсорных систем. В его состав Рис.9.4. Репрессия транскрипции белком FNR His ATP ADP P Asp His Asp P P P Asp P Asp P Asp P ArcA SixA ArcB ArcA OmpR CheY Рис.9.5. Двухкомпонентная регаляторная система ArcA/ArcB - 47 - входят: классический гистидинкиназный домен, центральный домен, сходный с регуляторным доменом РО, и небольшой HPt домен на карбокси-конце. Фосфат может передаваться на ArcA с любого из фосфорилириванных гистидиновых остатков в составе ArcB – и из автокиназного, и из HPt домена. Причем имеются данные, что для реакции на анаэробные метаболиты достаточно только автокиназного домена, тогда как для "определения" состояния электронтранспортной цепи важен HPt домен. Аэротаксис Флавопротеин AerA является мембранным рецептором, отвечающим за аэротаксис. Амино- концевой домен этого белка похож на редокс-сенсоры фиксации азота у Azotobacter, а карбокси- концевой - на сигнальный домен белка Tsr - серинового рецептора хемотаксиса. Для обеспечения аэротаксиса необходимо взаимодействие AerA только с CheY, CheA и CheW, таким образом, AerA - типичный сенсор хемотаксиса, детектирующий концентрацию кислорода. В защите от активного кислорода участвуют также еще несколько белков, не контролируемых SoxRS и OxyR. Взаимосвязь между окислительным стрессом и другими регуляторными системами. Еще несколько транскрипционных регуляторов участвуют в контроле экспрессии антиоксидантных генов. Например, RpoS индуцируется, когда клетки подвергаются различным стрессам, включая голодание, осмотический шок, кислотный шок и стационарную фазу. Клетки, активно экспрессирующие RpoS, устойчивы к целому ряду стрессовых воздействий, включая высокие концентрации перекиси водорода. RpoS контролирует экспрессию целого ряда антиоксидантных генов, включая katE, xthA и sodC. Члены OxyR- регулона katG, gorA и dps также подвержены регуляции через RpoS. Анаэробные регуляторы FNR и ArcAB также модулируют экспрессию генов sodA, sodC, acnA и fumC. Кроме того, два гомолога белка SoxS, MarA и Rob, регулируют экспрессию практически всех генов регулона SoxRS. Наконец, экспрессия одного транскрипционного фактора, Fur, контролируется как SoxRS, так и OxyR. Литература: 1. G. Storz, J.A. Imlay. Oxidative stress. Current Opinion in Microbiology 1999, 2:188–194 2. C.E. Bauer, S. Elsen, T.H. Bird. Mechanisms for redox control of gene expression. Annu. Rev. Microbiol. 1999. 53:495-523 Подробная информация об основных регуляторах – SoxRS, FNR, OxyR, ArcB и других 3. G. Sawers. The aerobic/anaerobic interface. Current Opinion in Microbiology 1999, 2:181–187 Акцент на адаптацию к анаэробным и микроаэробным условиям. Роль FNR и ArcB. 10. Деление бактериальной клетки и его регуляция 10.1. Аппарат деления клетки Escherichia coli Образование клеточной перегородки (септы) катализируется рядом жизненно важных белков, которые путем самосборки образуют кольцевую структуру (септосома или дивисома) в месте будущего деления. Сборка этой структуры происходит последовательно и инициируется белком FtsZ – структурным и функциональным аналогом эукариотических тубулинов. Важным моментом деления является выбор правильной позиции для сборки септосомы Ингибитор клеточного деления MinCD блокирует сборку септосомы, а другой белок, MinE, образует кольцо в середине клетки, которое защищает будущий сайт деления от действия ингибитора. Деление тесно координировано с другими клеточными процессами, прежде всего с репликацией хромосомы, однако механизмы, управляющие такой координацией, исследованы недостаточно. В последнее время много внимания уделяется двум специальным случаям клеточного деления, связанным с дифференциацией клеток, - полярному делению при спорообразовании (у B. subtilis) и делению у Caulobacter crescentus (которое всегда приводит к образованию двух морфологически различающихся клеток). У C. crescentus показано существование белка (CtrA), контролирующего как репликацию - 48 - хромосомы, так и транскрипцию ключевого гена деления, FtsZ, и, таким образом, обеспечивающего необходимую координацию двух процессов. Если смотреть на бактерию под микроскопом, легко сделать наблюдение, что бактериальная жизнь является по существу постоянным процессом роста, который в некоторый момент приводит к делению клетки. Чтобы делиться успешно, бактерия должна удвоить свою массу, дуплицировать хромосому и построить особую структуру, разделяющую две дочерних клетки - септу. Хотя главный процесс деления, цитокинез, может происходить более-менее одинаково у всех бактерий, детали деления в целом изменяются значительно в зависимости от формы бактерии и состава ее клеточной стенки. Объект этого исследования, Escherichia coli, является грамотрицательной бактерией, которая интенсивно изучалась генетически и биохимически и является, вероятно, организмом, о котором мы знаем больше, чем о любом другом представителе живого мира Земли. Форма этой бактерии определена жестким слоем пептидогликана или муреина, расположенного между внешней и внутренней клеточными мембранами. Пептидогликан - огромная молекула, образующая подобную мешку, но достаточно жесткую структуру, которая в сочетании с высоким внутренним осмотическим давлением действует как экзоскелет, определяющий постоянную форму клетки и ее механическую прочность в разнообразии окружающих сред с различной осмолярностью. Пептидогликан - уникальный полимер, составленный из цепей гликана, поперечно сшитых короткими пептидными мостикми. Присутствие такой жесткой структуры накладывает отпечаток на всю физиологию этой бактерии, и, в частности, на процесс деления, который и является предметом этогй диссертации. Муреиновый саккулюс должен быть дублирован каждый клеточный цикл, причем таким способом, который гарантирует постоянную целостность этой структуры, являющейся абсолютно необходимой для поддержания формы и жизнеспособности клетки. Эта цель достигается при помощи сложного комплекса белков, включающего муреинсинтетазы, литические ферменты и множество белков, специфических для деления, но не связанных непосредственно с метаболизмом муреина. Экспрессия этих белков подвержена сложной системе регуляции, управляющей присутствием нужных количеств нужных белков в нужных местах и в нужное время и координацией клеточного деления с репликацией хромосомы и клеточным ростом. 10.1.1. Структура муреина. Гликанoвые цепи муреина сложены из повторяющихся субъединиц, состоящих из двух аминосахаров, N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) и N-ацетилмурамовой кислоты (MurNAc), связанных β- 1,4 гликозидными связями (Рис. 10.1). Длина этих цепей значительно варьирует со средним числом 29 дисахаридных субъединиц. Цепи гликана перекрестно сшиты короткими пептидными мостами. Пентапептид L-Ala-D-Glu-DAP-D-Ala-D-Ala (DAP - meso-диаминопимелиновая кислота) присоединен к лактатной группе MurNAc через амидную связь с остатком L-аланина. Присутствие двуосновной кислоты (DAP в E. coli) необходимо для формирования перекрестных сшивок между соседними цепями гликана. Кросс-сшивка осуществляется транспептидазой, которая отщепляет концевой D-аланин и образует пептидную связь между остающимся D-аланином и свободной амино группой DAP из пентапептида, связанного с другой цепью гликана. Формирование пептидного моста все еще оставляет свободную амино группу в одном из остатков DAP, что делает возможным присоединение дополнительной цепи гликана. Такие связи, соединяющее три цепи гликана, обнаруживаются приблизительно в 5 % случаев . В зрелом пептидогликане один или оба остающихся D-аланиновых остатка удаляются из пептидных мостиков карбоксипептидазами. Пептидные цепи располагаются по спирали вокруг гликановых цепей под углами приблизительно в 90° друг к другу . Если муреин однослоен, как в E.coli, пептидные мосты могли бы поэтому соединять каждый второй остаток MurNAc в соседних цепях гликана. Реальная степень поперечных сшивок близка к ожидаемой по крайней мере в некоторых условиях. Такое строение молекулы приводит к созданию прочной ковалентно связанной сетчатой структуры, фактически одной огромной молекулы, в которую заключена большая часть бактериальной клетки. Такая структура позволяет муреиновому саккулюсу противостоять внутреннему давлению в несколько атмосфер. И именно комбинация высокого внутреннего давления с жестким муреиновым "мешок" определяет фиксированную форму бактериальной клетки. Очевидно, что такая структура обеспечивает бактерии много преимуществ, но также создает и несколько проблем, наиболее важной из которого является рост жесткого саккулюса - он должен расти и делиться таким способом, - 49 - чтобы целостность всей структуры экзоскелета, противостоящей внутреннему осмотическому давлению, никогда не нарушалась. 10.1.2. Модели элонгации и деления муреинового саккулюса. Другим возможным путем вставки нового материала в саккулюс была бы стратегия "присоединяй, а затем разрывай", используемая грамположительными бактериями, где новые слои муреина добавляются в ненапряженном состоянии ниже внешних слоев, несущих механическое напряжение. Эти новые цепи вводятся в действие медленно, по мере деградации внешних слоев гидролазами. Подобная форма роста саккулюса предложена для E. coli в другой модели. Эта модель постулирует, что новый материал должен быть присоединен к существующему слою муреина прежде, чем любые ковалентные связи могут быть расщеплены. Гипотеза объясняет роль тримерных поперечных сшивок и фактически полагается на их существование. Тримерные сшивки, как полагают, являются сайтами присоединения нового добавляемого материала. Самый маленький такой сайт - одиночная цепь гликана, но минимальная структура нового муреина, добавленного к этому сайту, должна по структурным причинам состоять из трех цепей. Чтобы объяснить экспериментально наблюдаемую вставку одиничных цепей гликана, постулируется существование "праймерной" цепи, синтезируемой монофункциональной трансгликозилазой. Никакое доказательство для существования таких "праймерных" цепей не доступно, но фермент, способный к созданию таких цепей, монофункциональная гликозилтрансфераза, известен. Предполагается, что триплет цепей гликана формируется путем синтеза двух новых цепей, сопряженного с их одновременным «пришиванием» к праймерной цепи. Этот триплет затем присоединяется к свободным амино группам DAP из пептидных мостиков с обеих сторон цепи-мишени в существующем муреине. Цепь-мишень затем удаляется, и три новых цепи выдвигаются в плоскость муреина внутренним давлением (Рис. 10.2). Минорная модификация состава мультиферментного комплекса могла бы быть достаточна для обеспечения синтеза муреина в течение клеточного деления - PBP3 использовался бы вместо PBP2 и, возможно, монофункциональная трансгликозилаза была бы добавлена. В этом случае триплеты муреина могли бы синтезироваться за один шаг, так как, вопреки тому, что наблюдается при элонгации, при O O O NH CO CH 3 HC CH 3 CO L-Ala NH 2 D-Glu m-DAP D-Ala D-Ala CH 2 OH OH O CH 3 C NH O HO O CH 2 O O O NH CO CH 3 HC CH 3 CO CH 2 OH O OH O CH 3 C NH O HO O CH 2 O O O NH CO CH 3 HC CH 3 CO CH 2 OH OH O CH 3 C NH O HO O CH 2 O O O NH CO CH 3 HC CH 3 CO CH 2 OH O OH O CH 3 C NH O HO O CH 2 NAM NAG NAM NAG Carboxy- peptidase Endopeptidase L-Ala NH 2 D-Glu m-DAP D-Ala Muramidase Muramidase Рис.10.1. Структура пептидогликана - 50 - делении несколько новых цепей муреина вставляются рядом. Небольшая задержка удаления старой цепи вела бы к инвагинации муреина в результате добавления следующего триплета муреина до того, как старая цепь педед предыдущим триплетом будет удалена. 10.1.3. Гены клеточного деления. Определение специфического гена клеточного деления может быть несколько затруднено. Клеточное деление, конечно, не возможно без многих из генов, описанных выше, и мутации в многих из их летальны, но термин "ген клеточного деления" обычно используется, когда мутация непосредственно ведет к видимому дефекту в делении без других непосредственных эффектов на клеточный рост, формирование клеточной стенки, репликацию ДНК или сегрегацию. Обычно, блок деления не приводит к немедленному прекращению роста, и клетки продолжают удлиняться некоторое время. Это приводит к формированию длинных филаментов, поэтому большинство жизненно важных генов клеточного деления имеют аббревиатуру fts (filamentous temperature sensitive). Если говорить о гене, который является абсолютно необходимым для деления каждой бактерии, то единственный ген из известных в настоящее время соответствует этому определению - ftsZ (даже этот ген вероятно отсутствует в по крайней мере одной бактерии - недавно сиквенированный геном Chlamydia trachomatis не имеет узнаваемого гомолога ftsZ). Но ftsZ в одиночку оказывается достаточным для деления только самых простых бактерий, например M. genitalium, живущих в идеальной богатой питательными веществами окружающей среде при постоянной температуре и постоянном осмотическом давлении и следовательно не нуждающихся (и не имеющих) муреиновой клеточной стенки. Другие бактерии должны иметь дополнительные структуры, чтобы выживать в своих местообитаниях. Одна из этих дополнительных структур - муреиновая клеточная стенка, типичная для огромного большинства Ala Glu A 2 pm Ala Stress-bear ing la ye r Ala-Glu-A 2 pm-Ala A 2 pm-Glu-Ala Ala-Glu-A 2 pm Ala-A2pm-Glu-Ala Docking str and Murein tr iplet Ala-A 2 pm-Glu-Ala Ala A2pm Glu Ala Ala - - Ala Ala A 2 pm Glu Ala Ala Glu A 2 pm Ala Ala-Glu-A 2 pm-Ala TP TP/TG TG EP(AM) LT (a) (b) |