Рис. 5.1. Модель регуляции холодового шока
- 25 - холодового шока (cold shock proteins, Csp).
Csp
E. coli можно разделить на два класса. К первому относятся белки, практически отсутствующие у этих бактерий при 37°C и очень сильно индуцируемые при понижении температуры, ко второму - белки, присутствующие в клетке и при оптимальной температуре, но индуцируемые, хотя и не столь сильно (<10) при пониженной температуре.
К первому классу относятся белки CspA (основной белок холодового шока), CspB, CspG, CsdA,
RbfA, NusA и PNP. CspA, CspB, CspG и CspI, действуют как шапероны для РНК и ДНК, CsdA - связанный с рибосомами белок, обладающий "раскручивающей" активностью по отношению к РНК
(хеликаза), RbfA - рибосомсвязывающий фактор, NusA участвует в терминации и антитерминации транскрипции, а PNP - рибонуклеаза.
Ко второму классу относятся рекомбиназа RecA, фактор инициации трансляции IF-2, ДНК- связывающий белок нуклеоида H-NS и субъединица ДНК гиразы GyrA.
Около 10% всего белка, синтезируемого в клетке непосредственно после понижения температуры, составляет CspA, основной белок холодового шока
E. coli. Эта бактерия имеет еще 8 белков, гомологичных CspA - CspB - CspI, но не все из них индуцируются холодом. Четко показана индукция для CspA, CspB, CspG и CspI. Несмотря на конститутивные промоторы, экспрессия этих белков четко контролируется. Гены этих четырех белков имеют необычно длинные высоко консервативные нетранслируемые области на своем 5' конце (5' UTR). Показано, что эта область существенна для экспрессии
cspA и содержит последовательность из 11 оснований, называемую "cold box". Эта последовательность - место транскрипционной "паузы", приводящей к аттенуации транскрипции cspA.
Причем регуляторной молекулой здесь является сам CspA. РНК-полимераза каким-то образом преодолевает терминаторный сайт непосредственно после понижения температуры, что ведет к усилению транскрипции cspA. Оказалось, что антитерминаторной молекулой является сам CspA, а также CspE и CspC, причем наиболее сильным антитерминатором из этих трех белков является CspE.
(Антитерминация в данном случае происходит просто в
результате дестабилизации вторичных структур, в том числе и терминаторных шпилек, Csp белками. Никакого взаимодействия с РНК- полимеразой и (или) Nus белками не наблюдается.) С другой стороны, накапливающийся CspA связывается со своей собственной РНК, вызывая аттенуацию, что ведет к последующему снижению концентрации белка в фазе адаптации. Кроме того, 5' UTR область отвечает за чрезвычайную нестабильность мРНК
cspA при 37°, и эта же область необходима для стабилизации мРНК при понижении температуры. Oчень сильная стабилизация мРНК
cspA непосредственно после понижения температуры (время полужизни ее увеличивается с 12 секунд до 20 минут) является еще одним механизмом регуляции концентрации белка CspA. Такая стабилизация является временной и прекращается, как только клетки адаптируются к пониженной температуре. (механизм стабилизации неясен)
Экспрессия CspA регулируется также на уровне трансляции. Помимо последовательности Шайн-
Далгарно, мРНК
cspA имеет дополнительную область, комплементарную самому концу 16S рРНК, расположенную на расстоянии 14 н.п. после инициирующего кодона, так называемый "downstream box"
(DB). Такая последовательность была идентифицирована также у
cspB,
cspG,
csdA и
rbfA. Оказывается, при 15° рибосомы не могут нормально инициировать трансляцию. DB последовательность усиливает инициацию трансляции за счет дополнительного связывания с 16S рРНК. Гены, имеющие DB последовательность, обходятся без дополнительных рибосомных факторов, необходимых для инициации трансляции при пониженной температуре. Неудивительно, что такими факторами являются
RbfA и CsdA. Таким образом, рибосомы являются физиологическим сенсором холодового шока - при понижении температуры они становятся неспособными инициировать трансляцию всех клеточных мРНК, за исключением мРНК белков холодового шока. Однако после фазы адаптации, в течение которой синтезируются дополнительные факторы инициации RbfA и CsdA, рибосомы снова становятся в состоянии транслировать все мРНК.
Не все гомологи белка CspA индуцируются при понижении температуры. CspD сильно индуцируется в
стационарной фазе и при голодании по глюкозе, причем эта индукция не зависит от
RpoS. CspC и CspE экспрессируются конститутивно при 37°. Очевидно, что это семейство гомологичных генов произошло от общего предшественника, однако последующая адаптация привела к приспособлению части гомологов для выполнения специфических функций.
- 26 -
Из всех белков холодового шока третичная структура известна только для CspA. Этот белок представляет собой
β-бочонок, состоящий из 5 антипараллельных β-слоев. Белок имеет два сайта связывания с РНК. Гидрофильные взаимодействия между белком и нуклеиновой кислотой осуществляются через 7 ароматических аминокислотных остатков, расположенных на поверхности молекулы белка. Белок в целом имеет негативно заряженную поверхность с положительно заряженными сайтами связывания нуклеиновых кислот. После связывания белка с РНК нуклеиновая кислота уже не сможет образовать вторичную структуру из-за электростатического отталкивания с поверхностью белка. Такая структура CspA является идеальной для его шаперонной активности.
Литература: 1. S. Phadtare, J. Alsina and M. Inouye. Cold-shock response and cold-shock proteins. Current Opinion in
Microbiology 1999, 2:175–180 2. W. Bae, B. Xia, M. Inouye and K. Severinov. Escherichia coli CspA-family RNA chaperones are transcription antiterminators. PNAS 2000 97(14):7784–7789 3. S. Phadtare and M. Inouye. Sequence-selective interactions with RNA by CspB, CspC and CspE, members of the CspA family of Escherichia coli. Molecular Microbiology (1999) 33(5), 1004-1014
6. Сенсорные системы Для бактерий (как, впрочем, и для любого другого организма) способность координировать экспрессию генов с изменениями условий окружающей среды дает существенное селективное преимущество. Адаптация бактерий к изменяющимся условиям среды контролируется белковыми системами передачи сигнала. Такие системы состоят из белковых модулей-доменов, собранных в несколько молекул, количество которых варьирует в зависимости от вида бактерии и конкретного фактора среды. Основными компонентами сенсорных систем являются: сенсоры (трансмембранные или цитоплазматические), детектирующие изменения окружающих условий; внутриклеточные посредники, получающие информацию от сенсоров и передающие ее на эффекторы; эффекторы - непосредственные регуляторы физиологического ответа (как правило, на уровне транскрипции).
Трансмембранные рецепторы. Что и как детектируется?
Механизм детекции сигнала не совсем ясен.
Детектируемый сигнал может быть как вне-, так и внутриклеточным. В некоторых случаях показано, что сигнал детектируется периплазматическим доменом. Так, PhoQ - регулятор экспрессии факторов вирулентности у Salmonella typhimurium, - является сенсором дивалентных катионов, которые, связываясь непосредственно с периплазматическим доменом, стабилизируют неактивную конформацию PhoQ.
Сигнал может быть внутриклеточным. Рецептор Aer, участвующий в регуляции аэротаксиса,
детектирует внутриклеточный запас энергии, связываясь с FAD. Еще один пример – детекция внутриклеточной концентрации глутамина при регуляции азотного метаболизма.
В ряде случаев показано, что сенсором является трансмембранный домен. Так, Cpx-путь активирован у мутантов E. coli, лишенных фосфатидилэтаноламина - таким образом, простое нарушение мембранной структуры приводит к активации этого сигнального пути. У белка EnvZ E. coli - гистидинкиназы, участвующей в осморегуляции, периплазматический домен может быть делетирован без потери сенсорной функции.
Механизм передачи сигнала.
Многие бактериальные рецепторы имеют периплазматический домен-детектор (P) и цитоплазматический сигнальный домен (C), заякоренные в мембране двумя
α-спиральными
- 27 - трансмембранными сегментами. Линейная структура таких белков может быть представлена как TM1–
P–TM2–L–C, где L - цитоплазматический линкер
Сигнальный домен либо сам является гистидинкиназой (EnvZ) либо с гистидинкиназой взаимодействует (MCP рецепторы хемотаксиса).
Механизм передачи сигнала с сенсорного на сигнальный домен неясен. Рецепторы обычно являются мембранными белками, гомодимерами. Предполагалось, что конформационные изменения, возникающие при связывании субстрата, передаются через мембрану на цитоплазматические домены рецептора, что влияет на взаимодействие сигнальных доменов между собой. Однако делеция одного из двух сигнальных доменов (равно как и удаление всех трансмембранных сегментов) у димера не лишает его активности.
Двухкомпонентные системы
В конце 80-х слово "двухкомпонентные" было использовано для обозначения нового класса регуляторных систем, найденных у бактерий. На сегодняшний день описаны сотни таких систем у бактерий, архей и некоторых эукариот. Двухкомпонентные системы выступают в качестве основного механизма сопряжения реакции со стимулом, позволяющего организмам реагировать на многие изменения условий окружающей среды. Эти сигнальные системы достаточно сложны и характеризуются модульной организацией, хорошо адаптированной ко многим клеточным сигнальным путям и интегрированной с ними.
Типичная двухкомпонентная система состоит из двух белков – гистидиновой протеинкиназы
(ГК), содержащей консервативный киназный домен и регулятора ответа
(РО), содержащего консервативный регуляторный домен.
Внеклеточные сигналы детектируются ГК, что приводит к изменению ее активности.
Затем ГК передает фосфогруппу на РО (реакцию катализирует сам
РО). Перенос фосфата на РО приводит к активации эффекторного домена этого белка, что и вызывает в конечном итоге специфический физиологический ответ.
В основе работы двухкомпонентной системы лежат три реакции, дающие два фосфорилированных продукта:
1. Автофосфорилирование ГК:
ГК-His + АТФ
ГК-HisФ + АДФ
2. Перенос фосфата:
ГК-HisФ + РО-Asp
ГК-His + РО-AspФ
3. Дефосфорилирование:
РО-AspФ + H
2
O
РО-Asp + P
I
Рис. 6.1. Модель двухкомпонентной регуляторной системы
ГК- гистидинкиназа, РО – регулятор ответа, H – консервативный гистидиновый остаток ГК, D – консервативный остаток аспарагиновой кислоты РО
Стимул
ГК
ГК
H-P
H ATP ADP
Автофосфорилирование
Фосфатаза
(ATP)
Киназа
Фосфорилирование
Дефосфорилирование
D-P
D
P
i
Ответ
D
РО
РО
РО
ЦМ
- 28 -
γ-фосфат из АТФ сначала переносится на боковую цепь консервативного гистидинового остатка
ГК (1). Затем РО катализирует перенос фосфата от фосфогистидина на аспартатный остаток своего регуляторного домена (2). Наконец, фосфат переносится от фосфоаспартата к воде в реакции гидролиза
(3).
Хоть ГК и похожи по своей основной функции (фосфорилирование белков) на "классические"
Ser/Thr/Tyr киназы, химизм реакции принципиально отличается – ГК образует не фосфоэфирную, а фосфоамидную связь. Реакция гидролиза фосфоамидной связи имеет гораздо большее отрицательное значение
∆G по сравнению с гидролизом фосфоэфирной связи, поэтому равновесие р-и (1) сдвинуто в сторону нефосфорилированного белка ГК. Следовательно, только очень небольшой процент ГК существует в фосфорилированном виде => не фосфорилирование ГК как таковое, а перенос фосфата является основным в работе этого фермента. Богатая энергией связь NP идеально подходит для передачи фосфата. Именно поэтому такая же связь используется хорошо знакомыми вам ферментами I и II ФТС, основной функцией которых является также не фосфорилирование как таковое, а передача фосфата "по цепочке" в направлении его конечного акцептора – фосфорилируемого сахара.
В молекуле РО фосфорилируется остаток аспартата. Предположительно, именно этот остаток используется, т.к. фосфорилирование его длинной ацильной цепи вызывает протяженные конформационные изменения в молекуле РО, необходимые для изменения эффекторной активности.
Еще одним важным свойством фасфоаспартата является
быстрый гидролиз ацилфосфата как в кислой, так и в щелочной среде. К тому же, многие РО имеют автофосфатазную активность, еще более уменьшающую время полужизни фосфоаспартата.
Таким образом, основным результатом выбора для фосфорилирования специфических остатков в молекулах ГК и РО является высокая мобильность системы. При отсутствии стимула оба компонента будут дефосфорилированы. Детекция стимула гистидинкиназой вызовет ее фосфорилирование и очень быструю передачу фосфата молекуле регулятора ответа, что приведет к быстрому ответу бактерии на изменившиеся условия. В свою очередь, легкость дефосфорилирования молекулы РО приведет к быстрому возвращению всей регуляторной системы, а вместе с ней и метаболизма бактериальной клетки, в исходное (нефосфорилированное) состояние при исчезновении стимула, вызвавшего первоначальное фосфорилирование ГК.
Распространенность двухкомпонентных систем Двухкомпонентные сигнальные системы с участием фосфорилируемых остатков гистидина и аспартата наиболее часто встречаются у бактерий. Несмотря на обнаружение таких систем у эукариот, здесь в сигнальных цепях доминируют сигнальные каскады с переносом фосфата между остатками серина, треонина и тирозина. С друкой стороны, Ser/Thr/Tyr киназы у прокариот тоже имеются. Пока нет удовлетворительного объяснения предпочтительному использованию той или иной системы у про- и эукариот. Количество генов, кодирующих белки двухкомпонентных систем, значительно варьирует в геномах различных организмов – от 0 у Mycoplasma genitalium до 2.5% генома у Synechocystis sp. В полностью сиквенированных геномах общее количество ГК и РО следующее:
Mycoplasma genitalium – 0
Haemophilus influenzae – 9
Helicobacter pylori – 11
Thermotoga maritima -19
Escherichia coli – 62
Bacillus subtilis - 70
Synechocystis sp. – 80
---------------
Methanococcus jannaschii – 0
Methanobacterium thermoautotrophicum - 24
---------------
Caenorhabdis elegans – 0
Saccharomyces cerevisiae – 4 (одна система)
У эукариот пока описаны лишь единичные примеры ГК и РО, однако у некоторых организмов их число больше – так, у слизевика Dictyostelium discoideum имеется как минимум 11 ГК. Кроме того, эукариотические системы имеют ряд отличий от прокариотических. Прежде всего, гибридные ГК,
- 29 - содержащие и РО домен, редки у прокариот (5 из 30 ГК у E. coli), тогда как у эукариот все описанные
ГК гибридные (с пока единственным исключением). Прокариотические РО являются, как правило, транскрипционными факторами, тогда как только один из описанных пока эукариотических РО имеет
ДНК-связывающий домен.
Структура и функции гистидиновых протеинкиназ У типичных двухкомпонентных систем сенсорные ГК "следят" за внешними стимулами и передают полученную информацию РО путем его фосфорилирования. ГК, как правило, содержит две основных "части" – характеризующуюся большим разнообразием сенсорную и консервативную киназную. Общая активность киназы модулируется сигналами, детектируемыми сенсорным доменом.
ГК претерпевает АТФ-зависимое автофосфорилирование по инвариантному гистидиновому остатку, расположенному в киназном же домене. ГК – димер, причем в реакции автофосфорилирования один мономер ГК фосфорилирует консервативный гистидиновый остаток другого. В отличие от типичных киназных каскадов, в которых одна киназа имеет множество мишеней, в случае двухкомпонентных систем РО стехиометрически переносит фосфат с фосфо-ГК на консервативный Asp своего регуляторного домена. К тому же многие ГК имеют фосфатазную активность, позволяющую им дефосфорилировать свой РО. Такие ГК используются при необходимости быстро "выключать" сигнальную цепочку.
ГК исключительно разнообразны, и все это разнообразие было создано за счет простых комбинаций сенсорных, каталитических и вспомогательных доменов (Рис. 6.2). Модульная структура этих белков позволяет адаптировать свойства каждой ГК к специфическим нуждам конкретной сигнальной системы.
Различные ГК имеют размер в пределах
40-200 kDa. Более крупные ГК могут состоять из 5-6 структурно и функционально различных доменов.
Несмотря на такое разнообразие ГК могут быть разделены на два больших класса: классические и гибридные.
Наиболее "традиционные"
ГК, например, осмосенсор EnvZ из E. coli, действуют как мембранные рецепторы с сенсорным доменом, расположеным в периплазме. EnvZ имеет две трансмембранных
α-спирали, которые разделяют белок на периплазматический аминоконцевой сенсорный домен и цитоплазматический карбоксиконцевой киназный домен. Другие ГК могут иметь больше трансмембранных сегментов (до
4-8) или не иметь их вовсе (киназы хемотаксиса CheA и азотного регулона NtrB). В последнем случае
ГК являются цитоплазматическими и детектируют внутриклеточные изменения (непосредственно либо в результате взаимодействия с цитоплазматическими регуляторными белками).
ГК, принадлежащие ко второму классу, гибридных ГК, имеют множественные донорные и акцепторные сайты для передачи фосфата. Вместо одного акта передачи фосфата гибридные ГК используют многоступенчатые схемы "ретрансляции" сигнала фосфорилирования. Сложность общей структуры гибридных ГК позволяет иметь несколько "входов", а иногда и "выходов" для одного сигнального пути. Типичным представителем гибридных ГК является белок ArcB, регулятор активности ряда генов в анаэробиозных условиях. ArcB имеет два N-концевых трансмембранных сегмента, за которым следуют киназный домен, затем домен, сходный с регуляторным у РО и, наконез,
Рис. 6.2. Доменная организация гистидинкиназ (a) и регуляторов ответа (b). Серыми овалами обозначены трансмембранные домены.
Консервативные участки каталитических доменов обозначены буквами.
H
N
D
F
G
N
Сенсорный доменКаталитический домен(a)
H
N
D
F
N
H
N
D
F
N
Скачать 2.61 Mb.