ЛЕКЦИИ Регуляция метаболизма Курс лекций. Е.А. Николайчик. Курс лекций Минск 2002 II
 Скачать 2.61 Mb.
|
|
Рис.3.3. Контроль регулона RpoE. - 19 - 4. Тепловой шок, фолдинг и деградация белков Тепловой шок является гомеостатическим ответом клетки на индуцированное стрессовыми условиями изменение конформации белков. Этот феномен свойственен всем организмам, и его молекулярный механизм практически идентичен у бактерий, архей и эукариот (но детали рассматривать мы будем все-таки у E. coli). При повышении температуры клетка начинает синтезировать т.н. белки теплового шока, к которым прежде всего относятся молекулярные шапероны (DnaK, GroEL) и АТФ-зависимые протеазы (Lon, ClpAP). Эти белки выполняют две основные функции - обеспечивают фолдинг (сворачивание в нативную конформацию) и деградацию поврежденных белков. Несмотря на полную противоположность этих двух функций результат их осуществления один - ликвидация поврежденных (и потенциально опасных для клетки) белков. Цитоплазматические протеазы по своей структуре напоминают шапероны - древние машины для фолдинга. И те, и другие распознают экспонированные гидрофобные участки неправильно свернутых или денатурированных белков. Молекулярные шапероны Шапероны-шаперонины: разница Эти белки обеспечивают правильный фолдинг синтезируемых белков за счет энергии гидролиза АТФ. Они особенно важны у прокариот, где фолдинг обычно не является котрансляционным. Шапероны могут также вернуть в нормальную конформацию многие денатурированные белки (накапливающиеся при многих стрессах, включая тепловой шок), а также предотвращают агрегацию олигомеров и обеспечивают их разделение. Наконец, шапероны участвуют в секреции, поддерживая секретируемые белки в развернутом состоянии. Шапероны из семейств Hsp70 и Hsp60 (аббревиатура из слов heat shock protein + мол. масса) присутствуют в цитоплазме в наибольших количествах. Гомологом Hsp60 у E. coli является GroEL, формирующий гигантский комплекс с GroES, в центральной полости которого целиком может поместиться белок размером до 55 кДа (Рис. 4.1.). GroES-GroEL комплекс имеет существенное сходство с эукариотической 26S Рис. 4.1. Шаперонин GroELS Рис. 4.2. Рабочий цикл шаперонина GroE - 20 - протеосомой, ответственной за деградацию меченых убихитином белков. У E. coli гомологом Hsp70 является DnaK, который образует комплекс с кошапероном DnaJ и белком GrpE (Рис. 4.3). E. coli также имеет дополнительные шапероны , такие как SecB, ClpB и IbpAB, взаимодействующие с белками, являющимися плохими субстратами для шаперонов Hsp70 и Hsp60 семейств. Почему белкам нужна помощь при фолдинге? При фолдинге белки проходят через ряд промежуточных конформаций, имеющих более высокую энергию, чем конечная конформация (Рис. 4.4). Поэтому для многих белков существуют локальные энергетические минимумы, в которых частично свернутый белок может задержаться надолго (Рис. 4.5). Белки, требующие помощи в фолдинге, опознаются аппаратом DnaK-DnaJ-GrpE, предположительно через находящиеся в контакте с раствором гидрофобные участки. Молекулярный шаперон затем, гидролизуя АТФ, "перетасовывает" конформацию многих оснований, фактически разворачивая белок и позволяя ему свернуться заново. Если нативная конформация не достигается таким путем, белок переходит в ведение шаперонина GroES-GroEL. Полость шаперонина экранирует белок от контакта с раствором и другими субъединицами, предотвращая агрегацию и позволяя белку спокойно свернуться. Специфичность шаперонов. Ш. взаимодействуют предпочтительно с гидрофобными АК, хотя SecB предпочитает положительно заряженные. Неправильно свернутые или денатурированные белки опознаются по гидрофобным участкам, в норме экранированным от контакта с раствором либо внутри молекулы, либо путем контакта с гидрофобной областью другого белка или с мембраной. Недавно было показано, что DnaK опознает гидрофобный участок из 4-5 оснований, одним из которых является лейцин; такой участок должен быть фланкирован основными АК. Такие участки встречаются в среднем через каждые 36 АК, обычно в экранированных участках молекулы. Шапероны и протеолиз. Роль шаперонов в протеолизе была продемонстрирована при изучении мутантов GroES-GroEL и DnaK - оказалось, что некоторые из них стабилизируют аномальные белки. Затем было обнаружено, что ряд цитоплазматических протеаз - ClpAP, ClpXP, HslVU - имеют одну субъединицу с активным сайтом для протеолиза, а вторую - с АТФ-зависимой шаперонной активностью. Кроме того, другие цитоплазматические протеазы, напр. HflB (FtsH), хоть и состоящие из одной полипептидной цепи, проявляют шаперонную активность в определенных условиях. Это свидетельствует о том, что АТФ- зависимость цитоплазматических протеаз может отражать шаперонную активность, денатурирующую субстрат, что делает его доступным для протеазы. (В принципе никакой энергии для самого протеолиза не нужно, т.к. расщепление пептидной связи - экзотермическая реакция.) Другая возможная функция АТФ - индукция конформационных изменений, ведущих к мультимеризации некоторых протеаз. Например, в отсутствие гидролиза АТФ протеаза ClpAP не может сформировать своей нормальной цилиндрической структуры, без чего ее взаимодействие с субстратами невозможно. Широкая субстратная специфичность шаперонов и, предположительно, протеаз отражает их способность узнавать в норме спрятанные гидрофобные области плохо свернутых или денатурированных белков. Такая общность узнавания создает дилемму: взаимодействие с шаперонами Рис. 4.3. Рабочий цикл шаперона DnaK - 21 - ведет к ренатурации или фолдингу, а взаимодействие с протеазами ведет к деструкции. Следовательно, клетка каким-то образом должна решить, по какому пути направить каждый поврежденный белок. Сигналы для протеолиза обычно располагаются на карбокси-конце. Как правило, это короткие последовательности из 5 или около того неполярных оснований. Искусственное добавление таких "ярлыков" к стабильным в норме белкам делает их субстратами для протеаз. Недавно был обнаружен еще один "ярлык" такого рода. Когда молекула мРНК внезапно обрывается посреди кодирующей последовательности в результате деградации либо просто в результате преждевременной терминации транскрипции, рибосома оказывается в состоянии с занятым пептидил-тРНК P-сайтом и свободным от кодона (и, соответственно, аминоацил-тРНК) A-сайтом (акцепторным сайтом). В этих условиях небольшая стабильная РНК, ssrA, действует сначала как аланил-тРНК, добавляя остаток аланина к пептиду, а затем как короткая мРНК, добавляя 10 неполярных аминокислот, за кодонами которых следует стоп. В результате образуется пептид, несущий на своем карбокси-конце 11 дополнительных АК, направляющих пептид на протеолиз ( в периплазме при помощи Tsr, а в цитоплазме - HflB или ClpXP протеаз). В случае же денатурированных или агрегированных белков, не имеющих специфического "ярлыка", вопрос о том, как клетка определяет их дальнейшую судьбу, остается открытым. АТФ-зависимые протеазы В отличие от эукариот, где множественные системы мечения белков убихитином направляют различные субстраты к единственной цитоплазматической протеазе (26S протеазе), за распознавание субстрата у прокариот отвечают сами протеазы, поэтому их в клетке, как правило, несколько (порядка шести). Энергозависимые протеазы представляют собой, как правило, крупные олигомерные комплексы. Для всех протеаз этого класса с известной структурой протеазные сайты располагаются во внутренней камере олигомера, вход в которую слишком мал для большинства нативных (свернутых) белков. Поступление субстрата внутрь такой полости обеспечивается регульторными АТФазными доменами (или субъединицами). Не удивительно, что именно АТФазные субъединицы отвечают за субстратную специфичность. Аминокислотные последовательности АТФазных субъединиц разных Рис. 4.4. Модель фолдинга короткого пептида Рис. 4.5. Изменение свободной энергии в процессе фолдинга - 22 - протеаз имеют сходство, которое может свидетельствовать о сходстве механизмов их действия. Поскольку распознавание субстратов осуществляется регуляторными АТФазами, свойства субстратов, приводящие к их деградации, не зависят от свойств, необходимых для разрезания пептидных связей. Как только белок распознается и связывается регуляторным АТФазным доменом, начинается последовательная деградация полипептидной цепи с разрезами через каждые 5-10 АК. У E.coli известны 4 АТФ-зависимые протеазы. ClpAP ClpXP. У этих протеаз АТФазная и протеазная активность принадлежат разным субъединицам, и неудивительно, что эти субъединицы способны действовать самостоятельно (Рис. 4.6). ClpA и ClpX могут действовать как шапероны. Гены clpX и clpP составляют оперон, clpA расположен отдельно в моноцистронном опероне. Оба оперона имеют типичные промоторы теплового шока. ClpYQ/HslUV HflB(FtsH) Zn и АТФ-зависимая протеаза, участвующая в деградации цитоплазматических и мембранных белков, включая RpoH, SecY (часть аппарата секреции). Единственная АТФ-зависимая протеаза, существенная для жизни E. coli. В опероне с RpoH-зависимым промотором. Lon. Деградирует белок N фага λ, ингибитор клеточного деления SulA, позитивный регулятор биосинтеза капсулы RcsA и др. Кроме специфических мишеней, Lon деградирует большинство аномальных белков E. coli. Белок – гомотетрамер, имеет сайты связывания с АТФ и ДНК, причем связывание с ДНК стимулирует протеазную активность. Транскрибируется с промотора теплового шока. В белке можно выделить два домена – собственно протеазный с карбоксильного конца с сериновым остатком в активном сайте и следующий за ним АТФазный. Экспериментально показано, что эти два домена могут быть экспрессированы как отдельные полипептиды, смесь которых функционально соответствует интактной протеазе Lon. Регуляция синтеза белков теплового шока. Шапероны и клеточные протеазы входят в состав регулона σ 32 вместе с другими белками теплового шока (Рис. 4.7). Кроме того, в состав уже рассмотренного нами ранее регулона σ E входят периплазматическая протеаза и шаперон. В последнее время было выяснено, что эти два регулона взаимосвязаны, Рис. 4.6. АТФ-зависимые протеазы: шаперон и протеаза в одной молекуле Рис. 4.7. Регуляция теплового шока у Escherichia coli - 23 - т.к. комплекс кора РНК-полимеразы с σ E активирует транскрипцию гена rpoH, кодирующего σ 32 , при экстремальных температурах (напр, 50°C). Многие протеобактерии имеют гомологи RpoH, и у них механизмы регуляции теплового шока являются схожими, тогда как грамположительные бактерии выработали другие, причем достаточно разнообразные, регуляторные стратегии для конкретных генов теплового шока. У клеток E. coli, перемещенных с 30° на 42°, уровень внутриклеточного σ 32 резко (хотя и ненадолго) возрастает, усиливая транскрипцию с промоторов теплового шока. Возрастание концентрации σ 32 является результатом стабилизации обычно весьма нестабильного σ 32 и активации трансляции уже существующей мРНК rpoH. Поскольку быстрая деградация σ 32 зависит от шаперонного комплекса DnaK-DnaJ-GrpE, стабилизация происходит из-за того, что шаперон загружается огромным количеством индуцированных стрессом неправильных белков и его уже не хватает для обработки σ 32 . В фазе адаптации, следующей за фазой индукции, синтез HSP снижается негативной обратной связью на нескольких уровнях экспрессии (трансляционная репрессия, дестабилизация и, возможно, инактивация σ 32 ). Количество шаперона DnaK-DnaJ в клетке невелико, поэтому он является весьма чувствительным средством мониторинга стрессов. В деградации σ 32 наибольшую роль играет, вероятно, связанная с мембраной АТФ-зависимая протеаза HflB (FtsH). Несколько цитоплазматических протеаз (HslVU, ClpAP и Lon), в норме отвечающих за деградацию аномальных белков, также способны деградировать σ 32 . Таким образом внутриклеточные протеазы вместе с шапероном DnaK-DnaJ способны регулировать тепловой шок, контролируя внутриклеточную концентрацию аномальных белков. Шапероны, конечно, не деградируют σ 32 непосредственно. Вступая в ассоциацию с РНК-полимеразой, σ 32 стабилизируется и становится нечувствительной к протеолизу. Роль шаперонов заключается в предотвращении связывания σ 32 с РНК-полимеразой, что позволяет протеазам ее деградировать. Индукция трансляции σ 32 происходит независимо не только от шаперонов, но и вообще от каких бы то ни было регуляторных белков. 5' область мРНК rpoH имеет уникальную вторичную структуру, закрывающую рибосомсвязывающий сайт. Эта структура стабильна при нормальной температуре, но денатурирует при ее повышении, что освобождает последовательность Шайн-Далгарно и позволяет инициировать трансляцию. Транскрипция rpoH может инициироваться с четырех промоторов, один из которых зависит от σ E , и регулируется белком DnaA и комплексом cAMP-CRP. Когда клетки E. coli подвергаются воздействию очень высоких температур, синтез почти всех белков в клетке прекращается. Исключения составляют лишь несколько белков, включая членов регулона σ Е ( σ 32 - один из таких белков). Другими членами этого регулона являются периплазматические протеаза DegP (HtrA) шаперон (пептидил-пролил цис- транс изомераза) FkpA, которые способствуют соответственно деградации и фолдингу поврежденных белков в периплазме. Мы уже рассматривали этот регулон раньше, поэтому пару слов о его регуляции при повышенной температуре. Как уже говорилось выше, активность σ E контролируется парой белков, RseA и RseB. Белок цитоплазматической мембраны RseA является анти-сигма фактором и репрессирует σ E регулон, связываясь с σ E и предотвращая его взаимодействие с промоторами. Периплазматический белок RseB взаимодействует с RseA и способствует инактивации σ E . Когда же в периплазме накапливаются аномальные белки, RseB с ними взаимодействует, освобождая RseA, что ведет к ослаблению связи последнего с σ E . Кроме того, важным результатом повышения температуры является изменение свойств мембраны - она становится более лабильной (становится "жиже"), что также способствует изменению конформации RseA, ослабляющему взаимодействие с σ E Регуляция теплового шока у грамположительных бактерий. Регуляторные стратегии у этих бактерий существенно отличаются от таковых E. coli, хотя некоторые принципы остаются. У B. subtilis гены теплового шока могут быть разделены по крайней мере на три класса. Гены первого класса (регулон CIRCE/HrcA) кодируют синтез основных шаперонов DnaKJ-GrpE и GroEL-GroES, и их экспрессия негативно контролируется репрессором HrcA, первым геном оперона dnaK. Действие этого репрессора осуществляется через связывание с оператором - инвертированным повтором CIRCE. Контроль этого регулона осуществляется при участии шаперонов, но, в отличии от контролируемой шапероном DnaKJ-GrpE деградации σ 32 у E. coli, здесь регуляторную функцию выполняет GroEL-GroES. Этот шаперон необходим для фолдинга HrcA, а титрование шаперона образующимися в стрессовых условиях аномальными белками приводит к снижению активности HrcA - 24 - и усилению экспрессии оперонов groE и dnaK. Таким образом, у грамположительных бактерий GroE, а не DnaK играет основную роль в регуляции теплового шока. Репрессор HrcA и CIRCE-элементы быки обнаружены не только у грамположительных, но и у альфа-протеобактерий, цианобактерий, хламидий и спирохет, однако их роль в регуляции теплового шока варьирует. Кo второму классу относится большая группа (50-100) генов, позитивно контролируемых сигма- фактором общего стресса σ B , которые кроме тепла индуцируются еще и голоданием по глюкозе или кислороду. Этот сигма-фактор регулируется сложным каскадом белок-белковых взаимодействий (включая фосфорилирование). К третьему классу относятся все остальные гены, не имеющие общей системы регуляции. Литература: 1. Susan Gottesman. Proteases and their targets in Escherichia coli. Annu. Rev. Genet. 1996. 30:465–506 2. Susan Gottesman. Regulation by proteolysis: developmental switches. Current Opinion in Microbiology 1999, 2:142–147 5. Холодовой шок Многие бактерии достаточно часто подвергаются холодовому шоку, т.е. воздействию температуры ниже оптимальной. Энтеробактерии, например, сталкиваются с этим стрессом при экскреции из организма животного, поэтому адаптация к холодовому шоку, обеспечивающая увеличение выживаемости этих бактерий в условиях пониженной температуры, представляет явное селективное преимущество. События, происходящие в бактериальной клетке при понижении температуры, в корне отличаются от происходящих при тепловом шоке, но также влияют на клетку весьма отрицательно. Понижение температуры не оказывает серьезного воздействия на клеточные белки (хотя их свойства и меняются, денатурации, в отличие от теплового шока, не происходит). Гораздо более сильные изменения претерпевает мембрана клетки - ее твердость увеличивается (она фактически замерзает), что затрагивает все связанные с мембраной функции. Клетка борется с этим путем снижения степени насыщенности мембранных липидов. Холодовой шок также вызывает стабилизацию вторичных структур РНК и ДНК, что ведет к снижению эффективности процессов трансляции, транскрипции и репликации ДНК. Клетка преодолевает негативные последствия холодового шока путем синтеза целого ряда белков, получивших название белков Исходное состояние: 30 °C Стимул: шок при 10 °C Сенсор: рибосомы Сигнал: ингибирование трансляции Регулятор: CspA Экспрессия генов холодового шока Синтез CspA, CsdA, Rbf и др. белков холодового шока Аттенуация холодового шока белками CspA и CspE Возврат в исходное состояние |