1.5 Триптофановый оперон
репрессибельный оперон
Оба оперона (lac и ara), рассмотренные нами ранее, являются индуцируемыми
(индуцибельными). Как мы уже обсуждали на первой лекции, индуцируемыми обычно являются катаболитные опероны. И такой тип регуляции естественен, поскольку обеспечивает синтез ферментов, отвечающих за утилизацию какого-либо питательного субстрата только в случае наличия этого субстрата. В другой ситуации, когда клетке нужно синтезировать какое-нибудь вещество и поддерживать его концентрацию на постоянном уровне, используются репрессибельные
(репрессируемые) опероны. Рассмотрим такой тип регуляции на примере триптофанового оперона.
- 8 -
Триптофановый оперон состоит из 5 структурных генов, кодирующих три фермента, превращающих хоризмовую кислоту в триптофан. (Г1 с.190). Биосинтез триптофана представляет собой классический случай ретроингибирования, то есть ингибирования активности одного из первых ферментов какого-либо биосинтетического пути конечным продуктом. Но кроме участия в ретроингибировании триптофан выполняет также и функцию корепрессора, активируя белок-репрессор.
Репрессор кодируется не связанным с trp опероном геном trpR. В условиях достаточных количеств триптофана комплекс корепрессор-TrpR связывается с оператором и ингибирует транскрипцию. (пару слов о генетической номенклатуре - TrpR vs trpR). Инактивация репрессора приводит к усилению транскрипции приблизительно в 70 раз. Это относительно небольшая разница (сравните с 1000-кратной индукцией lac оперона).Но такая кажущаяся неэффективность с лихвой компенсируется дополнительными уровнями регуляции - во-первых, ретроингибированием, а во-вторых, феноменом, называемым аттенуацией.
Аттенуация.
Между промоторной областью и первым структурным геном оперона имеется достаточно протяженный участок ДНК, к тому же кодирующий небольшой пептид. Эта последовательность ДНК называется лидером, а пептид - лидерным. И, как оказалось, лидер необходим для еще одного механизма регуляции экспрессии, называемого аттенюацией. Это явление достаточно широко распространено в биосинтетических оперонах, и его сущность заключается в следующем. За лидерным пептидом располагается шпилечная структура, являющаяся терминатором, на котором в условиях избытка триптофана транскрипция оперона благополучно и заканчивается, не достигнув структурных генов. Лидерный пептид богат триптофановыми кодонами. В условиях недостатка триптофана концентрация нагруженных триптофаном аминоацил-тРНК не высока, и рибосома "притормаживает" на триптофановых кодонах, не давая возможности образоваться терминаторной шпильке. В результате транскрипция продолжается и с рамок структурных генов считывается РНК. Лидерная область, также называемая аттенюатором, занимает 162 н.п. между стартом транскрипции и первым кодоном trpE гена.
Аттенюатор является барьером для транскрипции. Активной структурой здесь выступает
ρ−независимый терминатор - короткий GC богатый палиндром, непосредственно за которым следуют 8 остатков U (не забудьте, что сейчас мы говорим о структуре РНК). В присутствии триптофана 90%
РНК терминируется здесь (что вместе с репрессией дает приблизительно 600-кратное снижение транскрипции в присутствии триптофана).
Рассмотрим структуру аттенюатора подробнее
Аттенюатор содержит RBS, за которым следует рамка считывания, способная кодировать пептид длиной 13 аминокислот. Какова функция этого пептида? В положениях 9 и 10 он содержит два триптофановых остатка. В условиях недостатка триптофана рибосомы останавливаются, достигнув триптофановых кодонов, что препятствует формированию терминаторной шпильки. Лидерная РНК может образовывать три шпильки, а поскольку их последовательность перекрывается, возможны две альтернативные структуры. В первой из них участок 1 спаривается с участком 2, а участок 3 с участком
4. Таким образом, формируется три шпильки. Если же не дать участку 1 спариться с участком 2, то участок 2 может спариться с участком 3. В таком случае участку 4 спариваться не с чем, и терминаторная шпилька не образуется.
Следующий рисунок показывает, каким образом положение рибосомы при трансляции лидерного пептида влияет на образование шпилечных структур таким образом, что терминация происходит только при наличии триптофана. Как вы знаете, у прокариот процессы транскрипции и трансляции не разобщены, то есть трансляция мРНК начинается, как только синтезированы первые несколько десятков пар оснований. Поскольку стоп-кодон лидерного пептида находится как раз между комплиментарными участками 1 и 2, рибосома, дойдя до конца лидерного пептида, экранирует большую часть участка 2, не давая формироваться полноразмерной шпильке 2-3, поэтому терминаторная шпилька формируется беспрепятственно. В случае же голодания по триптофану рибосома с пустым А-сайтом притормаживает на триптофановых кодонах в ожидании триптофановой аминоацил-тРНК, что позволяет сформироваться полноразмерной шпильке 2-3. Соответственно, терминаторная шпилька в таких условиях образоваться не может. Если же клетка голодает по одной из аминокислот, чьи остатки располагаются в начале лидерного пептида, формирование шпильки 1-2 блокирует формирование шпильки 2-3 и, следовательно, позволяет сформироваться терминаторной шпильке 3-4.
- 9 -
Аттенуация - широко распространенное явление, встречающееся, как минимум, в шести оперонах биосинтеза аминокислот. В двух из них наблюдается явление мультивалентной репрессии -
thr оперон дерепрессируется при голодании по
thr и
ile, a
ilv оперон - по
ile,
leu и
val. Наконец, следует заметить, что формально в случае аттенуации рибосому можно считать активатором транскрипции, а аминоацил-тРНК - корепрессором.
1.6 Регуляция на стадии терминации. Антитерминация Итак, на примере аттенуации в триптофановом опероне мы только что рассмотрели регуляцию экспрессии на стадии терминации транскрипции. На первой лекции на примере лактозного оперона мы рассматривали регуляцию на стадии инициации транскрипции. При сравнении этих двух примеров может сложиться впечатление, что регуляция на стадии терминации - очень сложный процесс. Но это далеко не всегда так. Другой механизм регуляции на стадии терминации, называемый
антитерминацией, устроен проще. В случае антитерминации регуляторную функцию выполняет один белок, называемый антитерминатором. Этот белок предотвращает терминацию
транскрипции и позволяет считываться генам, расположенным за терминатором, выполняя, таким образом, активаторную функцию. Следует сразу заметить, что, в отличие от регуляторов транскрипции, действующих на стадии инициации, антитерминаторы не взаимодействуют с кофакторами, а либо являются активными постоянно, либо их активность модулируется фосфорилированием.
Классический пример антитерминации - регуляция жизненного цикла бактериофага
λ. Геном фага лямбда имеет три группы генов: немедленно ранние (предранние), задержанно ранние и поздние.
Названия групп отражают последовательность "включения", то есть активации транскрипции, этих генов. Оба этапа активации зависят от действия белков-антитерминаторов pN и pQ. Давайте подробно рассмотрим действие первого из них.
На рисунке показана упрощенная схема ранней области фага
λ. Два предранних гена,
N и
cro транскрибируются "влево" и "вправо" от промоторов
PL и
PR. В самом начале литического цикла развития бактериофага транскрипция останавливается непосредственно после генов
N и
cro на
ρ- зависимых терминаторах
tL1
и
tR1
. Синтезирующийся в результате предранней транскрипции белок pN позволяет РНК-полимеразе преодолевать терминаторы
tL1
и
tR1
и считывать располагающиеся за ними задержанно ранние гены.
Действие фактора
ρ. Терминация транскрипции при участии этого белка происходит, когда Rho, связанный с вновь образованным транскриптом, взаимодействует с РНК-полимеразой, остановившейся в области
ρ−зависимого терминатора. ДНК в области таких терминаторов, как правило, не имеет особой структуры, богата основаниями C и бедна G, первичная последовательность различных терминаторов не имеет заметного сходства. Rho обладает РНК-зависимой АТФазной активностью и способствует отсоединению РНК-полимеразы через взаимодействие с белком NusG.
Действие белка pN высоко специфично в том плане, что он обеспечивает
антитерминацию только на двух фаговых терминаторах, не влияя на терминацию транскрипции бактериальных генов. В то же время, если в фаговой ДНК точно в том же месте заменить фаговый терминатор любым
ρ-зависимым бактериальным терминатором, антитерминация по-прежнему будет происходить. Следовательно, белок pN не опознает терминатор как таковой, и перед терминатором должен существовать какой-то сайт, узнаваемый этим белком. Такие участки называются
nutL и
nutR (от англ.
N utilisation) для левого и правого терминатора соответственно. Эти участки располагаются на различных расстояниях от терминатора, в связи с чем возникает вопрос: "А как же они работают?". Когда pN узнает
nut сайт, он должен подействовать на РНК-полимеразу таким образом, что она не сможет больше узнавать терминаторный сайт. Сравнение сайтов между собой показало, что они состоят из 17 н.п. палиндрома
(который может образовать небольшую шпильку). Мутации в этом сайте, называемом также
boxB, лишают pN способности предотвращать терминацию. Непосредственно перед этим сайтом располагается октамерная последовательность, называемая
boxA, также участвующая в антитерминации.
Белок pN действует, скорее всего, опознавая шпилечную структуру, формируемую BoxB областью, непосредственно после ее синтеза РНК-полимеразой, одновременно контактируя с субъединицами полимеразы. После такого узнавания антитерминатор остается в комплексе с РНК- полимеразой, фактически становясь ее субъединицей и обеспечивая изменение ее специфичности по отношению к терминаторам.
- 10 -
Поиск мутантов, предотвращающих действие pN, привел к обнаружению еще нескольких белков, являющихся компонентами транскрипционного аппарата, NusA и NusB (
N utilisation
substance). Белок
NusA фактически является субъединицей РНК-полимеразы, снижающей скорость продвижения РНК- полимеразы, что облегчает терминацию, тогда как NusB как раз и является фактором, опознающим последовательность
boxA. Связывание NusB с транскрипционным комплексом усиливает антитерминацию. Еще один белок, NusG, необходим для
ρ-зависимой терминации, обеспечивая взаимодействие Rho и РНК-полимеразы.
2. Фосфотрансферазная система Бактериальная фосфоенолпируват:углевод фосфотрансферазная система (фосфотрансферазная система, ФТС) - это сложная
разветвленная сеть переносящих фосфат белков, основной функцией которой является поглощение определенных углеводов из внешней среды. Набор углеводов, поступающих в клетку посредством ФТС, сильно варьирует у разных видов. Механизм работы ФТС заключается в транспорте углеводов через клеточную мембрану, сопряженном с фосфорилированием углевода. Наличие соответствующего углевода в среде и его транспорт внутрь клетки ведут к значительному расходу высокоэнергетического фосфата и, соответственно, снижает концентрацию фосфорилированых промежуточных переносчиков. А эти промежуточные переносчики фосфата взаимодействуют со многими клеточными белками и изменяют их активность. Таким образом наличие или отсутствие определенных углеводов в среде через ФТС влияет на целый ряд важнейших процессов, таких, например, как хемотаксис, индукция катаболитных оперонов, метаболизм азота, компетентность и вирулентность. А поскольку некоторые бактерии, например,
Treponema pallidum, имея все компоненты ФТС, не транспортируют сахара посредством ФТС, регуляторная функция ФТС не менее важна, чем транспортная.
Вне зависимости от организма и углевода ФТС катализирует следующий процесс:
Фосфоенолпируват + углевод --> пируват + углевод-P (внутриклет.) (внеклет.) (внутриклет.) (внутриклет.) Фосфорилирование углевода сопряжено с его транслокацией через мембрану, а необходимая для этого энергия обеспечивается промежуточным продуктом гликолиза - фосфоенолпируватом (ФЕП).
Свободная энергия гидролиза фосфатной группы ФЕП - около -14.7 ккал/моль (больше, чем у АТФ), а для фосфорилированного сахара - около -3 ккал/моль. На первый взгляд, ФТС слишком расточительно расходует энергию. Однако, во-первых, в процессе гликолиза из молекулы ФЕП получается только одна молекула АТФ, а, во-вторых, ФТС обеспечивает одновременно и транспорт, и фосфорилирование своих субстратов (фосфорилирование необходимо для последующего катаболизма субстрата). Для углеводов, транспортируемых не-ФТС системами, на получение фосфорилированого субстрата внутри клетки расходуется более одной молекулы АТФ (как правило, одна на транспорт и одна на фосфорилирование).
Это одна из причин, по которой ФТС системы существуют в основном у облигатно и факультативно анаэробных бактерий. Такие бактерии получают АТФ путем субстратного фосфорилирования в анаэробных условиях и, следовательно, должны очень экономно расходовать молекулы АТФ, достающиеся им с таким трудом.
- 11 -
Белки ФТС традиционно разделяются на три группы - фермент I (EI), HPr (histidine protein) и фермент II (EII). EII обычно состоит из трех-четырех компонент (обозначаемых EIIA, EIIB, EIIC и
EIID), которые могут быть либо субъединицами одного белка, либо отдельными белками. Фермент I и
HPr - растворимые цитоплазматические белки размером соответственно 64-85 и 9-10 kDa, необходимые для фосфорилирования всех
ФТС сахаров данной бактерии, в связи с чем их называют общими белками
ФТС. С другой стороны, фермент II специфичен для каждого углевода, и либо является мембранным (если все компоненты его соединены в один белок), либо одна из разделенных субъединиц является мембранной.
Перенос фосфата к сахару происходит от фосфоенолпирувата через
EI, HPr, EIIA и EIIB.
Более подробно этот процесс на примере ФТС глюкозы у E. coli выглядит следующим образом
(Рис.2.1.(а)).
Сначала EI димеризуется и в таком состоянии автофосфорилируется, перенося фосфат с фосфоенолпирувата на
His-189. Затем EI фосфорилирует HPr по остатку His-15. Затем P-HPr фосфорилирует один из сахар- специфических белков (или доменов) EIIA, опять же по гистидиновому остатку (His-90), откуда фосфат переносится на Cys-241 мембранного белка EIIBC, который уже передает фосфат на транспортируемую глюкозу с образованием глюкозо-6-фосфата. Как же происходит собственно транспорт углевода внутрь клетки? Предполагается, что процесс протекает следующим образом.
Периплазматический субстрат связывается с высокой аффинностью со своим специфическим
EIIC. Домен или субъединица C фермента II является интегральным мембранным белком-переносчиком либо, по крайней мере, его субстрат-специфической частью. Этот переносчик (всегда в комплексе с
EIIB) и осуществляет транспорт углевода внутрь клетки.
Если EIIB не фосфорилирован, субстрат может только очень медленно транслоцироваться через мембрану путем облегченной диффузии. Фосфорилирование IIB по Cys остатку обеспечивает быструю транслокацию субстрата на цитоплазматическую сторону (происходит облегченная диффузия за счет конформационного изменения белка).
Затем происходит фосфорилирование связанного с переносчиком субстрата и его освобождение в цитоплазму.
Ряд экспериментов показывает, что транспорт сахара через мембрану не связан особенно тесно с фосфорилированием. Субстрат может отделяться от переносчика на внутренней стороне мембраны без фосфорилирования, более того, для некоторых Грам-положительных бактерий показана возможность работы переносчика в обратном направлении, то есть для выброса углевода из клетки. Иными словами, сам транспорт через мембрану является обратимым. Все стадии передачи фосфата с одного белкового переносчика на другой происходят практически без потери энергии и, следовательно, тоже являются обратимыми. Энергия высвобождается при передаче фосфата на транспортируемый сахар непосредственно после его проникновения в цитоплазму, что делает весь процесс необратимым и "запирает" сахар внутри клетки.
Пару слов о генетике ФТС. Гены, кодирующие общие компоненты ФТС, организованы в pts оперон, а специфичные для различных сахаров компоненты ФТС, как правило, расположены в оперонах с генами соответствующих катаболических ферментов, причем основной субстрат ФТС является индуктором всего оперона.
Рис.2.1. Принцип работы ФТС глюкозы
- 12 -
pts оперон состоит из трех генов, расположенных в следующем порядке:
ptsH (кодирует HPr),
ptsI (EI),
crr (EIIA
Glc
). Экспрессия оперона возрастает в три раза при росте на ФТС субстратах и требует присутствия комплекса БАК-цАМФ. Анаэробный рост также усиливает экспрессию оперона в соответствии с предположением о том, что ФТС - основной механизм транспорта углеводов в условиях анаэробиоза. Оперон имеет как минимум три промотора - два (P0 и P1) расположены перед
ptsH, а третий (P2) - перед
crr (внутри
ptsI). Перед промоторами P0 и P1 располагаются по сайту связывания
БАК с высокой и низкой аффинностью соответственно. P0 является основным промотором в присутствии комплекса БАК-цАМФ, а P1 - в его отсутствии. С этих промоторов считывается один длинный транскрипт, захватывающий все три гена оперона, и один короткий, перекрывающий только
ptsH. Еще один короткий транскрипт считывается с P2 и является основным для гена
crr. Такая организация транскрипции оперона обеспечивает большее количество молекул EIIA
Glc по сравнению с
HPr и EI. Транскрипция
pts оперона стимулируется нефосфорилированым EIICB
Glc
(c P0 промотора).
Таким образом, стимуляция транскрипции pts оперона комплексом БАК-цАМФ и EIICB
Glc
(?) действует в двух противоположных ситуациях - в отсутствии глюкозы в среде и в ее присутствии, результатом чего является поддержание экспрессии ФТС оперона на
сходном уровне в условиях как сильной, так и слабой катаболитной репрессии.
Мутанты, дефектные по EI или HPr, не способны утилизировать ФТС сахара как источники углерода. К таким сахарам у
Enterobacteriaceae относятся глюкоза, фруктоза, манноза, гекситолы,
β- глюкозиды, N-ацетилглюкозамин, сорбоза, сахароза, трегалоза и целлобиоза. Как ни странно, такие мутанты (по общим компонентам ФТС) также не растут и на ряде не-ФТС сахаров, к каковым относятся лактоза, мальтоза, мелибиоза, глицерин, рамноза, ксилоза и интермедиаты цикла Кребса. Почему это происходит?
Простейшая модель, объясняющая фенотип ФТС мутантов по отношению к утилизации не-ФТС сахаров, заключается в следующем. Фермент IIA
Glc может существовать в двух формах - фосфорилированой и нефосфорилированой. Степень фосфорилирования IIA
Glc определяется балансом между фосфорилированием его P-HPr и дефосфорилированием через IICB
Glc в присутствии его субстрата - глюкозы. IIA
Glc и P-IIA
Glc взаимодействуют с и регулируют различные белки. IIAGlc связывается с и ингибирует ряд ферментов, существенных для метаболизма углеводов, например, переносчики лактозы и мелибиозы, глицерол киназу. Прямым результатом такого взаимодействия является ингибирование транспорта и последующего метаболизма этих источников углерода. Такое явление называется исключением индуктора. Кроме того, фосфорилированый IIA
Glc участвует в активации аденилатциклазы. А поскольку цАМФ необходим для экспрессии многих катаболитных генов, регуляция уровня позволяет контролировать синтез ферментов. Но если регуляторной функцией обладает всего один компонент ФТС глюкозы, IIA
Glc
, как другие ФТС сахара оказывают ингибирующее влияние на утилизацию не-ФТС субстратов?
В клетке, растущей на не-ФТС субстрате общие ФТС белки (EI и HPr) будут находиться преимущественно в фосфорилированом состоянии, поскольку они не смогут "сбросить" фосфат на транспортируемый сахар (Рис.2.1.(b)). Добавление ФТС субстрата приведет к "разгрузке" фосфата с общих компонентов ФТС, а поскольку реакция фосфорилирования IIAGlc белком HPr обратима, это обеспечит дефосфорилирование IIAGlc. В таких условиях поступление в клетку не-ФТС субстратов будет ингибироваться из-за исключения индуктора нефосфорилированым IIAGlc, а экспрессия катаболитных генов будет минимальной из-за низкой концентрации цАМФ, возникающей из-за отсутствия стимулирования аденилатциклазы P-IIAGlc.
Как белок EIIA
Glc осуществляет свою регуляторную функцию? В зависимости от механизма действия EIIA
Glc не-ФТС сахара делятся на две группы. К первой относятся лактоза, мелибиоза, мальтоза и глицерол, ко второй - ксилоза, рамноза, галактоза и интермедиаты цикла Кребса. Для сахаров первой группы EIIA
Glc ингибирует и транспорт, и катаболизм. Транспорт ингибируется путем непосредственного связывания нефосфорилированого EIIA
Glc с мембранным транспортером соответствующего углевода, причем только тогда, когда транспортер уже связал свой сахар. Как происходит активация аденилатциклазы - неизвестно, но сниженный уровень цАМФ в отсутствии P-
EIIA
Glc определяет фактически полное отсутствие экспрессии генов катаболизма не-ФТС сахаров второй группы (Рис.2.2.).
- 13 -
Катаболитная репрессия Таким образом, мы снова возвращаемся к явлению катаболитной репрессии, и теперь у вас
должно быть четкое представление о том, чем объясняется классический феномен диауксии при росте E. coli на лактозе и глюкозе.
Однако, при общем сходстве ФТС систем у разных организмов механизмы катаболитной репрессии несколько различаются.
Рассмотрим роль компонентов ФТС в этом явлении у группы
Грам-положительных бактерий с низким
ГЦ содержанием на примере B. subtilis (Рис.
2.3.). Центральной молекулой, отвечающей за катаболитную репрессию у этой бактерии является HPr. В отличие от энтеробактерий, HPr у B. subtilis может быть фосфорилирован в двух положениях -
His-15 ФТС ферментом I и Ser-46 активируемой метаболитами (прежде всего, фруктозо-бис-фосфатом)
АТФ-зависимой HPr-киназой (продуктом гена ptsK). Фосфорилирование по Ser-46 служит исключительно регуляторным целям. Катаболитная репрессия у этих бактерий идет двумя путями: во- первых, через репрессию катаболитных генов и оперонов белком CcpA (catabolite control protein) и, во- вторых, за счет отсутствия индукции катаболитных генов и оперонов, что определяется HPr путем фосфорилирования соответствующих ферментов.
CcpA ингибирует транскрипцию катаболитных генов, связываясь с операторным сайтом, который в данном случае называется
cre (catabolite responsive element). CcpA принадлежит к классу
LacI-подобных регуляторов транскрипции.
Операторные сайты cre располагаются в регуляторных областях многих оперонов, таких как
xyl,
gut (утилизация глюконата),
hut (утилизация гистидина),
lev (транспорт фруктозы и деградация левана) и др. Для связывания CcpA с оператором cre необходимо действие корепрессора, которым в данном случае является фосфорилированый по Ser-46 HPr.
Активная форма репрессора состоит из димера CcpA и двух молекул HPr-S46-P.
Второй механизм катаболитной репрессии у Грам-положительных бактерий определяется действием специфических для каждого сахара регуляторов. Примерами таких регуляторов являются LevR, LicT и LacT, контролирующие синтез соответственно леваназы,
β-глюкозидазы и β-галактозидазы. Такие регуляторы действуют как активаторы транскрипции или антитерминаторы (подобно BglG у
E.coli), а общим между ними является наличие регулируемого ФТС домена (PRD). Активность этих регуляторов контролируется фосфорилированием белком HPr или EII. В отсутствие глюкозы HPr-H15-P фосфорилирует один из аминокислотных остатков PRD домена, что стимулирует активацию транскрипции. Фосфорилирование
HPr по Ser-46 HPr-киназой предотвращает фосфорилирование регуляторов. Таким образом создается связь между гликолитической активностью (которую детектирует HPr-киназа), степенью фосфорилирования HPr и активностью регуляторов, содержащих PRD домен.
Скачать 2.61 Mb.