Рис.11.2. Активация
σ
F
в преспоре
- 65 - уровне активности белка. Эта
регуляция осуществляется тремя белками, SpoIIE,
SpoIIAB и SpoIIAA. Как и
σ
F
, эти белки синтезируются в исходной клетке еще до ее полярного деления. SpoIIAB является анти- сигма фактором, который связывается с
σ
F
и ингибирует транскрипцию с его участием.
SpoIIAA - анти-анти сигма фактор, который противодействует эффекту SpoIIAB, связываясь с комплексом SpoIIAB
σ
F
и вызывая освобождение активного
σ
F
. SpoIIAB является также киназой, фосфорилирующей
SpoIIAA, предотвращая его связывание с собой. Таким образом, до образования септы
σ
F
находится в комплексе с SpoIIAB, то есть является инактивированным, а SpoIIAA фосфорилирован и поэтому не может освободить
σ
F
. После образования перегородки в действие вступает еще один фермент, SpoIIE, являющийся фосфатазой, специфически дефосфорилирующей SpoIIAAP. SpoIIE является интегральным мембранным белком, локализованным в перегородке между двумя компартментами.
Белок приблизительно одинаково экспонируется в обе стороны от перегородки, в связи с чем можно ожидать, что дефосфорилирование SpoIIAAP будет идти с одинаковой скоростью в обоих компартментах. Но поскольку объем преспоры в 5-7 раз меньше объема материнской клетки, концентрация дефосфорилированого SpoIIAA в преспоре будет в несколько раз выше, следовательно, в этом компартменте
σ
F
будет активирован раньше (Рис. 11.2).
Вскоре после активации
σ
F
в преспоровом компартменте происходит активация другого сигма- фактора,
σ
Е
, но теперь уже в материнской клетке (Рис. 11.3а). Так же, как и
σ
F
,
σ
Е
присутствует в обоих компартментах спорангия. Этот сигма-фактор необычен тем, что синтезируется в форме неактивного предшественника, пре-
σ
Е
. Синтез пре-
σ
Е
начинается до полярного деления путем индукции транскрипции оперона
spoIIG уже знакомым вам активатором транскрипции Spo0AP. Собственно пре-
σ
Е кодируется вторым геном оперона,
spoIIGB, а первый ген,
spoIIGA , необходим для процессинга пре-
σ
Е
в зрелый белок. Продукт еще одного гена,
spoIIR, необходим для процессинга пре-
σ
Е
, и транскрипция этого гена зависит от
σ
F
. Таким образом, появление
σ
Е
в материнской клетке привязано к отделению преспоры перегородкой, поскольку транскрипция зависимых от
σ
F
генов происходит только в преспоровом компартменте. (SpoIIR должен активировать
σ
Е
и в преспоре, но здесь
σ
Е
по неизвестной причине очень быстро деградирует.)
Что же контролируют два новых сигма-фактора? В
σ
Е
регулон входят гены, разрушающие пептидогликан септы, отделяющей преспору от материнской клетки, а гены, контролируемые
σ
F
, отвечают за обволакивание преспоры материнской клеткой. К моменту окончания поглощения преспоры материнской клеткой в преспоре начинается транскрипция нового гена,
spoIIIG, кодирующего еще один сигма-фактор,
σ
G
. Этот сигма-фактор активирует транскрипцию поздних генов преспоры, необходимых для завершения процесса споруляции. Промотор, с которого считывается
σ
G
, опознается ранним преспоровым сигма-фактором
σ
F
, но для его активации необходим неизвестный пока фактор, транскрибируемый с
σ
Е
промотора материнской клетки.
Рис.11.3. Активация σ
E и σ
K в материнской клетке Рис.11.4. Последовательная активация сигма-факторов при споруляции - 66 -
(SpoVT и самые поздние преспоровые гены)
Экспрессия поздних генов в материнской клетке находится под контролем сигма-фактора
σ
K
(Рис.
11.3b). Как и ранний сигма-фактор материнской клетки,
σ
Е
,
σ
K
синтезируется в виде неактивного предшественника пре-
σ
K
, который превращается в активную форму после протеолитического отщепления амино-концевой последовательности из 20 АК остатков. Протеолитическое расщепление пре-
σ
K
осуществляется одним из членов
σ
Е
регулона, SpoIVFA, для активации которого необходим продукт гена
spoIVB, транскрибируемого с
σ
G
промотора в преспоровом компартменте.
Экспрессия двух сигма-факторов в материнской клетке запускает последовательную цепь регуляторных событий, ведущую к поочередной
активации и инактивации комплекса генов, результатом работы которого является синтез споровых покровов, кортекса и внешней оболочки споры
(Рис 11.4).
1. R. Losick
2. M. Perego. Kinase-phosphatase competition regulates Bacillus subtilis development. Trends in
Microbiology. 1998. 6:366-370
Хороший обзор начальных стадий регуляции споруляции с упором на роль фосфотрансляционной системы.
12. Межклеточные коммуникации. Quorum sensing Дабы преуспеть, бактерии должны быть приспособлены к выживанию и существованию в сложных микробных сообществах. Взаимодействия между микроорганизмами в таких сообществах, равно как и между патогенными микроорганизмами и их хозяевами зависят от экспрессии специфических генов, участвующих в этих взаимодействиях. Не удивительно, что бактерии выработали механизмы детекции конкурентов и растительных либо животных хозяев и системы "быстрого реагирования" на подобные контакты. Во многих случаях экспрессия определенного набора генов будет зависеть от достижения бактериальной популяцией определенной плотности. Например, путем задержки экспрессии факторов вирулентности до тех пор, пока не будет достигнута высокая плотность популяции, патогены растений могут избегать защитной реакции своих хозяев.
У животных и растений проникающие через мембрану сигнальные молекулы, такие как стероидные и брассиностероидные гормоны, метилжасминат и др., являются хорошо изученными регуляторами развития, дифференциации клеток и метаболизма в целом. В последние годы у бактерий тоже были обнаружены сигнальные молекулы такого рода - ацилированные производные гомосеринлактона (АГСЛ), участвующие в межклеточной коммуникации. Бактерии используют эти молекулы прежде всего для того, чтобы следить за плотностью своей популяции. Этот феномен получил название "Quorum sensing" (чувство кворума). Каждая клетка в популяции продуцирует низкий базальный уровень свободно диффундирующего АГСЛ за счет активности специфического фермента,
АГСЛ синтетазы, как правило, члена LuxI-семейства белков. С возрастанием плотности бактериальной популяции концентрация АГСЛ также возрастает. При достаточно высокой плотности, т.е. по достижении кворума, накопленный АГСЛ взаимодействует с рецепторным белком, обычно с членом
LuxR-семейства белков-регуляторов транскрипции, которые изменяют уровень экспрессии АГСЛ- зависимых генов. У различных бактерий принцип действия АГСЛ-зависимой регуляции сохраняется, хотя набор регулируемых генов может быть совершенно разным. Первой (в 1970 г.) была описана
АГСЛ-сенсорная система морской бактерии
Vibrio fisheri, где "чувство кворума" регулирует экспрессию генов биолюминесценции (
lux). У других бактерий тот же механизм регулирует экспрессию генов вирулентности (
Pseudomonas aeruginosa, Erwinia carotovora), конъюгационного переноса Т-ДНК
(A
grobacterium tumefaciens), подвижность (
Serratia liquefaciens), продукцию антибиотиков (
Erwinia carotovora) и др (Рис. 12.1).
Когда бактерии
Vibrio fisheri колонизируют специальные органы некоторых видов рыб и кальмаров, они начинают светиться в результате активации
lux-оперона, кодирующего фермент -
- 67 - люциферазу, непосредственно производящий свечение, и ряд ферментов, определяющих синтез субстрата для люциферазы - алифатического альдегида, энергия окисления которого и расходуется на свечение. Продукт гена luxI кодирует синтез АГСЛ, в данном случае N-(3-оксогексаноил)-L- гомосеринлактона. Это вещество способно свободно диффундировать во внешнюю среду через бактериальные мембраны. Во время периода несимбиотической жизни Vibrio fisheri в морской воде
АГСЛ в результате такой диффузии не накапливается в клетке и бактерия не тратит энергию на свечение. С другой стороны, при быстром росте в богатой среде световых органов хозяина, где плотность клеток бактерий достигает 10 10
на миллилитр, АГСЛ накапливается в бактериальных клетках, приводя к индукции люциферазного оперона.
Самой по себе аккумуляции АГСЛ в клетке недостаточно для активации экспрессии люциферазных генов. Еще один ген, luxR, кодирует транскрипционный активатор, который взаимодействует с АГСЛ. Этот белок имеет два четко выраженных домена. Карбокси-концевой содержит HTH мотив, отвечающий за связывание белка с ДНК в специфических симметричных участках, называемых lux-боксами. Эти короткие (20 н.п.) последовательности были идентифицированы в промоторных областях многих генов, регулируемых АГСЛ. Амино-концевой домен LuxR взаимодействует с АГСЛ. Предполагается, что в отсутствие АГСЛ C-концевой ДНК-связывающий домен экранируется N-концевым доменом, что предотвращает связывание с ДНК. Связывание АГСЛ N- концевым доменом вызывает конформационное изменение, позволяющее амино-концевому домену
LuxR связаться с lux-боксами и активировать транскрипцию.
Интересно, что не все LuxR-подобные белки являются активаторами транскрипции. Белки EsaR и
ExpR, продуцируемые растительными патогенами Pantoea stewartii и Erwinia carotovora, являются репрессорами. Для этих белков связывание АГСЛ снижает их аффинность к lux-боксам. Тогда как большинство LuxR-подобных активаторов связывается с lux-боксами, перекрывающимися с -35 областью промотора, EsaR связывается в области -10, что, естественно, предотвратит инициацию транскрипции.
Синтез АГСЛ.
АГСЛ имеют общую структуру алифатической цепочки различной длины, присоединенной через амидную связь к лактонизированному остатку гомосерина.
Рис.12.1 Автоиндукторы грамотрицательных бактерий
- 68 -
LuxI катализирует связывание S-аденозилметионина (SAM) с жирнокислотной цепочкой, синтезированной при участии ацил-ацил переносящего белка (ACP). Последующая за образованием амидной связи лактонизация S-аденозилметионина приводит к образованию кольца, освобождению
АГСЛ и образованию побочного продукта - 5-метилтиоаденозина (MTA).
Регуляция синтеза экзоферментов у Erwinia Фитопатогенные бактерии
Erwinia carotovora продуцируют довольно широкий спектр гидролитических ферментов, деградирующих клеточные стенки растений. К
таким ферментам относятся пектатлиазы, целлюлазы, полигалактуроназы и протеазы.
Развитие этого патогена в растениях ведет к индукции этих ферментов, результатом чего является мацерация растительных тканей и развитие симптомов мягкой гнили. Продукция внеклеточных ферментов зависит от накопления
N-3-оксогексаноил-L-гомосерин лактона, синтез которого детерминируется гомологами LuxI, которые у разных штаммов называются ExpI,
CarI и HslI. Рядом с геном
expI находится
expR - гомолог
luxR. Мутанты по гену
expI имеют сниженную, а по гену
expR - повышенную продукцию экзоферментов.
Рис.12.2. Ситез АГСЛ и механизм его действия Рис.12.3. Регуляция синтеза факторов вирулентности Erwinia посредством АГСЛ - 69 -
Кроме того, некоторые штаммы
Erwinia carotovora продуцируют
β-лактамные антибиотики широкого спектра действия - карбапенемы. Синтез карбапенемов координирован с экспрессией экзоферментов и может служить для ингибирования других бактерий при конкуренции за питательные вещества, высвобождающиеся при мацерации растительных тканей. Синтез карбапенемов контролируется парой белков CarR и CarI, гомологичных, но не идентичных по своим функциям ExpR и
ExpI. CarR и ExpR не взаимозаменяемы, но АГСЛ, продуцируемый CarI, идентичен таковому ExpI.
Продукция экзоферментов у
Erwinia контролируется дополнительно еще несколькими регуляторными системами.
Роль АГСЛ-сигналов в экологии бактериальных популяций. Кросс-сигналы (и ингибирование антибиотиками). Рассмотренный нами только что способ коммуникаций между бактериальными клетками за счет секретируемых небольших молекул-феромонов достаточно широко распространен в природе, но далеко не всегда молекулярные механизмы, лежащие в его основе, аналогичны только что описанным.
Например, грамположительные бактерии вместо АГСЛ используют короткие пептиды в качестве феромонов. Будучи пептидами, эти молекулы не могут свободно проникать через мембраны и поэтому активно секретируются из бактериальной клетки, используя мембранные транспортеры ABC-класса.
Пептидные сигналы, естественно, не могут также проникнуть и внутрь клетки-мишени, а посему распознаются снаружи типичной сенсор-киназой, передающей сигнал (в виде фосфогруппы) внутриклеточным регуляторам. Таким образом регулируются компетентность и споруляция у
Bacillus subtilis, вирулентность у
Staphylococcus aureus, конъюгация у
Enterococcus faecalis и продукция микроцина у
Lactobacillus sake. Литература: 1. C. Fuqua, M.R. Parsek and E.P. Greenberg. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing. Annu. Rev. Genet. 2001. 35:439–68
13. Секреция белков Около 20% всех белков, продуцируемых бактериями, локализованы вне цитоплазмы.
Секреция белков за пределы цитоплазмы является важнейшей способностью вирулентных бактерий, поскольку большинство стадий процесса инфекции представляет собой ту или иную форму взаимодействия с внешней средой, и многие белковые продукты должны либо располагаться на внешней поверхности бактерии либо секретироваться во внешнюю среду. Кроме того, секреция белков имеет важнейшее значение для биотехнологии, поскольку очистка белков из культуральной
среды простого состава значительно проще, чем из клеточных лизатов, являющихся сложной смесью большого числа различных веществ. В связи с таким значением секреции этот процесс интенсивно изучается. Одним из непредвиденных результатов такого изучения стало обнаружение нескольких путей экспорта белков. Анализ родственных связей между белками, входящими в состав различных систем секреции у разных организмов позволил разбить эти системы на несколько групп, внутри которых механизм секреции идентичен или очень схож. Сейчас выделяют пять основных типа секреции, которые мы по очереди и разберем. Интересно, что компоненты секреции трех из пяти типов секреторных систем имеют значительное сходство с белками, участвующими в сборке жгутиков и ворсинок (пилей).
К сожалению, иногда в литературе по секреции не очень четко используются термины, в связи с чем не всегда понятно, о каком типе транспорта через мембраны идет речь. Поэтому здесь мы будем пользоваться следующими терминами для дифференциации основных секреторных путей по месту назначения транспортируемого белка:
•
секреция – транспорт белка в окружающую среду. В случае грамотрицательных бактерий для этого белку необходимо преодолеть две мембраны – цитоплазматическую и внешнюю.
- 70 -
•
экспорт - выведение белка за пределы цитоплазмы. Термин используется исключительно для грамотрицательных бактерий. Результатом экспорта является транспорт белка в периплазматическое пространство.
•
транслокация – доставка белка патогенными бактериями в эукариотическую клетку хозяина. В случае грамотрицательных бактерий этот тип транспорта требует преодоления уже трех мембранных барьеров – двух бактериальных и одного эукариотического.
Важной проблемой секреции является направление секретируемого белка к месту его назначения.
Секретируемые белки могут оказываться в различных местах:
• быть полностью встроенными в цитоплазматическую мембрану (интегральные мембранные белки, каковыми является большинство мембранных транспортеров);
• быть "заякоренными" в цитоплазматической мембране при помощи трансмембранного гидрофобного сегмента (практически всегда N-концевого), к этому классу принадлежит большинство периплазматических белков;
• полностью находиться в периплазме;
• быть полностью встроенными во внешнюю мембрану (порины);
• заякориваться во внешней мембране так, что основная масса белка располагается либо снаружи
(чаще всего) либо в периплазматическом пространстве;
• во внешней среде (собственно секретируемые белки, к которым принадлежит большинство гидролитических ферментов патогенов);
• ассоциированными с мембраной эукариотической клетки (некоторые компоненты аппарата секреции III типа)
• внутри другой клетки, как правило эукариотической (большинство субстратов секреции III и IV типов)
И во всех этих случаях место конечной дислокации белка определяется его аминокислотной последовательностью – секреторные системы распознают определенные консервативные последовательности (мотивы) и направляют секретируемый белок в соответствии с записанной в этих мотивах информацией. Типичным примером того, как сложно бывает клетке определить назначение белка, является транспорт через внутреннюю мембрану интегральных мембранных белков и субстратов
Sec-системы (части аппарата секреции II типа).
Для обоих классов белков сигналом их локализации являются довольно протяженные участки гидрофобных аминокислот (порядка 20 АК остатков). Такие участки, принимая
α-спиральную конформацию, способны легко встраиваться в липидный бислой (поскольку на наружной поверхности такой спирали располагаются исключительно гидрофобные боковые группировки, а длина спирали как раз соответствует толщине липидного бислоя). Судьба белка будет зависеть от того, с каким из секреторных шаперонов – белком SecB (о котором мы поговорим чуть позже) или рибонуклеопротеидным комплексом SRP – провзаимодействует секретируемый белок.
Бактериальная "частица, распознащая сигналы" (signal recognition particle, SRP) является упрощенным аналогом эукариотической частицы с таким же названием. В клетках млекопитающих все секретируемые белки направляются в эндоплазматический
ретикулум при помощи одного механизма, основой которого и является SRP. Эукариотическая SRP – крупный рибонуклеопротеидный комплекс, состоящий из 6 полипептидов и молекулы РНК длиной 300 рибонулеотидов. Сначала 54 kDa субъединица SPR (SRP54) узнает специфические гидрофобные сигналы сразу после того, как они выходят с транслирующей рибосомы. Такими сигналами являются либо N-концевые отрезаемые сигнальные последовательности либо первый трансмембранный сегмент. Как только SPR свяжется с сигналом локализации, комплекс рибосома-мРНК-полипептид мигрирует к эндоплазматическому ретикулуму, где взаимодействие между SPR и гетеродимером рецептора SPR (SR) катализирует высвобожбение синтезирующегося полипептида из комплекса и его инсерцию в транслокационный канал.
У прокариот интегральные мембранные и прочие секретируемые белки движутся к внутренней мембране по различным путям. Интегральные мембранные белки направляются к внутренней мембране при помощи бактериального варианта SPR. У бактерий SRP состоит всего из двух компонентов: белка
Ffh - гомолога SPR54 и более короткой (около 100 нуклеотидов) РНК (4.5S РНК), а SR (рецептор SRP)
- 71 - состоит только из гомолога
α-субъединицы эукариотического SR - белка FtsY. Несмотря на существенные структурные отличия, биохимические свойства бактериальной SRP сходны с эукариотическим аналогом. Как и у эукариот, SRP из
E. coli котрансляционно распознает трансмембранные сегменты как секреторные маркеры. С другой стороны, многие секретируемые белки направляются к аппарату секреции молекулярными шаперонами, такими как DnaK или (чаще) SecB.
Первая стадия реакции требует присутствия специфичных для секреции шаперонов - SecB и рибонуклеотидного комплекса называемого signal recognition particle (SRP), который состоит из белка
Ffh и 4.5S РНК.
SecB и SRP узнают каждый свою часть секретируемых белков. Функция SRP наиболее существенна при экспорте интегральных мембранных белков. Самые последние экспериментальные данные свидетельствуют в пользу того, что для транспорта интегральных мембранных белков (не имеющих протяженных цитоплазматических или периплазматических петель) достаточно только SRP
(вместе с ее рецептором SR), а ни один из Sec белков не нужен.
Выбор SRP или SecA/SecB пути происходит "на выходе" синтезирующейся белковой цепи из рибосомы. Бактериальная SRP селективно распознает белки внутренней мембраны по их протяженным трансмембранным сегментам. А сходное взаимодействие SRP с менее гидрофобными и более короткими сигнальными последовательностями секретируемых белков, возможно, предотвращается ассоциированным с рибосомами шапероном триггерным фактором, который сильно связывается с цитоплазматическими и секретируемыми белками, но не взаимодействует с белками внутренней мембраны. Секреторные шапероны успешно распознают более короткие и менее гидрофобные трансмембранные сегменты сигнальных пептидов и направляют содержащий их белок к секреторному аппарату.
Основная проблема, решаемая всеми секреторными системами – обеспечить прохождение через гидрофобную мембрану длинной полипептидной цепи, содержашей значительные гидрофильные участки, и к тому же в нативном состоянии свертутой в громоздкую структуру. Именно поэтому, несмотря на то, что транспорт идет по градиенту концентрации, все секреторные системы расходуют энергию АТФ – на решение конформационных проблем. В решении конформационных проблем также участвует особый класс белков – секреторные шапероны. От уже изветных вам шаперонов GroE/DnaK секреторные отличаются участием исключительно в процессе секреции, и их функцией является задержка фолдинга секретируемых белков. Большинство секретируемых белков являются глобулярными и в полностью свернутом виде они просто не в состоянии преодолеть мембрану.
Секреторные шапероны, как правило, связываются с предназначенным для секреции белком сразу же после его схода с рибосомы и не дают ему принять окончательную конформацию. Секреторный шаперон фактически доставляет белок с рибосомы к секреторному аппарату. Кроме того, для "разворачивания" (денатурации) белка, которая понадобилась бы, не будь секреторных шаперонов, необходима энергия, и секреторные шапероны ее экономят. Наконец, в некоторых случаях секреторные шапероны определяют специфичность секреторного аппарата. Так, в случае системы секреции III типа многие ее субстраты опознаются не сами по себе, а по шаперону, с которым они связаны. Очевидно, что в таком случае шапероны должны обладать высокой специфичностью. И действительно, для секреторных шаперонов аппарата секреции III типа субстратом является один, реже два белка. И в случае других секреторных шаперонов им в целом характерна большая избирательность по отношению к субстрату по сравнению с шаперонами HSP60/HSP70.
Интересно заметить, что эукариоты не имеют
секреторных шаперонов по той простой причине, что секреция белка у них сопряжена с трансляцией – синтезируемая белковая цепь сразу, не успев принять свою нативную конформацию, попадает в секреторный канал. Прокариоты не могут воспользоваться таким механизмом, поскольку у них рибосомы присутствуют в огромном избытке по отношению к мембранным транслоказам (у эукариот такого избытка нет из-за гораздо большей поверхности эндоплазматического ретикулума) и сопряжение секреции с трансляцией привело бы к существенному снижению скорости синтеза белка.
Скачать 2.61 Mb.