ЛЕКЦИИ Регуляция метаболизма Курс лекций. Е.А. Николайчик. Курс лекций Минск 2002 II
 Скачать 2.61 Mb.
|
|
Рис.13.5. Транскрипционная регуляция систем секреции III типа - 80 - пронизывающее периплазматическое пространство, состоит из 5 белков (FlgB, C, F и G, FliE). К нему прикреплен достаточно гибкий крюк (FlgE), выходящий за пределы поверхности клетки. K крюку присоединена длинная нить жгутика, состоящая из одного белка (FliC), для прикрепления которого к крюку необходимы два белка, FlgK и FlgL, а конец нити жгутика защищен еще одним белком, FliD. Базальное тело жгутика представляет собой не что иное, как секреторный аппарат секреции пяти белков – субъединиц крюка, нити и FlgK, FlgL и FliD. А поскольку диаметр секреторного канала, через который должны проходить эти белки, невелика – всего 25-30Å, все эти белки (включая и некоторые субъединицы базального тела) должны транспортироваться в частично развернутом состоянии. Что проблематично, ибо эти белки преимущественно имеют α-спиральную структуру и имеют выраженную склонность к олигомеризации. Для предотвращения окончательного фолдинга и самосборки жгутиковых субъединиц в цитоплазме бактерия использует специфические шапероны, которых на сегодняшний день описано три – FlgN, FliT и FliC. Таким образом, использование субстрат-специфических шаперонов в процессе секреции является характерным для обоих “подтипов” аппаратов III типа. Оба типа шаперонов обычно связываются с небольшим районом субстрата. Но имеются и существенные отличия. Для факторов вирулентности этот район располагается в пределе первых 125 аминокислот с N-конца и соответствует области, необходимой для транслокации субстрата в эукариотические клетки, тогда как шаперон-связывающий домен жгутиковых белков расположен в пределах последних 40 АК белка (самый карбокси-конец) и необходим для взаимодействия жгутиковых субъединиц между собой. Что же представляет собой секреторный сигнал? Как у жгутиковых субъединиц, так и у продуктов генов вирулентности он расположен в N-конце белка. Но по крайней мере в случае Yop белков белковая природа сигнала находится под вопросом. Эксперименты со введением сдвига рамки в начальную часть yop генов показали, что секреция не нарушается, если этот сдвиг компенсируется еще одной мутацией через 15-17 кодонов. С другой стороны, по крайней мере для некоторых Yop белков показана абсолютная зависимость секреции от действия соответствующего шаперона. Секреторный аппарат IV типа Система секреции IV типа имеет выраженное сходство с аппаратом конъюгации ряда плазмид и скорее всего произошла от него. Эта экспортная система характеризуется чрезвычайно широкой специфичностью как по отношению к субстратам (крупные нуклеопротеидные комплексы, мультикомпонентные белковые токсины и мономерные белки), так и по отношению к мишеням секреции, каковыми могут служить бактерии, грибы, растения и животные (иными словами, клетки представителей всех царств за исключением архей). Изначально система секреции IV типа была выделена при обнаружении сходства трех секреторных аппаратов - транспорта T-ДНК A. tumefaciens, Tra системы IncN плазмиды pKM101 и системы секреции токсина B. pertussis. Затем сходство с этими секреторными аппаратами было обнаружено у еще нескольких Tra систем и системы секреции балка CagA – фактора вирулентности Helicobacter pylori. Таким образом, многие системы IV типа переносят ДНК, но необходимо отметить, что переносится не ДНК сама по себе, но однонитевая ДНК, связанная с одним или несколькими белками. Эти белки участвуют в процессинге ДНК в точке начала переноса (oriT), ведущем к образованию конъюгационного интермедиата. Трансэстераза инициирует процессинг, связываясь с ДНК в точке oriT (либо функционально эквивалентвых границах Т-ДНК у агробактерий) и внося одноцепочечный разрыв. После внесения разрыва трансэстераза остается ковалентно связанной с 5' концом одной нити через тирозиновый остаток. Однонитевая ДНК при конъюгации переносится как раз в направлении 5' -> 3', и скорее всего именно трансэстераза обеспечивает опознавание конъюгационного интермедиата секреторным аппаратом. В случае A. tumefaciens трансэстераза VirD2 экспортируется вместе с Т-ДНК в растительную клетку , где сигналы ядерной локализации, присутствующие в VirD2, направляют Т-ДНК в ядро клетки. Таким образом, конъюгационные системы можно рассматривать как аппарат секреции белка, приспособленный для экспорта ковалентно связанной с белком ДНК. Кроме того, недавно было показано, что конъюгационные системы могут транспортировать и не связанные с ДНК белки. Так, Tra аппарат плазмиды RP4 способен секретировать белок RecA, а система - 81 - переноса Т-ДНК способна секретировать VirE2 (SSB белок) и еще один фактор вирулентности, VirF. Интересно, что для секреции VirE2 необходимо участие шаперона VirE1. VirE1 стабилизирует VirE2 in vivo и препятствует его агрегации in vitro, что делает его похожим на Syc шапероны Yersinia. Белковые субстраты систем секреции IV типа патогенов животных радикально отличаются от субстратов Tra систем, тем не менее, имеется значительное сходство аппаратов секреции. Например, система Ptl B. pertussis секретирует сложный токсин PT, принадлежащий к группе A/B токсинов и состоящий из 5 субъединиц, S1-S5. Домен А токсина состоит из субъединицы S1, а В домен – из S2-S5 субъединиц в соотношении 1:1:2:1. В отличие от Tra систем экспорт PT – двухстадийный процесс. Субъединицы ПТ сначала экспортируются через цитоплазматическую мембрану при помощи Sec системы, затем холотоксин собирается в периплазме и в собранном виде транспортируется через внешнюю мембрану системой Ptl. После экспорта В домен токсина взаимодействует с гликопротеиновыми рецепторами хозяйской клетки и обеспечивает транслокацию домена А внутрь. Внутри хозяйской клетки домен А нарушает сигнальные пути путем рибозилирования регуляторных белков. Аппарат секреции IV типа (который мы рассмотрим на примере более изученных Tra систем) состоит состоит из двух поверхностных структур, конъюгационного канала, через который происходит транслокация ДНК и белков, и конъюгационного пилюса, необходимого для контакта с реципиентной клеткой. Структура системы секреции изучена недостаточно, и пока выделяют несколько групп белков, функции которых до конца не выяснены: поверхностные белки, участвующие в формировании пилюса и др. поверхвостных структур; компоненты конъюгационного канала; АТФазы цитоплазматической мембраны. Изучение систем секреции II-IV типов выявило некоторое сходство между ними. Так, системы III и IV типа начинают секрецию только при контакте с клеткой-мишенью. Обе системы используют специфические шапероны. Обе системы (как правило) транспортируют субстраты в одну стадию через трансмембранный канал, пронизывающий обе мембраны. Наконец, обе системы каким-то образом используют пили в секреторном процессе. Имеется также сходство и с системой секреции II типа (особенно если рассматривать секрецию PT B. pertussis). Интересно, что холерный токсин, очень схожий с PT B. pertussis, транспортируется через систему II типа. Кроме того, бактериофаг CTX φ V. cholerae выходит из клетки через аппарат II типа – таким образом, и система секреции II типа может обеспечивать транспорт ДНК в ассоциации с белками. В дополнение к секреторным механизмам, требующим участия специального аппарата секреции недавно был описан случай "самотранспорта" белка, а именно протеазы IgA Neisseria gonorrhoeae через внешнюю мембрану Литература: 1. A. Economou. Following the leader: bacterial protein export through the Sec pathway. Trends in Microbiology 1999 VOL. 7 NO. 8 p. 315-320 2. D. M. Anderson and O. Schneewind. Type III machines of Gram-negative pathogens: injecting virulence factors into host cells and more. Current Opinion in Microbiology 1999, 2:18–24 Рис.13.6. Сходство систем секреции I-III типов - 82 - 2. S. Lory. Secretion of proteins and assembly of bacterial surface organelles: shared pathways of extracellular protein targeting. Current Opinion in Microbiology 1998, 1:27–35 (Сравнительная характеристика 4 путей секреции) 4. L. W. Cheng and O. Schneewind. Type III machines of Gram-negative bacteria: delivering the goods. Trends in Microbiology 214-220 Vol. 8 No. 5 May 2000 5. C. J. Hueck. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology And Molecular Biology Reviews, 1998, p. 379–433 Vol. 62, No. 2 14. Строгий ответ Это реакция клеток на аминокислотное голодание, приводящая к значительному замедлению синтеза стабильных РНК (рРНК и тРНК) и некоторых мРНК, необходимых для синтеза рибосомных белков, факторов элонгации EF-Ts, EF-Tu и EF-G, α-субъединицы РНК-полимеразы, а также к усилению транскрипции оперонов биосинтеза аминокислот. Общий синтез РНК снижается в итоге до 5- 10% от нормального. Возрастает скорость деградации белка, уменьшается синтез нуклеотидов, липидов и углеводов. Строгая регуляция осуществляется несколькими генами, наиболее изученным из которых является ген relA. Этот ген отвечает за синтез двух специфических нуклеотидов, накапливающихся при аминокислотном голодании - гуанозинтетрафосфата (ppGpp) и гуанозинпентафосфата (pppGpp). Эти нуклеотиды и являются ингибиторами синтеза специфических типов РНК. Сигналом образования ppGpp служит не непосредственно отсутствие какой-либо аминокислоты, а недостаток аминоацил- тРНК. Белок RelA в ассоциации с рибосомами синтезирует (p)ppGpp только когда в А-сайте рибосомы оказывается ненагруженная аминикислотой тРНК. Строгий ответ - фундаментальный механизм регуляции, свойственный практически всем бактериям, но интересно, что некоторые из них приспособили его в качестве сенсорной системы для регуляции других клеточных функций. Так, миксобактерии используют гуанозинтетрафосфат в качестве сигнала к образованию плодовых тел. Клетки миксобактерий не имеют жгутиков, однако способны передвигаться за счет скольжения по различным поверхностям, включая поверхность других клеток. Используя такую способность, миксобактерии строят свои плодовые тела, начиная с однородного тонкого слоя клеток. Весь процесс занимает несколько часов. сначала появляется несколько локальных скоплений клеток, затем, как только в одном из них соберется около 10 5 клеток, начинается миграция всех остальных клеток популяции в это скопление, формирование плодового тела характерной для каждого вида формы и дифференциация палочковидных клеток в сферические споры. Голодание по любой аминокислоте вызовет накопление (p)ppGpp, а поскольку синтез аминоацил- тРНК зависит от АТФ, недостаток энергии или фосфата будет иметь тот же эффект, что и аминокислотное голодание. У миксобактерий накопление (p)ppGpp имеет тот же эффект, что и у E. coli, но дополнительно еще запускает программу дифференциации, контроль которой осуществляется рядом секретируемых пептидных факторов и соответствующих сенсоров вкупе с системами передачи сигнала. Строгий ответ индуцирует экспрессию генов, необходимых для перестройки внутриклеточного метаболизма в соответствии с голоданием, а также индуцирует синтез специфического феромона - А- фактора. A-фактор активирует экспрессию группы генов, необходимых для агрегации миксобактерий. Одним из этих генов является csgA, кодирующий синтез следующего межклеточного сигналa, C- фактора - поверхностного белка размером 17 кДа. C-фактор, в свою очередь, контролирует три процесса - агрегацию клеток, экспрессию целого ряда генов (включая сам csgA) и споруляцию. C- фактор, закрепленный на поверхности одной клетки, при контакте с другой индуцирует активацию двухкомпонентной сенсорной системы с регулятором транскрипции FruA. FruA имеет три мишени - frz, devTRS и csgA. Первая мишень кодирует белки, гомологичные Che белкам E. coli и отвечающие за направление скольжения миксобактерий, и результатом такой активации является агрегация клеток в плодовые тела. Продукты оперона devTRS необходимы непосредственно для споруляции. - 83 - 15. SOS ответ Бактерии очень часто подвергаются воздействию различных природных и антропогенных воздействий, которые нарушают целостность ДНК. Повреждения ДНК блокируют ее репликацию и поэтому представляют серьезную угрозу выживанию клетки. Для борьбы с такими повреждениями бактерии имеют целый ряд белков, репарирующих ДНК, нормализующих клеточное деление, повышающих толерантность к повреждениям, которые координированно экспрессируются после повреждения ДНК. Такая глобальная реакция получила название "SOS-ответ" Основная регуляция SOS-ответа у E. coli осуществляется двумя белками – рекомбиназой RecA и транскрипционным репрессором LexA, которые и сами тоже являются SOS-индуцируемыми. Накопление повреждений в ДНК приводит к активации копротеазной активности белка RecA. В активированном состоянии RecA индуцирует автокаталитическое расщепление белка LexA. В результате резко падает концентрация функционально активного димера LexA. освобождаются операторы генов SOS-регулона и резко возрастает их транскрипция. Повреждение ДНК не индуцирует SOS-ответ непосредственно. Предполагается, что однонитевая ДНК, которая накапливается в клетке при ингибировании репликации ДНК повреждениями, дает тот метаболический сигнал, который и активирует копротеазную активность RecA. В активированном состоянии RecA образует спиральные нуклеопротеиновые филаменты на однонитевой ДНК. LexA распознает эту структуру и связывается с глубокой спиральной бороздкой RecA-нуклеофиламента. Это связывание индуцирует быстрое автокаталитическое расщепление белка LexA в области шарнира, соединяющего два домена LexA – карбоксиконцевой димеризационный и аминоконцевой ДНК- связывающий. Таким образом, репрессор LexA ресщепляется автокаталитически, так же как и белки UmuD, MucA и репрессор фага λ CI. А роль белка RecA заключается лишь в активации этой автокаталитической реакции (из-за чего RecA и называют копротеазой). Гены SOS-регулона можно разделить на две группы. "Классические" негативно регулируются на транскрипционном уровне белком LexA и индуцируются в результате его автокаталитического протеолиза, стимулируемого активированным RecA. Эти гены имеют в своей промоторной области четко выраженный LexA сайт (консенсус 5'-taCTGTatatatatACAGta-3'). Наиболее значимыми "классическими" членами SOS-регулона являются следующие гены (их сейчас известно около 30): Гены Продукты/функции lexA Индукция SOS-ответа recA Рекомбинационная репарация; индукция SOS-ответа ruvAB Рекомбинационная репарация recN Рекомбинационная репарация uvrA Эксцизионная репарация (белок, узнающий повреждения в ДНК) uvrB Эксцизионная репарация (эндонуклеаза) uvrD Эксцизионная репарация (хеликаза) umuDC Склонная к ошибкам репарация (SOS-мутагенез) sulA Ингибитор клеточного деления Все больше и больше обнаруживается SOS-индуцируемых генов, которые не регулируются непосредственно LexA. SOS-регулон интересен тем, что всего одна пара регуляторных белков обеспечивает несколько вариантов ответа на повреждение ДНК. Такое поведение частично можно объяснить различной аффинностью репрессора к операторным сайтам, расположенным в промоторных областях соответствующих генов. Чем слабее связывание репрессора с оператором, тем раньше произойдет индукция соответствующего гена при SOS-ответе. Так, UvrA белок, контролирующий эксцизионную репарацию, индуцируется практически немедленно после возникновения повреждений ДНК, и первые 20-30 минут SOS-ответа клетка репарирует повреждения путем вырезания поврежденных нуклеотидов и оснований. Через полчаса в клетке накапливается достаточно RecA (его количество увеличивается более, чем в 10 раз), RuvAB и RecN для активации рекомбинационной репарации, которая продолжается еще около 30 минут. Приблизительно через час после индукции "включается" склонная к ошибкам репарация (контролируемая генами umuDC), которая продолжается еще 30-40 минут. Такая - 84 - временная последовательность событий характерна для клеток E. coli, растущих относительно медленно на синтетической среде с временем удвоения 50 минут. Наиболее важным следствием такой регуляции является то, что такая "ступенчатая" индукция членов SOS-регулона позволяет клеткам с минимальными повреждениями индуцировать системы безошибочной (но достаточно медленной) репарации (такой как эксцизионная и рекомбинационная), не включая другие, потенциально склонные к ошибкам (хотя и быстрые) репарационные пути. И действительно, индукция генов umuDC, необходимых для склонной к ошибкам репарации в обход крупных повреждений, требует гораздо более сильного повреждения ДНК. И, наконец, длительное присутствие в клетке нерепарируемых повреждений приводит к индукции SulA-зависимой филаментации и позволяет профагам "удрать" из гибнущей клетки путем индукции литического цикла. SOS-мутагенез Достаточно давно было замечено, что индукция SOS-ответа приводит к существенному увеличению частоты мутаций. Этот феномен оказался связан с вариантом репарации, который индуцируется при SOS-ответе в последнюю очередь. Идея UmuDC-зависимой репарации заключается в том, что, когда клетка не может (или не успевает) восстановить исходную последовательность ДНК, она пытается продолжить репликацию ДНК, вставляя случайные основания в синтезируемую цепь напротив повреждений. Это позволяет репликационной вилке продолжить работу (и таким образом восстановить жизнеспособность клетки). Это позволяет клетке решить немедленную проблему, однако создает потенциальные проблемы в дальнейшем из-за очень высокой вероятности возникновения мутаций. Для индукции SOS-мутагенеза требуются ферменты реплисомы, белок RecA и белки UmuD и UmuC, причем UmuD должен претерпеть автопротеолитическое расщепление (аналогично LexA) с образованием UmuD', две субъединицы которого образуют комплекс с UmuC (UmuD' 2 UmuC), который вместе с другими компонентами реплисомы и обеспечивает мутагенный синтез ДНК (поэтому комплекс UmuD' 2 UmuC называют еще ДНК-полимеразой V). UmuD' 2 UmuC связывается с концом RecA- нуклеофиламента, затем с ДНК-полимеразой, что позволяет клетке возобновить репликацию ДНК, а возобновление репликации приводит к разрушению нуклеофиламента (и, соответственно, ликвидации SOS-индуцирующего сигнала). Литература: 1. W.H. Koch, R. Woodgate. DNA Repair in Prokaryotes and Lower Eukaryotes. DNA Damage and Repair.vol.1: Edited by: Nickoloff and MF Hoekstra 2. G.C. Walker. The SOS Response of Escherichia coli. The Bible. 1996 p 1400-1416 |