sulA (sfiA) блокирует деление, предотвращая сборку Z-кольца. Использование дрожжевой двухгибридной системы показало прямое взаимодействие SulA с FtsZ. Было также показано, что SulA предотвращает полимеризацию FtsZ in vitro. Поскольку сборка кольца FtsZ - ключ к целому процессу деления, индукция SulA полностью блокирует деление. Как только SOS индукция закончена,
SulA быстро деградируется протеазой Lon, и деление возобновляется.
FtsK также вовлечен в SOS ответ. Одна из предложенных функций этого белка должна гарантировать, что хромосомы не "защемляются" закрывающейся септой. Инактивация только цитоплазматической части FtsK позволяет продолжаться делению клетки, но индуцирует SOS ответ, возможно из-за последующего повреждения ДНК.
10.2. Регуляция клеточного цикла у Caulobacter crescentus.
Бактерия Caulobacter crescentus интересна в плане изучения клеточного цикла потому, что, по крайней мере на первый взгляд, клеточный цикл этой бактерии наиболее близок к эукариотическому: имеются четко выраженные G1, S и G2 периоды ( у прокариот сложно пока говорить о М фазе); более
- 60 - того, в результате деления образуются неравноценные клетки (т.е. наблюдается некоторая дифференцировка) – одна из дочерних клеток имеет жгутик и аппарат хемотаксиса, а другая неподвижна и остается прикрепленной к субстрату
(Рис. 10.7).
В подвижной клетке репликация
ДНК и деление клетки полностью заблокированы (т.е. имеет место четко выраженная G1 фаза клеточного цикла, которой не наблюдается у быстро растущих энтеробактерий).
Через некоторое время бактерия утрачивает свой единственный полярный жгутик (а вместе с ним и аппарат хемотаксиса) и на этом же полюсе клетки формирует стебелек, которым прикрепляется к субстрату.
Такое морфологическое изменение совпадает с инициацией репликации ДНК (началом S фазы). Во время этой фазы прикрепленная к субстрату клетка удлиняется и формирует новый жгутик на полюсе клетки, противоположном стебельку. По завершении репликации ДНК хромосомы перемещаются к полюсам
(фаза G2), за чем следует деление клетки. Таким образом, в каждом цикле деления два типа морфологически и физиологически различных типа клеток сменяют друг друга: подвижная неспособная делиться клетка и неподвижная (прикрепленная) способная к росту и делению. Очевидно, что такая четкая смена поведения клеток должна строго контролироваться, и некоторая информация об этом контроле имеется.
Центральным регулятором клеточного цикла является белок CtrA, принадлежащий к уже хорошо нам знакомому классу регуляторов ответа.
Этот белок контролирует синтез жгутиков, метилирование
ДНК и ее репликацию, деление клетки (Рис. 10.8).
Контроль репликации ДНК осуществляется путем ее метилирования. CtrA активирует транскрипцию гена
ccrM, кодирующего ДНК-метилтрансферазу, жизненно необходимую для роста
C. crescentus. Транскрипция этого гена происходит исключительно в фазе G2 клеточного цикла, а поскольку белок CcrM очень быстро деградируется протеазой Lon, то и присутствует в значимых количествах он только в период своего активного синтеза, т. е. в фазе G2. В результате вновь реплицированные хромосомы находятся в полуметилированном состоянии значительную часть клеточного цикла (фактически всю S фазу). А поскольку для инициации репликации ДНК должна быть в полностью метилированном состоянии, новый раунд репликации ДНК у
C. crescentus, в отличие от
E. coli, не может начаться, пока не завершится предыдущий.
CtrA также обеспечивает временной контроль за экспрессией генов клеточного деления. С одной стороны,
CtrA репрессирует транскрипцию
ftsZ в подвижных клетках, а с другой – активирует транскрипцию
ftsQA оперона в клетках перед самым делением. Таким образом CtrA обеспечивает
Flagellar biogenesis
G1
S
G2
Predivisional cell
St alked cell
Swarmer cell
Motile
Chemot actic
Replication bloc k
Sessile
Replication initiation
Replication
Chromosome segregation
Cell division
Asymmetric
Flagellum
St alk
Flagellum ejection
St alk biogenesis
Development
Cell cycle
Рис.10.7. Клеточный цикл Caulobacter crescentus?
DivJ
DivL
CckA
DivK
?
CtrA
CtrAP
ccrM
fla
Cori ftsZ
ftsQA
+
+
+
ctrA
P
1
P
2
+
ClpXP
CtrA-Box
Рис.10.8. Основные регуляторы клеточного цикла Caulobacter crescentus - 61 - последовательную транскрипцию сначала
ftsZ, а затем
ftsQA. Такая последовательность экспрессии соответствует предполагаемому порядку сборки машины клеточного деления (дивисомы) в центре делящейся клетки.
Но наиболее важным, пожалуй, в плане контроля клеточного цикла, является негативная регуляция при помощи CtrA сильного промотора P
Cori
, расположенного внутри точки начала репликации хромосомы (Cori). Активность этого промотора абсолютно необходима для инициации репликации ДНК. Минимальный Cori содержит 5 CtrA-боксов (сайтов связывания CtrA), два из которых перекрываются с областью P
Cori
. Каким-то образом CtrA блокирует транскрипцию с промотора P
Cori
, а значит, и репликацию хромосомы, во всех клетках за исключением только что сбросивших жгутик и закрепившихся на субстрате (т.е. репрессия не срабатывает как раз в тех клетках, в которых и начинается репликация ДНК).
Возможность использовать всего один регуляторный белок для регуляции совершенно разных функций на протяжении клеточного цикла достигается за счет строгого временного и пространственного контроля активности CtrA. Как и большинство других регуляторов ответа, CtrA активен только в фосфорилированном состоянии. Но в таком состоянии этот белок присутствует только в подвижных клетках и непосредственно перед делением (в G2 фазе). Это достигается путем частично перекрывающихся механизмов, контролирующих CtrA на
уровне экспрессии, стабильности и фосфорилирования.
Транскрипция
ctrA происходит только перед делением, после инициации репликации хромосомы.
Транскрипция происходит с двух промоторов – слабого P
1
, активного только в ранних "предивизионных" клетках и сильного P
2
, включающегося позже. CtrA регулирует оба промотора, причем первый репрессирует, а второй активирует. Таким образом, по мере накопления фосфорилированного CtrA в ранней предивизионной клетке P
1
отключается, а P
2
, наоборот, активируется, что дает высокую концентрацию CtrA к концу S фазы. Такой простой авторегуляторный механизм создает основу для обеспечения нужных концентраций CtrA в соответствующее время. От последовательного изменения концентраций CtrA зависит, в свою очередь, последовательность экспрессии контролируемых этим регулятором генов. Так, аффинность CtrA к жгутиковому промотору
fliQ в 20 раз выше, чем к промотору
ccrM, поэтому
fliQ, так же как и другие зависящие от CtrA жгутиковые промоторы, транскрибируется в ранней предивизионной клетке, а
ccrM активируется значительно позже, когда концентрация CtrA возрастает.
Для того, чтобы "перезапустить таймер" в новом клеточном цикле, достаточно просто вовремя удалить CtrA из клетки. И такое удаление действительно имеет место – CtrA протеолитически деградируется в поздней предивизионной клетке и во время прикрепления подвижной клетки к субстрату. Удаление активного CtrA до того, как клетка вступит в S-фазу, важно не только для авторегуляции CtrA, но и для активации промотора P
Cori и инициации репликации. Деградация CtrA происходит под действием АТФ-зависимой протеазы ClpXP. Причем, в отличие от
E. coli, инактивация этой протеазы у
Caulobacter является летальной – клетка оказывается "арестованной" в фазе G1 клеточного цикла. Однако каким образом "включается" и "выключается" протеолиз – пока неясно.
Активность CtrA регулируется сразу через несколько путей фосфорилирования. Как известно, регуляторы ответа (к числу каковых принадлежит и CtrA) активируются путем фосфорилирования сенсорными гистидинкиназами в ответ на сигналы внешней среды. Вновь синтезированный CtrA немедленно фосфорилируется, и как минимум три гистидинкиназы (DivJ, DivL и CckA) могут участвовать в этом процессе. К сожалению, сигналы, на которые реагируют эти киназы, неизвестны.
Однако известно, что две из этих киназ, DivJ и CckA, локализуются в различных частях клетки, что свидетельствует в пользу участия пространственной информации в контроле активации CtrA. Так,
CckA, типичная мембранная сенсорная киназа, распределена равномерно на протяжении большей части клеточного цикла. Однако в ранней предивизионной клетке CckA концентрируется на полюсе клетки, противоположном стебельку и остается там до момента деления. Полярная локализация абсолютно необходима для проявления киназной активности CckA и фосфорилирования CtrA. DivJ концентрируется на противоположном (стебельковом) полюсе во время перехода от G1 к S фазе. Таким образом, очевидно, что активность CtrA контролируется, по крайней мере частично, различной природой противоположных полюсов клетки. Каждый вновь сформированный при делении полюс клетки сначала "жгутиковый", а затем становится "стебельковым". Полюса фактически "маркируются" в
процессе развития различными киназами, от активности которых, в свою очередь, зависит активность
- 62 -
CtrA.
Литература:
1. Magne Østerås and Urs Jenal. Regulatory circuits in Caulobacter. Current Opinion in Microbiology 2000,
3:171–176 2. Christine Jacobs and Lucy Shapiro. Microbial asymmetric cell division: localization of cell fate determinants.
Current Opinion in Genetics & Development 1998, 8:386–391 (less detail but better text overall)
3. J. Lutkenhaus. The regulation of bacterial cell division: a time and place for it. Current Opinion in
Microbiology 1998, 1:210–215 4. J. A. Hoch. Initiation of bacterial development. Current Opinion in Microbiology 1998, 1:170–174
11. Споруляция у Bacillus subtilis.
Процесс споруляции у B. subtilis проходит через серию четко выраженных морфологических стадий, и его результатом является превращение растущей клетки в двухкамерный спорангий, в котором и формируется спора. Известно более 125 генов, участвующих в этом процессе. Их транскрипция контролируется во времени и пространстве четырьмя ДНК-связывающими белками и пятью сигма факторами, а сигнал для запуска всего процесса поступает от сенсорных систем и путем переноса фосфатной группы по сложной фосфотрансляционной сети оказывается на одном ключевом регуляторе ответа, который и запускает каскадную экспрессию громоздкого аппарата споруляции.
Морфология споруляции
Последовательные морфологические стадии споруляции показаны на рисунке 11.1.
Начало споруляции обнаруживается по формированию т. н. аксиального филамента, в котором две хромосомы после последнего раунда репликации вытягиваются вдоль длинной оси клетки. Затем возле одного из полюсов клетки формируется перегородка (септа), что разделяет развивающийся спорангий на два компартмента, материнскую клетку (больший) и преспору. Каждый из этих компартментов получает по копии хромосомы. На последующих стадиях споруляции преспора обволакивается материнской клеткой и в конце концов оказывается полностью внутри ее (в связи с чем и называется эндоспорой).
На последующих стадиях преспора созревает в результате сложных биосинтетических и морфогенных процессов, протекающих в обоих компартментах. Через 6-8 часов созревание заканчивается, и зрелая спора освобождается путем лизиса материнской клетки.
Последовательность морфологических событий разделяется на стадии, которые обозначаются римскими цифрами 0-VII. Стадия 0 соответствует клеткам, еще не ставшим на путь споруляции, стадия I - начавшим споруляцию и сформировавшим аксиальный филамент, стадии II и III соответствуют спорангиям на стадиях полярного деления и обволакивания преспоры материнской клеткой и т.д.
Похожая схема используется для обозначения генов и оперонов, необходимых для споруляции. Так,
Рис.11.1. Стадии споруляции Bacillus subtilis
- 63 - мутации в генах
spo0 и
spoIII останавливают споруляцию на стадиях 0 и III соответственно. Латинские буквы различают гены одной стадии между собой (напр.,
spo0A и
spo0B). В оперонах дополнительные
латинские буквы используются для того, чтобы различать членов оперонов между собой (напр.,
spoIIAA, spoIIAB и
spoIIAC).
Как принимается решение о начале споруляции? Бактерии достаточно сложно принять решение о начале споруляции, поскольку этот процесс, будучи запущенным, уже необратим. А поскольку это решение коренным образом меняет метаболизм клетки, ошибка может иметь для нее печальные последствия. Поэтому для принятия этого решения бактерия должна проанализировать множество сигналов от внешней среды от внутриклеточных метаболических систем, от клеточного цикла. Сигналы могут происходить от нехватки питательных веществ, плотности популяции, синтеза ДНК, повреждений ДНК, цикла Кребса. Все эти сигналы интегрируются на уровне одного регуляторного белка (Spo0A). Сигналы передаются на Spo0A в виде его фосфорилирования через цепь переносчиков фосфата. Spo0A принадлежит к классу регуляторов ответа из семейства двухкомпонентных регуляторных систем, которые вам уже хорошо знакомы. И той информации, ктотрой вы уже обладаете, наверное, достаточно, чтробы сделать вывод о том, что в данном случае сложно будет обойтись простой двукомпонентной системой. И действительно, основу регуляторной системы споруляции составляет сложная разветвленная фосфотрансляционная сеть. В качестве источника сигнала могут выступать несколько сенсорных белков (гистидинкиназ), сигнал от которых (фосфат) поступает на ключевой регулятор через несколько переносчиков. Такая сложная система создает много точек, в которых можно осуществлять контроль передачи сигнала, что позволяет тесно координировать многие клеточные события. Поэтому практически каждая стадия передачи сигнала по фосфотрансляционной сети в той или иной степени подвержена регуляции.
Фосфат в сигнальную фосфотрансляционную систему поступает от двух сенсорных киназ, цитоплазматической KinA и мембранной KinB, а в качестве получателей этого фосфата выступают два
РО. Первый из них, Spo0F
непосредственнно фосфорилируется киназами, тогда как фосфат на второй
РО, Spo0A, попадает от Spo0F через переносчик Spo0B. Spo0AФ является транскрипционным фактором и выступает в роли репрессора либо активатора по отношению к тем генам, чьи функции являются критическими при переключении клетки с вегетативного роста на споруляцию. Один из таких генов кодирует репрессор AbrB, который предотвращает экспрессию ряда генов, необходимых при переключении на споруляцию. Накопление Spo0AФ в клетке снижает уровень AbrB и активирует ранние гены споруляции. Кроме того, Spo0AФ является непосредственным активатором генов и оперонов, таких как spoIIA и spoIIG, кодирующих сигма факторы
σ
F
и
σ
Е
, ответственные за локальную экспрессию генов споруляции соответственно в преспоре и материнской клетке.
Первый уровень контроля осуществляется, естественно, на уровне киназ. К сожалению, эффекторные молекулы, активирующие эти киназы, пока не известны, однако описан ингибитор киназной активности белка KinA.
Активность этого ингибитора, KipI, контролируется анти- ингибитором KipA, ген которого находится в одном опероне с kipI.
Рис.11.1. Контроль инициации споруляции у Bacillus subtilis - 64 -
Этот оперон реагирует на доступность глюкозы и фиксированного азота, что позволяет запускать процесс споруляции при голодании по этим компонентам питания.
Следующий уровень контроля осуществляют аспартил-фосфат фосфатазы, которые удаляют фосфат с молекул РО фосфотрансляционной цепи. Первой была обнаружена фосфатаза Spo0E, действующая непосредственно на Spo0AФ. К сожалению, до сих пор очень мало информации о том, как регулируется активность или синтез самой Spo0E. Несколько больше известно о фосфатазах, действующих на более ранних этапах сигнального пути. Фосфатазы RapA и RapB действуют на
Spo0FФ. А поскольку все реакции по пути от Spo0FФ к Spo0AФ являются обратимыми, дефосфорилирование Spo0F ведет к быстрому дефосфорилированию и Spo0A.
RapA и RapB регулируются на
уровне транскрипции физиологическими процессами, которые составляют альтернативу споруляции. RapA находится под контролем сигнальной системы
ComP/ComA, ответственной за индукцию состояния компетентности к поглощению ДНК
(физиологическое состояние, несовместимое со споруляцией). А RapB индуцируется условиями, способствующими вегетативному росту клетки, что позволяет при инициации деления или других клеточных процессов, несовместимых со споруляцией, предотвращать это переключение метаболизма путем специфического дефосфорилирования одного компонента фосфотрансляционной цепи.
Еще одна ступень контроля – регуляция регуляторов Spo0A (который тоже является регулятором).
Здесь одним из регуляторов является система контроля плотности бактериальной популяции, зависящая от пептидного феромона – продукта гена
phrA. Ген этот находится в одном опероне с RapA, а его продуктом является небольшой (всего из 44 АК) белок. На амино-конце белка располагается типичная сигнальная последовательность, и белок действительно секретируется из клетки по SecA-зависимому пути. После отрезания сигнального пептида от белка остается всего 19 АК. Оказалось, что этот пептид, а точнее, только пять карбокси-концевых АК, ингибирует фосфатазную активность RapA. Для этого ингибирования необходима активная система транспорта олигопептидов в клетку Opp, компоненты которой и отрезают необходимые 5 АК с карбокси-конца 19АК пептида и транспортируют их в клетку.
Такая достаточно громоздкая система может выполнять несколько функций. Во-первых, синтез, секреция и реимпорт PhrA пептида требует времени, поэтому эта система задерживает споруляцию, когда все для нее уже готово. Во-вторых, вся эта система очень напоминает способ межклеточных коммуникаций при помощи низкомолекулярных молекул-феромонов. Поэтому еще одной возможной функцией PhrA может быть детекция плотности бактериальной популяции, во всяком случае, при высокой плотности задержка будет явно меньше.
Роль активаторов транскрипции на разных стадиях споруляции Будучи активированным путем фосфорилирования, Spo0A индуцирует транскрипцию как минимум семи генов, управляющих вступлением бактерии на путь споруляции и превращением вегетативной клетки в двухкомпатрментный спорангий. Spo0AP
активирует транскрипцию, связываясь с промоторами соответствующих генов и оперонов, контактируя с РНK-полимеразой, имеющей в своем составе основной сигма фактор
σ
A
или альтернативный
σ
H
σ
H
обеспечивает транскрипцию неизвестного пока гена (или генов), контролирующего полярное деление.
После разделения клетки на две части в каждом из образовавшихся компартментов происходит активация компартмент- специфического сигма-фактора -
σ
F
в преспоре и
σ
E
в материнской клетке.
σ
F
синтезируется задолго до полярного деления, и то, что его активность проявляется только в преспоровом компартменте, определяется регуляцией на
Скачать 2.61 Mb.